昭通牛mtDNA D-loop 區(qū)遺傳多樣性分析*

朱群媱，丁利民，容 斌，鄧琦煒，胡 瑀，范新陽，苗永旺**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.昭通市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，云南 昭通 657000；3.昭通市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜禽研究所，云南 昭通 657000)

牛屬于脊椎動(dòng)物亞門(Vertebrata)哺乳綱(Mammalia)偶蹄目(Artiodactyla)反芻亞目(Ruminar)洞角科(Covicornia)牛亞科(Bovedae)牛屬(Bos)，可分為普通牛(B.taurus)和瘤牛(B.indicus) 2個(gè)類型。近年對(duì)世界范圍內(nèi)牛種線粒體DNA 控制區(qū)(mitochondrial DNA control region，mtDNA D-loop)序列的研究表明：普通牛和瘤牛各自起源于獨(dú)立的馴化事件[1-2]。普通牛的馴化中心位于近東地區(qū)，歐洲、非洲和東北亞地區(qū)也可能存在普通牛的馴化事件；瘤牛則可能起源于印度河流域[3-4]。在普通牛中主要存在5 個(gè)mtDNA 世系(T和T1～T4)，且這些世系存在明顯的地理區(qū)域分布，近東和歐洲地區(qū)以T、T2 和 T3 世系為主，非洲地區(qū)以T1 世系為主，而T4 世系為東北亞所特有；在瘤牛中存在2 個(gè)mtDNA 世系(I1 和I2)，常見于印度次大陸，且以I1 世系為主[1-3]。對(duì)中國(guó)家牛的mtDNA 世系研究表明：中國(guó)家牛普遍存在普通牛和瘤牛2 個(gè)血統(tǒng)[2,5]，且普通牛血統(tǒng)構(gòu)成主要包含T1～T4 mtDNA 世系，瘤牛血統(tǒng)則包含I1 和I2 mtDNA 世系。

昭通牛因產(chǎn)于云南省昭通市而得名，在全市各縣(區(qū))均有分布。昭通市位于云南省東北部，地處云、貴、川三省結(jié)合部的烏蒙山腹地，群山林立，水資源和飼料資源豐富，為昭通牛遺傳資源的形成和養(yǎng)殖提供了良好條件[6-7]。昭通牛屬役肉兼用型牛種，體型中等，體質(zhì)結(jié)實(shí)，結(jié)構(gòu)勻稱，短寬平直，被毛以黃色為主；對(duì)當(dāng)?shù)刈匀簧鷳B(tài)條件有良好的適應(yīng)性，具有耐粗飼、抗逆性和抗病力強(qiáng)等優(yōu)良種質(zhì)特性[6]。昭通牛于1980 年全國(guó)畜禽品種資源調(diào)查時(shí)定名，屬云南省地方優(yōu)良品種，于1987 年列入《云南省家畜家禽品種志》，2011 年列入《中國(guó)畜禽遺傳資源志·牛志》。

畜禽的遺傳多樣性不僅可以描述群體的遺傳背景信息，為其保種和選育提供參考，還對(duì)群體的親緣關(guān)系、起源分化和基因滲入等研究具有重要意義[1]。近年來，多個(gè)遺傳標(biāo)記被用于遺傳多樣性的研究中，其中mtDNA D-loop 序列主要用于畜禽母系遺傳研究。mtDNA 具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、不重組和高突變等特征，在哺乳動(dòng)物中遵循嚴(yán)格的母系遺傳，是物種鑒定和祖先母系起源研究的最佳遺傳標(biāo)記。mtDNA D-loop 區(qū)是線粒體基因組中突變率最高的區(qū)域，因此被廣泛用于畜禽遺傳多樣性研究[8]。2000 年前，引入外來商業(yè)化牛品種進(jìn)行的雜交改良對(duì)昭通牛的影響較大，導(dǎo)致其血統(tǒng)混雜，純種牛數(shù)量急劇減少[6-7]。雖然已有研究對(duì)昭通牛的遺傳多樣性進(jìn)行了報(bào)道[9-11]，但都是幾年甚至10 年前的研究，且當(dāng)時(shí)研究的樣品數(shù)量有限，不能準(zhǔn)確反映當(dāng)前該牛的群體遺傳結(jié)構(gòu)狀況?？紤]到當(dāng)前昭通牛保種與選育利用的迫切需要，本研究利用mtDNA D-loop 區(qū)序列為遺傳標(biāo)記，采用PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)對(duì)當(dāng)前該牛的群體變異進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步結(jié)合已發(fā)表的云南本地其他牛的mtDNA 數(shù)據(jù)進(jìn)行深入的群體遺傳學(xué)分析，試圖從母系遺傳的角度闡明昭通牛的群體遺傳結(jié)構(gòu)、血統(tǒng)構(gòu)成和起源分化，為該牛的保種和選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

在云南省昭通市昭陽區(qū)舊圃鎮(zhèn)和彝良縣洛澤河鎮(zhèn)采集了98 份昭通牛耳組織樣品(45 頭母牛和53 頭公牛)，置于裝有500 μL 95%酒精的1.5 mL 離心管中帶回實(shí)驗(yàn)室，—20 ℃保存，用于基因組DNA 的提取。樣品的采集由當(dāng)?shù)匦竽敛块T的專家負(fù)責(zé)純種牛的鑒定，要求具備典型的品種特征、無直接血緣關(guān)系且在分布上具有代表性。為了更好地評(píng)價(jià)昭通牛的遺傳多樣性特征并弄清其與云南其他地方牛種的遺傳差異，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了189條云南地方牛的mtDNA D-loop 區(qū)序列(GenBank登錄號(hào)：MF410466～MF410654)，其中包括53 頭文山牛、34 頭德宏高峰牛、49 頭迪慶牛和53 頭滇中牛，用于與本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

1.2 基因組DNA 的提取

采用酚—氯仿法提取基因組DNA，并用TE 液溶解，再用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA原液的完整性，用Nano Drop 2000 紫外可見分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)檢測(cè)其質(zhì)量濃度和OD 值，并稀釋成質(zhì)量濃度為100 ng/μL 的DNA 工作液備用。

1.3 目的片段擴(kuò)增及序列測(cè)定

所用引物為L(zhǎng)OFTUS 等[12]公布的特異性引物擴(kuò)增D-loop 全序列片段(Cattle-F_L15757：5 ′ -CTGCAGTCTCACCATCAACC-3 ′，Cattle-R_H496：5 ′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′)，目的片段擴(kuò)增及測(cè)序所需引物相同。PCR 反應(yīng)體系為20.0 μL，包括10×buffer (Mg2+15 mmol/mL) 2.0 μL，dNTP 1.6 μL，10 μmol/μL 上、下游引物各0.4 μL，5 U/μL rTaqDNA 聚合酶0.1 μL 和100 ng/μL 的 DNA 工作液模板2.0 μL，加ddH2O 補(bǔ)足體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min→34 個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s→60 ℃退火40 s→72 ℃延伸40 s)→72 ℃后延伸5 min。PCR 產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向直接測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Lasergene 軟件包(DNA Star Inc.，USA)[13]中的SeqMan 程序?qū)φ淹ㄅtDNA D-loop 序列進(jìn)行人工校正和輸出；采用ClustalX 軟件[14]進(jìn)行序列比對(duì)，采用BioEdit 軟件[15]調(diào)整和編輯比對(duì)好的序列；采用MEGA6 軟件[16]對(duì)序列進(jìn)行單倍型輸出和堿基組成分析，計(jì)算群體內(nèi)遺傳距離和群體內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)等；群體間遺傳距離采用最大似然法基于T92+G 模型進(jìn)行估算，采用Bootstrap 法(5 000 次)估算穩(wěn)健的標(biāo)準(zhǔn)誤差，然后采用鄰接法根據(jù)群體間遺傳距離構(gòu)建群體間遺傳關(guān)系樹，并利用在線軟件iTOL (https://itol.embl.de/#)對(duì)其進(jìn)行美化；利用DNASP 6 軟件[17]計(jì)算群體遺傳多樣性參數(shù)(單倍型數(shù)、單倍型多樣度和核苷酸多樣度)，估算群體間的遺傳分化指數(shù)(genetic differentiation index，F(xiàn)st值)，根據(jù)公式Nm=(1/Fst—1)/4[18]計(jì)算基因流(gene flow，Nm值)；采用Network 10 軟件(https://www.fluxus～engineering.com/)的中接法構(gòu)建昭通牛群體各單倍型遺傳關(guān)系的中介網(wǎng)絡(luò)圖，其中賦予轉(zhuǎn)換和插入/缺失的權(quán)重分別為10 和15；采用MEGA6 軟件[16]構(gòu)建昭通牛群體單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異

昭通牛mtDNA D-loop 區(qū)的突變位點(diǎn)及定義的單倍型如圖1 所示。98 頭昭通牛的mtDNA Dloop 區(qū)序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)915 bp，去掉兩端測(cè)序質(zhì)量較差的序列后，用于分析的序列長(zhǎng)度為898 bp。序列中A、T、C 和G 堿基的平均含量分別為33.30%、29.00%、23.90%和13.80%，序列A+T 平均含量為62.30%，共檢測(cè)到73 個(gè)核苷酸替換位點(diǎn)和3 個(gè)插入/缺失，核苷酸替換位點(diǎn)約占檢測(cè)核苷酸位點(diǎn)總數(shù)的8.13%，核苷酸替換主要為轉(zhuǎn)換。在發(fā)現(xiàn)的73 個(gè)突變位點(diǎn)中，包含18 個(gè)單一信息位點(diǎn)和55 個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)?；诎l(fā)現(xiàn)的核苷酸替換位點(diǎn)及插入/缺失信息，在昭通牛群體中共確定36 種單倍型，單倍型H02 和H22 在群體中所占比例較高，其頻率分別為29.59%和11.22%。昭通牛群體的單倍型多樣度為0.880±0.027，核苷酸多樣度為0.024 43±0.000 94，群體內(nèi)遺傳距離為0.026±0.004，群體內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)為0.027±0.004。

圖1 昭通牛mtDNA D-loop 區(qū)的突變位點(diǎn)及定義的單倍型Fig.1 Mutation sites and defined haplotypes based in mtDNA D-loop sequences of Zhaotong cattle

2.2 群體遺傳多樣性

云南5 個(gè)本地牛群體共287 條mtDNA D-loop區(qū)序列中A、T、C 和G 堿基的平均含量分別為33.40%、28.80%、24.00%和13.80%，A+T 和C+G的平均含量為62.20%和37.80%，共發(fā)現(xiàn)93 個(gè)變異位點(diǎn)，其中單一信息位點(diǎn)24 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)69 個(gè)，共確定86 個(gè)單倍型；單倍型多樣度為0.882±0.017，核苷酸多樣度為0.024 82±0.000 30，群體內(nèi)遺傳距離為0.027±0.004，群體內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)為0.027±0.005 (表1)。

2.3 群體間遺傳距離和遺傳分化指數(shù)

由表2 可知：昭通牛與迪慶牛間的遺傳距離最小(0.024)，與德宏高峰牛間的遺傳距離最大(0.031)。根據(jù)群體間遺傳距離數(shù)據(jù)構(gòu)建的遺傳關(guān)系樹(圖2)可知：昭通牛與迪慶牛聚為一大支，德宏高峰牛與文山牛、滇中牛聚為另一支。

表2 云南地方牛群體間遺傳距離Tab.2 Genetic distances between local cattle in Yunnan

圖2 基于群體間遺傳距離構(gòu)建的聚類樹Fig.2 Cluster tree based on the genetic distances between populations

由表3 可知：各群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst值)在—0.015 34～0.671 32 之間，昭通牛與其他地方牛群體間的Fst值在0.023 32～0.552 10 之間，其中，與迪慶牛的Fst值最小，與德宏高峰牛的Fst值最大；昭通牛與其他地方牛群體間的基因流(Nm值)在0.20～10.47 之間。

表3 云南地方牛群體間遺傳分化指數(shù)和基因流Tab.3 Genetic differentiation index and gene flow among of local cattle in Yunnan

2.4 世系組成

按照近年對(duì)普通牛和瘤牛mtDNA 世系劃分的標(biāo)準(zhǔn)[2-3]，云南5 個(gè)本地牛的mtDNA 世系劃分結(jié)果(表4)顯示：昭通牛存在普通牛和瘤牛2 個(gè)mtDNA 世系。就瘤牛世系而言，昭通牛在目前已發(fā)現(xiàn)的2 個(gè)瘤牛mtDNA 世系中都有分布，其中I1 世系占37.76%，I2 世系占1.02%；就普通牛世系而言，昭通牛群體中只含有T2、T3 和T4世系，分別占5.10%、43.88%和12.24%。

表4 云南本地牛群體的mtDNA 世系及占比Tab.4 mtDNA lineages and proportions of the Yunnan native cattle

2.5 單倍型遺傳關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹與中介網(wǎng)絡(luò)圖

由圖3a 可知：36 個(gè)單倍型中，H01～H09 屬于瘤牛血統(tǒng)，其中H01～H07 和H09 屬于瘤牛血統(tǒng)的I1 世系，H08 屬于瘤牛血統(tǒng)的I2 世系；H10～H36 屬于普通牛血統(tǒng)，其中H11 和H12 屬于普通牛血統(tǒng)的T2 世系，H10、H13～ H24、H27～H30 和H34～H36 屬于普通牛血統(tǒng)的T3 世系，H25、H26和H31～H33 屬于普通牛的T4 世系。昭通牛的群體遺傳構(gòu)成是普通牛和瘤牛mtDNA 世系的混合組成，普通牛和瘤牛世系的占比分別為61.22%和38.78%。中介網(wǎng)絡(luò)圖(圖3b)分析表明：普通牛mtDNA 單倍型世系與瘤牛mtDNA 單倍型世系間差異較大，兩者間存在至少25 個(gè)突變位點(diǎn)。

圖3 昭通牛群體單倍型遺傳關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹(a)和中介網(wǎng)絡(luò)圖(b)Fig.3 Phylogenetic tree (a) and mediation network diagram (b) of genetic relationships among haplotypes in Zhaotong cattle

3 討論

中國(guó)多個(gè)地方黃牛群體的mtDNA D-loop 區(qū)遺傳多樣性研究表明：中國(guó)地方黃牛群體具有豐富的遺傳多樣性[2,11,19]。本研究對(duì)98 頭昭通牛mtDNA D-loop 區(qū)序列進(jìn)行測(cè)定，共發(fā)現(xiàn)73 個(gè)突變位點(diǎn)，定義了36 種單倍型，單倍型多樣度為0.880±0.027，核苷酸多樣度為0.024 43±0.000 94，群體內(nèi)遺傳距離為0.026±0.004，群體內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)為0.027±0.004。其中，單倍型多樣度和核苷酸多樣度是衡量群體遺傳變異的重要指標(biāo)[19]，它們的值越大，說明群體的遺傳多樣性越豐富。核苷酸多樣度不受樣本量和序列長(zhǎng)度的影響，因此是衡量群體遺傳多樣性水平的首要指標(biāo)。對(duì)中國(guó)57 個(gè)地方牛群體的mtDNA D-loop 序列進(jìn)行變異分析發(fā)現(xiàn)：所有序列的單倍型多樣度為0.904±0.008，核苷酸多樣度為0.025 7±0.000 1；其中，26個(gè)牛種的單倍型多樣度低于昭通牛(0.880)，36個(gè)牛種的核苷酸多樣度低于昭通牛[2]。LEI 等[5]對(duì)33 個(gè)中國(guó)地方黃牛群體的研究表明：中國(guó)黃牛的mtDNA D-loop區(qū)序列的單倍型多樣度為0.914 8±0.013 1，核苷酸多樣度為0.025 8±0.012 6；其中19個(gè)黃牛群體的核苷酸多樣度小于昭通牛。XIA 等[20]對(duì)廣西3 個(gè)本地牛品種的mtDNA D-loop 序列進(jìn)行測(cè)定及分析發(fā)現(xiàn)：隆林牛、南丹牛和潿洲牛的單倍型多樣度分別為0.957±0.030、0.876±0.063和0.949±0.037，核苷酸多樣性分別為0.004 09±0.001 63、0.006 40±0.001 43 和0.000 24±0.000 03，3 個(gè)牛種的核苷酸多樣度都低于昭通牛。昭通牛與本研究對(duì)比的云南其他4 個(gè)地方牛群體相比，核苷酸多樣度最高。以上結(jié)果表明昭通牛群體的群體遺傳多樣性在中國(guó)地方牛中處于相對(duì)較高的水平。

遺傳距離可以衡量群體間的遺傳關(guān)系和遺傳差異[21]。本研究表明：昭通牛與迪慶牛間的遺傳距離最小(0.024)，與德宏高峰牛間的遺傳距離最大(0.031)，表明昭通牛與迪慶牛間的遺傳關(guān)系最近，而與德宏高峰牛間的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異較大。遺傳分化指數(shù)(Fst值)是估測(cè)種群間和種群內(nèi)遺傳相似性的指數(shù)，以亞種群間的遺傳分化占總的遺傳多樣性的比例來表示[22]，是群體間遺傳分化的度量值?；蛄?Nm值)是群體間的基因流動(dòng)，是影響群體內(nèi)和群體間遺傳變異程度的重要因素[18]。本研究顯示：昭通牛與迪慶牛間遺傳分化最小，F(xiàn)st值為0.023 32，Nm值為10.47；與德宏高峰牛間遺傳分化最大，F(xiàn)st值為0.552 10，Nm值為0.20。以上結(jié)果表明昭通牛與迪慶牛間的遺傳分化最小，而與德宏高峰牛間的遺傳分化最大。

本研究表明：昭通牛存在普通牛和瘤牛2 個(gè)母系世系，普通牛血統(tǒng)占61.22%，瘤牛血統(tǒng)占38.78%。在遺傳組成上，昭通牛與云南其他4 個(gè)牛種存在一定的差異。迪慶牛、昭通牛、文山牛和滇中牛的普通牛mtDNA 世系占比分別為73.47%、61.22%、35.85%和35.85%，其瘤牛mtDNA 世系占比分別為26.53%、38.78%、64.15%和64.15%；而德宏高峰牛的血統(tǒng)構(gòu)成有別于這4 個(gè)牛種，僅存在瘤牛血統(tǒng)，占比為100.00%。形成這種遺傳組成地理格局的原因可能與普通牛和瘤牛2 種血緣世系在中國(guó)的擴(kuò)散路線及其相遇混合的程度有較大關(guān)系。中國(guó)云南省的西部和南部與南亞瘤牛的主要擴(kuò)散地緬甸、老撾和越南等東南亞國(guó)家接壤，這一地區(qū)的牛種受瘤牛血統(tǒng)的影響較大。就本研究中的5 個(gè)牛種而言，德宏高峰牛、文山牛和滇中牛的瘤牛mtDNA 世系占比較高，其分布地與東南亞地區(qū)相鄰或較近，特別是德宏高峰牛，其分布地與緬甸相鄰，離印度(瘤牛分布地)較近，其瘤牛血統(tǒng)占比最高(100.00%)；而分布于云南省北部的迪慶牛和東北部的昭通牛，其普通牛mtDNA 世系占比較高，它們的分布地距離東南亞地區(qū)相對(duì)較遠(yuǎn)，與四川和貴州相鄰，推測(cè)它們受中國(guó)內(nèi)地牛種普通牛血統(tǒng)的影響更大。本研究發(fā)現(xiàn)：昭通牛的普通牛T2 世系占5.10%，T3 世系占43.88%，T4 世系占12.24%；瘤牛I1 世系占37.76%，I2 占1.02%。推測(cè)昭通牛中的普通牛T2、T3 和T4 世系可能是在中原文化向云南的傳播過程中由中國(guó)北方牛種混入，這些普通牛mtDNA 世系最初起源于近東、歐洲和東北亞地區(qū)，而昭通牛中的瘤牛I1 和 I2 世系則來自由東南亞地區(qū)傳入的南亞瘤牛血統(tǒng)。在一系列的文化傳播與交流中，來自2 個(gè)方向的普通牛血統(tǒng)和瘤牛血統(tǒng)在當(dāng)?shù)貐R合，經(jīng)過長(zhǎng)期的人工選育和風(fēng)土馴化，逐漸形成了現(xiàn)在的昭通牛。

周艷等[10]和JIA 等[1]分別對(duì)7 頭和21 頭昭通牛mtDNA D-loop 區(qū)序列進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示：序列的單倍型多樣度為0.952±0.096，核苷酸多樣度為0.025 04；普通牛和瘤牛血統(tǒng)分別占71.43%和28.57%。LI 等[11]對(duì)云南地方牛mtDNA 多樣性及系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果顯示：昭通牛群體的單倍型多樣度為0.974，核苷酸多樣度為0.025 47；普通牛血統(tǒng)和瘤牛血統(tǒng)分別占60.9%和39.1%。與以上結(jié)果相比，本研究揭示目前的昭通牛群體遺傳多樣性水平有所下降，群體中普通牛和瘤牛mtDNA 世系占比有一定變化，普通牛血統(tǒng)比例下降，瘤牛血統(tǒng)比例上升，說明該牛種近年可能存在更多瘤牛血統(tǒng)的基因滲入。昭通牛與瘤牛血統(tǒng)占比較高的云南文山牛、滇中牛群體間基因流較大，該牛近年是否與這2 個(gè)牛種或云南其他牛種有過基因交流，導(dǎo)致其瘤牛血統(tǒng)比例上升，有必要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

昭通牛群體遺傳多樣性豐富，存在普通牛和瘤牛2 個(gè)母系起源，其血統(tǒng)占比分別為61.22%和38.78%，血統(tǒng)構(gòu)成有別于云南其他地方牛種。本研究推測(cè)昭通牛群體中的普通牛T2、T3 和T4 世系可能是在中原文化的傳播過程中由中國(guó)北方牛種中的普通牛世系混入所致；而瘤牛I1 和I2 世系則來自東南亞地區(qū)傳入的瘤牛血統(tǒng)?，F(xiàn)今的昭通牛與10 年前的昭通牛在血統(tǒng)構(gòu)成上有較大差異，推測(cè)近年可能存在一定瘤牛血統(tǒng)的基因滲入。