外源褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿生長狀況和質(zhì)膜透性的影響*

李慶璽，劉 莉，尹亞敏，尹 俊，李啟嬌，鄭立文，崔東毅，馬向麗**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學 水利學院，云南 昆明 650201；3.云南省草原監(jiān)督管理站，云南 昆明 650202；4.迪慶州畜牧獸醫(yī)科學研究院，云南 迪慶 674499)

紫花苜蓿(Medicago sativaL.)是世界上栽培歷史最悠久、利用價值最高、種植面積最廣的優(yōu)質(zhì)牧草[1]，享有“牧草之王”的美譽。近年來，隨著中國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，對優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿的需求逐漸增大，其種植面積不斷擴展，但仍集中在北方地區(qū)，南方的栽培面積相對較小。究其原因是紫花苜蓿對土壤酸性十分敏感[2]，而南方15 個省、區(qū)、市遍布面積較廣的酸化土壤，總面積達2.03×106hm2[3]，約占中國總耕地面積的21%[4-5]，不適宜種植紫花苜蓿[6]。

鋁是自然界含量最高的金屬元素，在酸性土壤中會大量溶解[7]。近年來，由于大量施用農(nóng)業(yè)化肥以及受酸雨影響，大部分地區(qū)土壤酸化嚴重，導(dǎo)致土壤中的鋁含量上升[8]。鋁離子在微摩爾濃度級水平下就可對植物產(chǎn)生毒害作用，且在pH 5.0 及以下時毒害作用更強[9]。根系是遭受鋁毒害最嚴重的器官[8]。湯霞等[10]對鋁脅迫下燕麥種子幼苗的萌發(fā)及生長研究發(fā)現(xiàn)：當鋁濃度超過燕麥幼苗根尖適應(yīng)性閾值時，根尖鋁含量會隨著鋁濃度的升高而升高。植物遭受鋁毒害的主要表現(xiàn)為植物根尖膨大，根系活力降低[11]，植物生長發(fā)育受到抑制。植物處于鋁脅迫時，細胞質(zhì)膜選擇透性功能損壞，膜透性增大，細胞內(nèi)的部分電解質(zhì)外滲[12]。陳志剛等[13]發(fā)現(xiàn)：鋁處理下的黑麥草質(zhì)膜透性明顯增大，相對電導(dǎo)率升高，且與鋁濃度呈劑量效應(yīng)。黃巧云等[14]研究表明：鋁離子不僅會抑制小麥根系對其他營養(yǎng)元素的吸收，導(dǎo)致植物缺素癥，而且會使根系分泌物收集液的電導(dǎo)率上升，特別是電解質(zhì)外滲百分率增加。有研究證實：當處于鋁脅迫時，植物體內(nèi)的MDA 含量顯著增加，且隨著鋁濃度的升高MDA 含量也逐漸增加[9]。周小華等[15]研究發(fā)現(xiàn)：鋁脅迫下水稻幼苗根尖氧化損傷程度隨鋁濃度的增加而上升，此時MDA 含量及抗氧化系統(tǒng)活性顯著提升，以抵抗氧化脅迫。已有研究表明：鋁脅迫會抑制紫花苜蓿的生長發(fā)育[16-17]。

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)是一種天然吲哚類化合物，普遍存在于植物體內(nèi)[18]。研究發(fā)現(xiàn)：褪黑素不僅可以作為植物生長調(diào)節(jié)物促進植物生長發(fā)育，還可以作為植物激素增強植物的逆境耐受能力[19]。褪黑素還可以作為高效的抗氧化劑，通過調(diào)節(jié)抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán)清除過多活性氧，降低MDA 積累，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成能力，保持滲透平衡和細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性[20]。近年來，褪黑素在植物逆境脅迫中的作用研究越來越多。已有研究表明：外源褪黑素能夠有效減緩干旱脅迫對植株造成的負面影響[20]；可有效增強馬鈴薯幼苗的抗氧化防御系統(tǒng)活性[21]，顯著提高棉花根系伸長量[22]，促進蘿卜生長[23]；還能夠調(diào)節(jié)植物的光周期，降低水分脅迫下冬小麥的MDA 含量，阻止因水分虧缺造成的細胞膜損傷[24]；在干旱脅迫下保護小麥的光合系統(tǒng)免遭氧化損傷[25]。此外，褪黑素在植物耐鋁性中的作用也逐漸引起關(guān)注。徐道坤[26]研究發(fā)現(xiàn)：褪黑素可以通過調(diào)控NO 含量和細胞壁成分來緩解鋁對擬南芥根伸長的抑制作用；呂婷[27]研究發(fā)現(xiàn)：褪黑素可以緩解鋁脅迫對小麥根系的毒害作用。在對小麥抗鋁毒的研究中發(fā)現(xiàn)，褪黑素可通過增強抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)來消除活性氧，從而達到減輕植物遭受鋁毒害的目的[28]。

可見，土壤酸鋁毒害嚴重制約著紫花苜蓿的生長，而褪黑素在植物逆境響應(yīng)中的作用已有研究報道，但主要集中在干旱、溫度、鹽和水分等方面，在鋁毒脅迫中的研究較少，褪黑素在紫花苜蓿鋁毒逆境下的調(diào)控機制尚不清楚。本研究以2 份耐鋁性具有明顯差異的紫花苜蓿為材料，通過外源褪黑素處理，研究鋁脅迫下供試紫花苜蓿幼苗根系伸長率、根尖鋁含量和質(zhì)膜透性的變化，以期揭示褪黑素在緩解紫花苜蓿鋁毒中的作用及其生理機制，為紫花苜蓿在西南地區(qū)的種植和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為課題組前期篩選的對鋁毒耐性有顯著差異的2 份紫花苜蓿材料：耐受型材料WL525HQ 和敏感型材料三得利。供試苜蓿種子購自云南綠盛美地園林景觀有限公司。

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1試驗設(shè)計

紫花苜蓿種子經(jīng)1.5%硫酸銅浸泡消毒20 min后，用磁力攪拌器清洗種子包衣，再用蒸餾水把包衣沖洗干凈，用適量去離子水浸泡過夜。消毒完成后播種在鋪有1 層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿播種100 粒，置于人工智能溫箱中，于25 ℃黑暗條件下催芽12 h，之后便轉(zhuǎn)為正常光照培養(yǎng)(白天12 h、25 ℃，夜晚12 h、22 ℃，相對濕度為70%)，每天用1/5 Hoagland 營養(yǎng)液使種子保持濕潤，待根長至1 cm 后(約2 d)用于后續(xù)試驗。先分別用含0、5、10、20、50 和100 μmol/L 褪黑素的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)預(yù)處理紫花苜蓿幼苗12 h，再用含0.5 mmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)繼續(xù)處理24 h，設(shè)置為6 個處理組，并以不含褪黑素和AlCl3的處理為對照組(CK)。每處理重復(fù)3 次。

1.2.2測定指標及方法

生物量參照付靖雯[29]的方法測定，按每皿計；相對根系伸長率參照李文靜[30]的方法測定；根尖鋁含量參照GB 5009.268-2016[31]測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[32]測定；相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法[33]測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2019 和SPSS 23.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及作圖，并進行單因素和雙因素方差分析。

1.3.2紫花苜蓿的耐鋁性綜合評價

采用模糊綜合評判方法中的隸屬函數(shù)公式對試驗原始數(shù)據(jù)進行定量轉(zhuǎn)換，以綜合評價不同濃度褪黑素對提高紫花苜蓿耐鋁程度的影響，其中，與耐鋁性呈正相關(guān)的指標用公式(1)計算，與之呈負相關(guān)的指標用公式(2)計算；隸屬函數(shù)的平均值越大，耐鋁性越強。

式中：Xi為指標測定值，Xmin和Xmax分別為全部參試材料某一指標的最小值和最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿生物量的影響

由圖1 可知：與對照相比，單獨鋁脅迫下2 份紫花苜蓿材料的地上部和地下部干質(zhì)量均顯著降低，其中，WL525HQ 的地上部和地下部干質(zhì)量分別降低了22%和36%，三得利的地上部和地下部干質(zhì)量分別降低了66%和65%。隨著褪黑素濃度的升高，供試材料地上部和地下部干質(zhì)量呈先升高后降低的變化趨勢。與單獨鋁脅迫相比，5 μmol/L 褪黑素處理下，WL525HQ 的地上部和地下部干質(zhì)量分別顯著升高3%和17%，三得利的地上部和地下部干質(zhì)量分別顯著升高2%和14%。20 μmol/L 褪黑素處理下，2 份材料的地上部和地下部干質(zhì)量均顯著高于其他褪黑素處理，其中，WL525HQ 較單獨鋁脅迫處理分別增加14%和47%，三得利較單獨鋁脅迫處理分別增加33%和54%。

圖1 不同濃度褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿地上部和地下部干質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of different melatonin concentrations on the dry weight of aboveground and underground of alfalfa under aluminum stress

2.2 褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿相對根系伸長率的影響

由圖2 可知：隨著褪黑素濃度的升高，鋁脅迫下2 份材料的相對根系伸長率呈先增加后降低的趨勢，且三得利的根系相對伸長率低于WL-525HQ。與對照相比，單獨鋁脅迫下WL525HQ和三得利的相對根系伸長率分別顯著降低64%和68%。與單獨鋁脅迫相比，5 μmol/L 褪黑素處理下，WL525HQ 和三得利的相對根系伸長率分別顯著增加36%和37%；20 μmol/L 褪黑素處理下，WL525HQ 和三得利的相對根系伸長率分別顯著增加55%和59%，且顯著高于其他褪黑素處理，但10 和100 μmol/L 褪黑素處理下，2 份材料的相對根系伸長率無顯著差異。

圖2 不同濃度褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿相對根系伸長率的影響Fig.2 Effects of different melatonin concentrations on the relative root elongation of alfalfa under aluminum stress

2.3 褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿根尖鋁含量的影響

由圖3 可知：對照處理中，WL525HQ 和三得利的根尖鋁含量分別為12.67 和26.60 g/kg；單獨鋁脅迫下，兩者的根尖鋁含量分別顯著升高69%和57%，分別為41.23 和54.27 g/kg；外源褪黑素預(yù)處理下，2 份材料根尖鋁含量均下降，且隨著褪黑素濃度的升高呈先下降后升高的趨勢。20 μmol/L 褪黑素處理下，WL525HQ 和三得利的根尖鋁含量均顯著低于其他褪黑素處理，分別為32.83 和41.43 g/kg，較單獨鋁脅迫分別顯著降低20%和24%。50 和100 μmol/L 褪黑素處理下，2 份材料的根尖鋁含量無顯著差異。

圖3 不同濃度褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿根尖鋁含量的影響Fig.3 Effects of different melatonin concentrations on the aluminum content in root tips of alfalfa under aluminum stress

2.4 褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿相對電導(dǎo)率的影響

由圖4 可知：與對照相比，單獨鋁脅迫下WL525HQ 和三得利的相對電導(dǎo)率分別顯著增加65%和61%，達到55%和61%。隨著褪黑素濃度的升高，相對電導(dǎo)率呈先下降后上升的趨勢，且三得利的相對電導(dǎo)率高于WL525HQ。與單獨鋁脅迫相比，5 μmol/L 褪黑素處理下，WL525HQ和三得利的相對電導(dǎo)率分別顯著降低5%和7%；20 μmol/L 褪黑素處理下，兩者的相對電導(dǎo)率分別顯著下降14%和21%，達到44%和48%，且顯著低于其他褪黑素處理。10、50 和100 μmol/L褪黑素處理下，2 份材料的相對電導(dǎo)率無顯著差異。

圖4 不同濃度褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿根尖相對電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effects of different melatonin concentrations on the relative permeability of root tips of alfalfa under aluminum stress

2.5 褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿MDA 含量的影響

由圖5 可知：單獨鋁脅迫下，WL525HQ 和三得利的MDA 含量達到最高，分別為6.45 和7.81 mmol/g，較對照分別顯著增加46%和53%。與單獨鋁脅迫相比，5 μmol/L 褪黑素處理下，WL525HQ 和三得利的MDA 含量分別顯著降低9%和21%；20 μmol/L 褪黑素處理下，兩者的MDA 含量分別顯著下降30%和40%，達到4.50和4.70 mmol/g，且顯著低于其他褪黑素處理。10、50 和100 μmol/L 褪黑素處理下，2 份材料的MDA 含量無顯著差異。

圖5 不同濃度褪黑素對鋁脅迫下紫花苜蓿根尖MDA 含量的影響Fig.5 Effects of different melatonin concentrations on the MDA content in root tips of alfalfa under aluminum stress

2.6 褪黑素對鋁脅迫下不同品種紫花苜蓿生長及生理的交互作用

由表1 可知：品種和處理的交互作用對各相關(guān)指標均無顯著影響(P＞0.05)；品種對地上部和地下部干質(zhì)量、根尖鋁含量以及MDA 含量有極顯著影響(P＜0.01)；不同濃度褪黑素對各相關(guān)指標有極顯著影響(P＜0.01)。

表1 不同濃度褪黑素對鋁脅迫下不同品種紫花苜蓿生長及生理的交互作用Tab.1 Interaction among different concentrations of melatonin treatment on the growth and physiology of different alfalfa varieties under aluminum stress

2.7 褪黑素對緩解紫花苜蓿鋁脅迫的效應(yīng)評價

由表2 可知：不同處理條件下，WL525HQ各指標的綜合得分從大到小為CK＞20+Al＞50+Al＞10+Al＞100+Al＞5+Al＞Al，除去對照后，20+Al 處理的綜合得分最高，為0.62，即20 μmol/L褪黑素緩解鋁脅迫的效果最好，此時WL525-HQ 的耐鋁能力最強。不同處理條件下，三得利各指標的綜合得分從大到小為CK＞20+Al＞50+Al＞100+Al＞10+Al＞5+Al＞Al，除去對照后，20+Al處理的綜合得分最高，為0.50，即20 μmol/L 褪黑素緩解鋁脅迫的效果最好，此時三得利的耐鋁能力最強。

表2 不同濃度褪黑素處理對鋁脅迫下紫花苜蓿幼苗的各指標隸屬函數(shù)值Tab.2 Membership function values of indexes of alfalfa seedlings treated with different concentrations of melatonin under aluminum stress

3 討論

3.1 不同濃度褪黑素處理對鋁脅迫下紫花苜蓿生長發(fā)育的影響

植物遭受鋁毒害時的主要表現(xiàn)為植物外部形態(tài)改變，如表現(xiàn)為生長受限以及葉片卷曲、枯黃等癥狀[34-35]，可用植物生長指標反映其是否受脅迫。鋁脅迫時，植物根系生長受抑制，可用相對根系伸長率衡量植物耐鋁性差異。本研究表明：鋁脅迫下，2 份紫花苜蓿材料的根系相對伸長率以及地上部和地下部干質(zhì)量均顯著低于對照。茍本富[36]研究發(fā)現(xiàn)：鋁脅迫下，蠶豆幼苗的根長、株高和根系活力均明顯下降；石貴玉[34]研究發(fā)現(xiàn)：鋁可導(dǎo)致水稻幼苗的株高、根長、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量降低，與本研究結(jié)果一致。鋁和干旱、鹽等脅迫同屬于非生物脅迫，謝豐璞等[19]研究發(fā)現(xiàn)：非生物脅迫會影響植物的生長發(fā)育，而褪黑素可以增強植物對非生物脅迫的耐受性。對供試紫花苜蓿施加褪黑素后，其相對根系伸長率以及地上部和地下部干質(zhì)量顯著升高，且隨著褪黑素濃度的升高呈先升高后降低的變化趨勢，這與孟長軍[37]、石光達等[20]和曹新龍[38]的研究結(jié)果一致。當褪黑素濃度為20 μmol/L 時，2 份紫花苜蓿材料的相對根系伸長率以及地上部和地下部干質(zhì)量均高于單獨鋁脅迫和其他褪黑素處理，這與趙麗娟等[39]對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗施加外源褪黑素的研究結(jié)果一致。相同處理條件下，WL525HQ的相對根系伸長率以及地上部和地下部干質(zhì)量均高于三得利，表明敏感型品種所遭受的鋁毒害比耐受型更嚴重。

3.2 不同濃度褪黑素對紫花苜蓿根尖鋁含量的影響

植物在遭受鋁脅迫時根系先受到損害，大量鋁離子累積在植物根部[40]。劉鵬等[41]研究認為：植物對鋁毒害的反應(yīng)首先表現(xiàn)在根系上，根尖鋁含量可間接反應(yīng)植物受鋁毒害的程度。姜娜等[3]研究表明：根尖鋁含量會隨著鋁脅迫時間的延長而不斷升高。本研究發(fā)現(xiàn)：鋁脅迫下，2 份紫花苜蓿材料的根尖鋁含量較對照顯著升高，而經(jīng)褪黑素預(yù)處理的根尖鋁含量有所下降，鋁脅迫得到緩解；外源施加20 μmol/L 褪黑素處理的根尖鋁含量下降程度最明顯，表明20 μmol/L 褪黑素可有效緩解紫花苜蓿所受的鋁毒害，減少根尖鋁含量的積累。SUN 等[42]研究表明：通常耐鋁型小麥品種的根尖鋁含量低于敏感型品種；楊正禹[11]研究發(fā)現(xiàn)：相同鋁處理下，耐受型品種阿爾剛金比敏感型品種UC-1465 的根尖鋁含量低。以上研究均與本研究結(jié)果一致，即耐鋁型品種WL525HQ的根尖鋁含量始終低于敏感型品種三得利。

3.3 不同濃度褪黑素處理對鋁脅迫下紫花苜蓿幼苗根尖質(zhì)膜透性的影響

植物受到鋁脅迫時，細胞透性增大，膜穩(wěn)定性降低，影響植物代謝[43]。植物細胞膜受損傷導(dǎo)致活性氧清除和產(chǎn)生之間的平衡遭到破壞[44]，活性氧大量積累并攻擊膜脂，誘導(dǎo)植物細胞產(chǎn)生大量MDA[45]，故MDA 含量可反映植物體內(nèi)的氧化脅迫水平。隨著細胞膜被破壞，相對透性功能逐漸減少甚至喪失，導(dǎo)致細胞內(nèi)電解質(zhì)和某些小分子有機物外滲，使得植物組織浸出液內(nèi)的相對電導(dǎo)率升高[46]。本研究中，鋁脅迫下紫花苜蓿根尖相對電導(dǎo)率和MDA 含量較對照顯著增加，且耐鋁型品種的增幅小于敏感型品種，表明鋁脅迫下耐鋁型紫花苜蓿的膜脂過氧化程度和膜透性始終小于敏感型，這與張景云等[47]的研究結(jié)果類似。本研究還發(fā)現(xiàn)：不同濃度褪黑素處理對紫花苜蓿根尖相對電導(dǎo)率和MDA 含量的緩解作用不同，且隨著褪黑素濃度的升高，上述2 個指標值呈先降低后升高的變化趨勢，這與蘇立娜等[48]和褚晶等[49]的研究結(jié)果一致。外源施加20 μmol/L 褪黑素處理的相對電導(dǎo)率和MDA 含量降到最小值，表明褪黑素處理能有效緩解膜脂過氧化，提高耐鋁性，這與張婷[50]的研究結(jié)果一致。綜上所述，褪黑素能抑制植物根尖膜脂過氧化水平，通過降低相對電導(dǎo)率和MDA 含量來緩解鋁毒害，提升植物的質(zhì)膜透性以緩解植物根系生長所受到的抑制。

4 結(jié)論

褪黑素可有效緩解鋁毒害對紫花苜蓿根系生長和根尖細胞造成的損害，加強其對鋁毒害的耐受性，且以20 μmol/L 褪黑素處理的綜合評價得分最高，緩解毒害效果較好。