電針對膜迷路積水豚鼠耳蝸V2R、AQP2、ENaC-α表達(dá)的影響

蔣麗元，葉恬恬，楊俊文

1.杭州市中醫(yī)院針灸康復(fù)科，浙江杭州 310007；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053

美尼爾綜合征（Meniere’s disease，MD）是一種特發(fā)性的內(nèi)耳疾病，常單側(cè)起病，表現(xiàn)為低頻-中頻聽力下降、耳鳴、耳悶脹感，陣發(fā)性眩暈，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。近年來流行病學(xué)調(diào)查顯示，其發(fā)病率為190/100000，男女性發(fā)病比例為1.89∶1，發(fā)病率隨著年齡增長呈逐漸升高趨勢[2]。MD 的基本病理改變是內(nèi)耳膜迷路積水。研究表明，與罹患慢性中耳炎的患者相比，難治性MD 患者血漿的血管加壓素（arginine vasopressin，AVP）升高。采用內(nèi)淋巴囊引流術(shù)治療難治性MD，分別于術(shù)后1 周、1 年、2 年期觀察MD 患者眩暈及感音神經(jīng)性耳聾發(fā)作情況，并檢測患者血漿AVP 水平，發(fā)現(xiàn)其眩暈及感音神經(jīng)性耳聾發(fā)作與血漿AVP 水平呈現(xiàn)正相關(guān)性[3]。實(shí)驗(yàn)研究表明，AVP 是一種9 肽類激素，主要在下丘腦的視上核和室旁核中合成，經(jīng)由下丘腦-垂體束到達(dá)神經(jīng)垂體后釋放入血，AVP 通過與其G 蛋白藕聯(lián)受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。AVP 在內(nèi)耳的作用主要涉及離子通道及水通道機(jī)制[4]。血管加壓素受體2（vasopressin type 2 receptor, V2R）是G-蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，其基因突變或表達(dá)異常與多種疾病相關(guān)，在腎臟疾病的研究較為深入[5]。水通道蛋白2（aquaporin 2，AQP2）是水通道蛋白家族成員中對AVP 敏感的亞型之一[6]。上皮細(xì)胞鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）主要參與AVP 在內(nèi)耳中的離子通道調(diào)節(jié)機(jī)制，ENaC 主要由α、β、γ3 個亞單位組成。研究表明，AVP 與V2R 結(jié)合后，引起cAMP 表達(dá)上調(diào)，使ENaC-α 表達(dá)及功能增強(qiáng)，促使離子濃度發(fā)生變化及水液轉(zhuǎn)運(yùn)，參與內(nèi)耳膜迷路積水的發(fā)生、發(fā)展過程[7-8]。此外，AVP 通過與耳蝸及內(nèi)淋巴囊中的V2R結(jié)合，激活A(yù)VP-AQP2系統(tǒng)，使內(nèi)耳中的AQP2 mRNA 及蛋白表達(dá)增加，內(nèi)淋巴腔內(nèi)液體增加，發(fā)生膜迷路積水。針刺具有改善MD患者眩暈發(fā)作的作用，而關(guān)于其具體機(jī)制未明[9]。本研究通過AVP 腹腔注射建立膜迷路積水豚鼠模型，從耳蝸V2R、AQP2、ENaC-α 蛋白角度探討針刺調(diào)節(jié)膜迷路積水豚鼠耳蝸積水程度的潛在機(jī)制。

圖1 3 組豚鼠耳蝸（HE 染色圖片，×40，箭頭所示為前庭膜）

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

健康清潔級6 周齡雄性白毛紅目豚鼠36 只，體質(zhì)量為350～400g，購自新昌縣大市聚欣健兔場[生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2013-0060]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心，清潔級動物實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫[（22±1）℃]、恒濕（65%～70%），每日光照12h，所有豚鼠可自由進(jìn)食水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 日后按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、電針刺組，每組12 只。實(shí)驗(yàn)過程中遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。該項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)過程符合動物保護(hù)、動物福利和倫理原則，動物實(shí)驗(yàn)倫理由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)管理與倫理委員會審批通過（倫理審批號：IACUC-20180820-06）。

1.2 主要試劑與儀器

醋酸去氨加壓素（deamino arginine vasopressin，DDAVP，批準(zhǔn)文號∶20170701，海南中和制藥股份有限公司，規(guī)格：1ml∶4μg）；V2R 抗體（批準(zhǔn)文號：ab213708，英國Abcam 公司，規(guī)格：100μl）；AQP2抗體（批準(zhǔn)文號：ab199975，生產(chǎn)單位：英國Abcam公司，規(guī)格：10μl）；ENaC-α 抗體（批準(zhǔn)文號：PA1-920A，美國Thermo Fisher 公司，規(guī)格：100μg）；GAPDH 抗體（批準(zhǔn)文號：ab181602，英國Abcam 公司，規(guī)格：100μl）；一次性無菌針灸針（0.22mm×13.00mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）；HANS-100A 型韓氏疼痛治療儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）。

1.3 模型制備方法

模型組及電針刺組豚鼠給予醋酸去氨加壓素腹腔注射，先按照4μg/kg 給藥，每日1 次，連續(xù)7 日，第8 日起按照6μg/kg 給藥，每日1 次，連續(xù)給藥3 日，共給藥10 日[10]。造模成功以病理切片觀察到耳蝸積水為標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.4 干預(yù)方法

電針刺組豚鼠以自制的木板與布條結(jié)合的固定裝置固定，用0.22mm×13.00mm 針灸針直刺左側(cè)“聽宮”（位于耳屏前凹陷處）穴3～5mm，平刺“百會”（位于顱頂骨正中央）穴3～5mm，連接HANS-100A 型韓氏疼痛治療儀，采用連續(xù)波100Hz，電針強(qiáng)度1mA，干預(yù)時間20min。豚鼠“百會”、“聽宮”穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]中的描述，采用動物比較學(xué)方法定位。正常組、模型組豚鼠裝入固定裝置中固定20min。每日干預(yù)1 次，連續(xù)10 日。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 蘇木精-伊紅染色法觀察豚鼠耳蝸形態(tài)學(xué)變化 豚鼠斷頭處死后，剪取左側(cè)耳蝸組織，將耳蝸周圍組織剔除干凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫鈣，修塊后石蠟包埋盒中包埋，于切片機(jī)上沿耳蝸蝸軸中央平面切成約4.5μm 的薄片，選取耳蝸?zhàn)畲笄忻?，制作豚鼠耳蝸切片，脫蠟后蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining, HE）封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并測量耳蝸中階與前庭階面積。計(jì)算耳蝸中階/（耳蝸中階+前庭階面積）的比值R 值，即可判定耳蝸積水程度，R 值越大，積水程度越重，反之越輕[11]。

1.5.2 免疫印跡試驗(yàn)（Western blot，WB）法檢測豚鼠耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達(dá) 豚鼠斷頭處死后，于冰上迅速剝離出左側(cè)耳蝸，加入液氮研磨后放入–80℃冰箱內(nèi)保存。通過Western blot 法測定耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白含量。配制8%～12%分離膠和5%濃縮膠，每個孔60μg 總蛋白進(jìn)行上樣，每孔10～15μl，濃縮膠60V，分離膠80V 進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。一抗溶液（V2R 濃度1∶800，AQP2 濃度1∶400，GAPDH 濃度1∶10000）4℃冰箱中過夜孵育；二抗溶液（1∶5000）室溫條件下孵育60min。顯影液顯影，曝光儀中顯影曝光，使用Image J軟件分析V2R、AQP2及ENaC-α蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值，以V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白與內(nèi)參GAPDH 的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)法，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)觀察

正常組豚鼠精神狀態(tài)佳，行動步態(tài)自如，自活動多，對聲音反應(yīng)靈敏。模型組豚鼠普遍出現(xiàn)精神差，行動遲緩，活動減少，對聲音反應(yīng)遲鈍。電針刺組豚鼠精神狀況、行動、自發(fā)活動與模型組無差別，但對聲音反應(yīng)敏感度與模型組比較，有所改善。

2.2 電針對耳蝸膜迷路積水的影響

正常組耳蝸前庭膜平直無膨隆，無積水。模型組耳蝸前庭膜隆起，出現(xiàn)膜迷路積水。電針刺組前庭膜可見隆起，但膨隆程度較正常組減輕，見圖1。

與正常組比較，模型組豚鼠R 值升高（P<0.01），與模型組比較，電針刺組豚鼠R 值下降（P<0.01），見表1。

表1 3 組豚鼠耳蝸R 值、V2R、AQP2、ENaC-α 相對表達(dá)量比較（±s , n=6）

表1 3 組豚鼠耳蝸R 值、V2R、AQP2、ENaC-α 相對表達(dá)量比較（±s , n=6）

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

分組 R 值 V2R AQP2 ENaC-α正常組 0.28±0.04 2.00±0.22 1.81±0.20 2.16±0.08模型組 0.49±0.06* 7.50±0.25* 7.85±0.14* 7.51±0.49*電針刺組 0.33±0.043# 5.09±0.183# 4.72±0.29# 4.73±0.15#

2.3 電針對膜迷路積水模型豚鼠耳蝸V2R蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組耳蝸V2R 蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，電針刺組V2R 蛋白表達(dá)量降低（P<0.01），見表1、圖2。

圖2 3 組豚鼠耳蝸V2R、AQP2、ENaC-α 蛋白表達(dá)的比較（WB 法）

2.4 電針對膜迷路積水模型豚鼠耳蝸AQP2 蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組耳蝸AQP2 蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，電針刺組AQP2蛋白表達(dá)量降低（P<0.01），見表1、圖2。

2.5 電針對膜迷路積水模型豚鼠耳蝸ENaC-α 蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組耳蝸ENaC-α 蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，電針刺組ENaC-α蛋白表達(dá)量降低（P<0.01），見表1、圖2。

3 討論

從中醫(yī)學(xué)來看，針刺耳周及頭部穴位可治療耳部疾病有相關(guān)理論支撐。聽宮穴首次提出在經(jīng)典古籍《靈樞》中“刺其聽宮，中其眸子，聲聞于耳，此其輸也”。聽宮別名多所聞穴、多聞穴，是手太陽小腸經(jīng)腧穴，圍繞耳前，亦為手足少陽、手太陽交會穴，刺之能通竅活絡(luò)聰耳竅。《勝玉歌》：“頭痛眩暈百會好?！薄夺樉拇蟪伞芬嗝枋霭贂髦?，云：“頭痛目眩，食無味，百病皆治?！痹谖墨I(xiàn)統(tǒng)計(jì)的治療MD 常用腧穴中，百會穴使用頻率最高[13]。百會配伍聽宮是治療內(nèi)耳眩暈的常用組穴。針刺兩穴，有助于調(diào)整耳內(nèi)微循環(huán)，改善水液代謝功能而止眩暈，并恢復(fù)聽覺[14]。本研究結(jié)果顯示，電針刺“百會”“聽宮”穴能顯著減輕膜迷路積水模型豚鼠的耳蝸積水程度，與課題組前期研究結(jié)果一致[15]。本研究中，電針頻率采用的100Hz，其依據(jù)主要基于課題組前期的研究工作基礎(chǔ)。筆者所在課題組前期研究工作中采用假電針及不同頻率電針（2Hz、15Hz、100Hz）干預(yù)膜迷路積水，結(jié)果顯示，假電針及2Hz、15Hz、100Hz 電針均有良好的治療作用。各治療組間比較，100Hz 電針療效最佳，作為前期工作的延續(xù)，故選用100Hz 作為電針干預(yù)頻率。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用AVP 腹腔注射誘導(dǎo)膜迷路積水豚鼠模型，AVP 腹腔注射后通過AVP-V2R-水/離子蛋白信號通路引起耳蝸膜迷路內(nèi)淋巴液增多，造成膜迷路積水[16]。本研究中與正常組豚鼠相比，膜迷路積水豚鼠耳蝸積水程度增加，耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達(dá)升高，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致，與MD 膜迷路積水病理改變相符，說明AVP 成功復(fù)制了MD 病理特征，是較為理想的MD 膜迷路積水模型[7,17]。本研究中，與模型組相比，電針刺組R 值下降，與既往研究結(jié)果一致，與模型組相比，電針刺組耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達(dá)降低，說明電針通過調(diào)節(jié)耳蝸水與離子蛋白表達(dá)參與了MD 膜迷路積水的治療[18-20]。

研究表明，AVP 通過與V2R 受體結(jié)合，激活其下游AQP2，調(diào)控水液代謝平衡。V2R 基因缺失或表達(dá)水平下降與尿崩癥發(fā)生密切相關(guān)。過表達(dá)則有可能發(fā)生抗利尿激素分泌失調(diào)綜合征[5]。受啟發(fā)于腎臟病的研究，研究者在接受內(nèi)淋巴管阻塞手術(shù)的MD患者內(nèi)耳內(nèi)淋巴囊中檢測到了V2R、AQP2 的表達(dá)，并通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了AVP-V2R-AQP2 信號通路參與了內(nèi)耳水液代謝的調(diào)節(jié)，與內(nèi)耳膜迷路積水的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[21-23]。ENaC-α 通道主要位于上皮細(xì)胞，是允許Na+流過，維持鹽和水體內(nèi)平衡的重要離子通道蛋白。多種體液因子如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、表皮生長因子、AVP 均對ENaC-α 蛋白表達(dá)有調(diào)控作用[24]。在多種情況下，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)與AVP 系統(tǒng)被相同的刺激共同激活，在多個水平上相互影響，參與ENaC-α 的表達(dá)調(diào)控，實(shí)現(xiàn)水液代謝調(diào)節(jié)作用[24-25]。腎臟的研究中，AVP 對AQP2 及ENaC-α 表達(dá)調(diào)控亦存在交互作用。即AVP 與V2R 結(jié)合后，通過調(diào)控AQP2 的表達(dá)使腎臟集合管對水的重吸收增加，尿滲透壓增加，尿流量減少，尿液濃縮AVP 又可以激活ENaC-α 的表達(dá)。AVP 對ENaC-α 的刺激通過促進(jìn)尿濃度在水穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[24]。文獻(xiàn)中少見AVP-V2R-水/離子蛋白信號通路在人體腎以外器官水液代謝失衡性疾病中的研究。本實(shí)驗(yàn)中，與正常組比較，膜迷路積水模型組豚鼠耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達(dá)上調(diào)，說明其參與了內(nèi)耳膜迷路積水的發(fā)生過程。電針刺后引起V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達(dá)下調(diào)，說明降低耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達(dá)可能是電針調(diào)節(jié)膜迷路積水模型豚鼠耳蝸積水程度的潛在機(jī)制。

綜上所述，電針刺可改善膜迷路積水豚鼠耳蝸積水程度，其機(jī)制可能與下調(diào)耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達(dá)有關(guān)，本研究結(jié)果為該法的臨床運(yùn)用提供了實(shí)驗(yàn)支持，但電針刺降低耳蝸V2R、AQP2及ENaC-α 蛋白表達(dá)的相關(guān)環(huán)節(jié)還有待進(jìn)一步研究，AVP-V2R-AQP2/ENaC-α 信號通路將是其切入點(diǎn)之一。