骨組織工程及選擇性細(xì)胞滯留技術(shù)的研究進展

楊錢冬 周江玲 楊明 熊翱 侯天勇

骨組織工程中骨移植材料的成骨活性是影響骨組織工程移植成功與否的關(guān)鍵。已有研究證實，骨髓富含多種骨祖細(xì)胞、細(xì)胞因子和生長因子[1]。這些成分是促進成骨的生物活性成分的重要天然儲存庫，然而其只在骨髓抽吸物(bone marrow aspiration，BMA) 中占很小部分，這導(dǎo)致了傳統(tǒng)的將移植物簡單浸泡于骨髓溶液中或直接將骨髓注射至移植區(qū)的情況不能達到較高的局部有效濃度[2]。因此，基于高效骨髓利用的骨髓富集骨修復(fù)技術(shù)應(yīng)運而生，其核心理念是將自體骨髓中具有促成骨作用的細(xì)胞和細(xì)胞因子濃聚于支架材料，快速構(gòu)建成具有高成骨活性的骨移植材料。國內(nèi)外已有該技術(shù)應(yīng)用于骨修復(fù)的臨床報道：Gan等[3]設(shè)計并使用了密度梯度離心技術(shù)，旨在提升 BMA 內(nèi)有效成分的濃度，盡管在過去的十幾年里這一技術(shù)被不斷改進，但它仍然有著需要相對較多的骨髓抽吸物，以及特定的復(fù)雜的設(shè)備等一系列問題[4]。因此，亟須找到一種替代的更簡便、高效的骨髓富集方法。2002 年，Muschler等[5]提出了另一種提升 BMA 中有效成分濃度的方法，稱為選擇性細(xì)胞滯留 (selective cell retention，SCR) 技術(shù)，有著操作簡單，不需要任何昂貴的設(shè)備及嚴(yán)格的操作條件等優(yōu)點[6]。筆者將圍繞骨組織工程的基本概念及 SCR 技術(shù)的研究進展等進行綜述。

一、骨組織工程概述

骨組織是由有機成分和無機成分構(gòu)成的復(fù)合體，其主要功能是運動、支持和保護身體，同時也是重要的造血和免疫器官[7]。有機成分主要由 Ⅰ 型膠原組成 (約占 30%)，無機成分主要是以羥基磷灰石 (hydroxyapatite，HAP) 形式存在的磷酸鈣 (約占 70%)[8]。

骨組織工程技術(shù)的基本原理是通過模擬體內(nèi)骨組織生長過程來治療骨缺損[9-11]。骨組織工程中的三大要素包括：支架材料、種子細(xì)胞以及組織工程技術(shù)中所需要的細(xì)胞因子[12]。其中理想的骨組織工程中的移植物材料應(yīng)具備的基本特征包括：骨整合 (osteointegration)，骨誘導(dǎo)(osteoinduction)，骨傳導(dǎo) (osteoconduction)[13-14]。骨整合的定義為植入物和骨骼之間可以形成直接接觸的界面，沒有軟組織在之間形成阻擋，即能達到功能與結(jié)構(gòu)的直接整合。骨誘導(dǎo)是骨愈合過程中的一種現(xiàn)象，指材料具有刺激未成熟細(xì)胞發(fā)育成成骨細(xì)胞的作用。骨傳導(dǎo)性指移植物能為血管的長入和新骨的形成提供一個支架，主要依賴于所使用的生物材料及其形態(tài)[15]。目前已有研究報道的除自體骨以外的移植材料主要有以下幾類：天然及人工高分子聚合物[16]、金屬[17]、生物陶瓷[18]、水凝膠[19]等。目前在臨床上應(yīng)用最為廣泛的是脫鈣骨基質(zhì) (decalcified bone matrix，DBM)，它通常是由異體骨組織脫脂、脫蛋白、脫鈣后獲得的，具有良好的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，可加速骨形成，促進骨愈合[20]。但其成骨效能仍劣于金標(biāo)準(zhǔn)自體骨。因而骨組織工程中的種子細(xì)胞[21][如細(xì)胞分化能力極強的間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell，MSC)，在人體骨髓中含量較為豐富，有研究證實體外大量培養(yǎng)和保存對其分化能力無影響，取材方面通過骨穿便可得到，因而被當(dāng)作最有潛力的種子細(xì)胞] 和細(xì)胞因子[21-23](一種或一類對于細(xì)胞具有復(fù)雜調(diào)控機制作用的細(xì)胞因子，盡管目前關(guān)于成骨的全部信號通路尚未明確，但廣大學(xué)者已經(jīng)掌握了大部分與成骨相關(guān)的細(xì)胞因子，并了解了其作用機制，證實了其效果) 是決定移植物成骨能力的關(guān)鍵因素。

骨組織工程中骨髓富集的理念，可以將促進成骨的種子細(xì)胞和細(xì)胞因子有效地富集到支架材料上，既完成了骨組織工程技術(shù)三大要素的綜合，又可顯著提高骨組織工程的成骨能力，是近年來研究的熱點。

二、SCR 技術(shù)的原理及應(yīng)用

隨著干細(xì)胞治療理念的研究進展及其在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用，目前有希望通過干細(xì)胞技術(shù)以制造理想的骨組織工程移植物用以促進骨愈合。目前，這類技術(shù)的原理通常是通過將骨髓 MSC 植入到適合細(xì)胞附著、增殖和分化的骨組織工程生物支架上來構(gòu)建。包括實驗和臨床研究在內(nèi)的越來越多的證據(jù)表明，骨髓是促進成骨的生物活性成分的重要天然儲存庫，但傳統(tǒng)的骨髓富集策略是將移植物簡單浸泡于骨髓溶液中或直接將骨髓注射至移植區(qū)，這種情況不能達到較高的局部濃度[2]。因而在 2002 年，Muschler等[5]提出了 SCR 技術(shù)，用于解決骨髓富集面臨的各種困難，本部分將對 SCR 技術(shù)的原理、應(yīng)用等方面進行闡述。

1.SCR 技術(shù)原理：SCR 技術(shù)主要的原理是物理攔截的孔徑效應(yīng)，細(xì)胞 (特別是有核的細(xì)胞) 附著在基質(zhì)上的液體自由通過時，通過適當(dāng)?shù)販p小支架的孔徑，可達到將更多的骨髓中具有增殖和分化潛能的祖細(xì)胞、細(xì)胞因子和生長因子保留在支架上的目的[18]。Hernigou 等[24-25]的研究已經(jīng)證實，SCR 技術(shù)能使富集的復(fù)合材料具有相對較高的細(xì)胞成分和生長因子的濃度。其富集的細(xì)胞包括骨髓 MSCs、多種核細(xì)胞 (karyocytes)、內(nèi)皮祖細(xì)胞 (endothelial progenitor cells，EPCs)、單核細(xì)胞 (monocytes) 等，并增加了骨組織工程材料中局部所含的細(xì)胞因子的濃度，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMPs)、血小板源性生長因子 (platelet-derived growth factor，PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 等。

2.SCR 技術(shù)的操作流程：在 SCR 技術(shù)的臨床研究中，骨髓采集的優(yōu)選部位是髂骨[26]，備選部位是椎體和肱骨近端[27]，且一般單一穿刺點抽吸的骨髓量不應(yīng)超過2 ml。而對于 SCR 技術(shù)的設(shè)備而言，目前市面上存在手動款 (Cellect DBM System) 及電動款 (Screen-enrich-combine Circulating System)[28-30]。尚無研究比較兩種類型設(shè)備的優(yōu)缺點，它們在已有的研究中都具有較好的富集結(jié)果。共同的操作流程是，在骨髓采集完畢后，利用負(fù)壓抽吸的原理，通過手動按壓或電動富集器，彈簧牽拉后回彈形成負(fù)壓抽吸，在放置異體骨或人工骨等骨組織工程修復(fù)材料的容器內(nèi)形成負(fù)壓，使患者的骨髓可以在負(fù)壓的作用下濾過骨組織工程修復(fù)材料，多次循環(huán)增加骨髓與骨組織工程修復(fù)材料的接觸，以提高骨移植材料的生物活性，促進患者骨骼重建，賦予傳統(tǒng)骨組織工程修復(fù)材料新的生物活力。目前對于最佳的循環(huán)次數(shù)，尚無研究報道，不同的儀器和富集材料間可能存在差異。

3.SCR 技術(shù)在臨床上的應(yīng)用：SCR 技術(shù)可選擇的移植物材料包括 DBM、輻照同種異體骨 (irradiated allograft bone，IAB)、膠原纖維、明膠海綿和磷酸三鈣 (tricalcium phosphate，TCP) 等[31-33]。臨床上許多研究已經(jīng)證實了SCR 這一技術(shù)的可行性：Lee 等[34]通過 SCR 技術(shù)富集BMA，聯(lián)合減壓清創(chuàng)術(shù)治療了繼發(fā)性股骨頭壞死，在術(shù)后2 年內(nèi) 3 例患者都有良好的結(jié)果。Yousef 等[32]同樣利用SCR 技術(shù)，并聯(lián)合運用膠原蛋白支架，用于脊柱融合術(shù)，治療了 21 例患者，并在平均 7 年的中長期隨訪里，取得了良好的臨床療效。同樣，Yang 等[30]也在 18 例青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者中使用了 SCR 技術(shù)，并取得了滿意的臨床隨訪結(jié)果。此外，也有研究比較了使用傳統(tǒng)骨移植材料和使用 SCR 技術(shù)治療骨缺損的結(jié)果，Shen 等[35]的研究發(fā)現(xiàn)了 SCR 組的骨愈合時間短于傳統(tǒng)移植物愈合組，證明了 SCR 技術(shù)的臨床效果。

4.SCR 技術(shù)的潛在風(fēng)險：SCR 技術(shù)作為干細(xì)胞治療的一種形式，是否存在風(fēng)險以及是否符合倫理要求是學(xué)者們普遍關(guān)注的問題。目前有兩項關(guān)于 SCR 技術(shù)的回顧性臨床研究報道，共有 3 例患者出現(xiàn)術(shù)后感染，但尚不清楚是否是移植物植入或其它原因?qū)е耓30,36]。而 Long 等[37]報道的 775 例骨髓抽吸操作的并發(fā)癥發(fā)生率為 0.3%，并且在納入的 SCR 技術(shù)研究中，未報告相關(guān)的不良事件，再次證實了該技術(shù)的安全性。

三、SCR 技術(shù)的最新研究進展

基于 SCR 技術(shù)的尺寸效應(yīng)的原理，還可以通過一系列物理、化學(xué)的方法來調(diào)整支架的生物理化性質(zhì)，進一步提高 SCR 技術(shù)富集的效率。Hou 等[38]使用納米級的自組裝肽 (self-assembling peptide，SAP) RADA16-I 修飾了 DBM 支架，發(fā)現(xiàn)支架的孔徑從約 396.24 μm 減少到20.22 μm，極大地提高了 SCR 技術(shù)的物理攔截效率 (孔徑效應(yīng))，提高了骨髓富集的效率。此外，RADA16-I 可以提供一個更適合成骨的細(xì)胞微環(huán)境，促進 DBM 與細(xì)胞的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，進一步促進 DBM 支架的成骨。該文還提出，經(jīng)上述方法修飾后富集效率更高的原因可能還與電荷相互作用有關(guān)，因為骨髓中的細(xì)胞和因子通常具有不同的電荷，也可以根據(jù)這一原理來提高富集效率(電荷效應(yīng))，Luo 等[39]則用賴氨酸環(huán) RGD (lysine-cyclic RGD，LcRGD) 肽修飾 DBM，除了能夠使 SCR 技術(shù)富集后的材料保留較高濃度和數(shù)量的 MSCs，該復(fù)合材料同樣提供了一個有利于成骨誘導(dǎo)的微環(huán)境。但是孔徑攔截和電荷吸附的原理都不能用于選擇特定類型的細(xì)胞進行富集，若能在支架材料上增加特異性受體和配體之間特異性結(jié)合(配體效應(yīng)) 的應(yīng)用，則可達到骨髓細(xì)胞特異性富集的目的。例如，Xing 等[40]采用分層自組裝技術(shù) (layer-by-layer self-assembly technique，LBL) 對 DBM 支架進行修飾，構(gòu)建了一種新型復(fù)合材料，這種材料運用了物理攔截和化學(xué)識別結(jié)合的原理，顯著提高了 SCR 的效率和特異性，同樣提供了一個有利于骨組織生長的微環(huán)境，可以明顯促進骨髓 MSC 的遷移、增殖和成骨分化，從而加速骨修復(fù)。并且，這種新型的生物材料具有成本低廉、運輸方便、可在術(shù)中快速構(gòu)建等優(yōu)點。Tang 等[41]設(shè)計了一個包含層膠粘連蛋白 α4 的核心功能氨基酸序列的膠原結(jié)合域?qū)?DBM進行修飾，以增強骨組織工程支架的功能，使得支架上具有了能與 MSCs 等層粘連蛋白受體相結(jié)合的生物活性配體。這種功能化的支架結(jié)合 SCR 技術(shù)，提供了一個具有更好生物相容性、細(xì)胞黏附、成骨誘導(dǎo)和血管生成的微環(huán)境，可以進一步促進骨的形成和血管化。

綜上，傳統(tǒng)的 SCR 理念，是通過調(diào)節(jié)支架材料網(wǎng)孔的大小來實現(xiàn)對 BMA 中有效成骨成分的富集，這種情況的富集成分易聚焦在材料的表層，深部效率較低。未來SCR 技術(shù)研究的熱點應(yīng)聚焦于選擇性的富集，以達到骨髓成分的定向定位富集，進一步實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化前的 SCR 基礎(chǔ)理論儲備。

四、總結(jié)

筆者綜述了骨組織工程概況和 SCR 技術(shù)的原理及應(yīng)用情況，證實了 SCR 技術(shù)能通過富集植入物材料上的骨髓中的有效成分的濃度，達到促進骨組織愈合的目的，有著良好的應(yīng)用前景。雖然 SCR 技術(shù)已在臨床上廣泛應(yīng)用，但仍存在著一些問題，例如，在已有的實驗研究中，在對支架材料進行修飾重組的過程中添加了一系列化學(xué)物質(zhì)，雖然實驗證實其提高了富集的效率，但由于倫理問題尚不能直接應(yīng)用于臨床，且目前應(yīng)用 SCR 技術(shù)產(chǎn)生最佳治療效果的 MSC 的數(shù)量或濃度目前尚無明確標(biāo)準(zhǔn)。在未來，需要對 SCR 技術(shù)進行更深入的機制研究以及更長期的臨床應(yīng)用療效評估，以實現(xiàn)全面化和標(biāo)準(zhǔn)化的 SCR 的移植物制備和應(yīng)用方案。