核桃果皮對蘋果蠹蛾為害的防御響應(yīng)

曹小艷，葉曉琴，阿地力·沙塔爾＊

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學園藝學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院，新疆 烏魯木齊 830052)

核桃（Juglans regiaLinnaeus）又叫胡桃，是我國重要的經(jīng)濟林樹種。其堅果具有較高的營養(yǎng)價值，有良好的保健作用。我國核桃的生產(chǎn)與出口位居世界第一，根據(jù)FAO 資料統(tǒng)計，在2020年，我國的核桃種植面積為48.71 萬公頃，核桃產(chǎn)量高達110 萬噸[1]。其中核桃的種植區(qū)主要分布在新疆、云南、四川、陜西等地，而新疆擁有獨特的地理環(huán)境造就了核桃優(yōu)良的品種，因此核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展被當?shù)馗叨戎匾?。蘋果蠹蛾（Cydia pomonellaLinnaeus）是世界性檢疫害蟲，主要為害蘋果（Malus pumilaMill ）、 桃（Prunus persicaLinnaeus）、海棠（Malus spectabilisBorkh）、核桃等仁果類和堅果類果樹[2]。在中國新疆和田縣，于2018 年首次發(fā)現(xiàn)蘋果蠹蛾為害核桃，并造成20%～39%的產(chǎn)量損失，近幾年來蘋果蠹蛾在核桃產(chǎn)區(qū)不斷擴散。目前該蟲的防治主要依靠化學防治，這與綠色防控和生產(chǎn)綠色食品的原則相悖。因此有效利用植物的抗蟲性對害蟲的防治具有著重要意義，也符合當前綠色環(huán)保的防控策略。

植物與昆蟲相互作用是生物多樣性的驅(qū)動力，在漫長的協(xié)同進化過程中，植物已形成相應(yīng)的防御措施，以確保植物自身的正常生長[3-4]。最直接的方式是植物通過產(chǎn)生多種代謝物直接作用植食性昆蟲或威懾植食性昆蟲來保護自身，如植物代謝物質(zhì)胡桃醌可以毒殺舞毒蛾（Lymantria disparLinnaeus）和甘藍夜蛾（Mamestra brassicaeLinnaeus）幼蟲，進而提高植物對植食性昆蟲的抗性[5]。另外當植食性昆蟲為害時，植物可以改變自身的營養(yǎng)物質(zhì)來抑制植食性昆蟲的生長發(fā)育[6-7]。已有研究表明營養(yǎng)物質(zhì)是影響昆蟲生長發(fā)育與繁殖的重要因素，尤其是植物體內(nèi)的氮和糖[8-9]。植物被害蟲為害后，為了應(yīng)對害蟲的脅迫，植物的相關(guān)防御酶被啟動，酶活性的變化則反應(yīng)寄主植物的抗蟲反應(yīng)[10]。已有研究表明過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等在植食性昆蟲脅迫時誘導酶活性的改變，并生成相關(guān)的防御體系[11-13]。在田間觀察發(fā)現(xiàn)被蘋果蠹蛾為害后，核桃果皮蛀孔處組織褐化，部分細胞死亡，通過室內(nèi)飼喂發(fā)現(xiàn)與取食核仁相比取食桃外果皮的蘋果蠹蛾生長發(fā)育已受到嚴重影響。此外，本課題組在野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)核桃不同品種被蛀率之間存在著較大的差異。因此，通過研究蘋果蠹蛾蛀食核桃果皮營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物質(zhì)及酶活性的動態(tài)變化，探明核桃果皮對蘋果蠹蛾取食脅迫的防御反應(yīng)，為抗蘋果蠹蛾核桃品種的選育提供更科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑及儀器：供試藥劑均是國產(chǎn)分析純（蘇州格銳思生物科技有限公司），人工氣候培養(yǎng)箱RXZ-260A、水浴鍋HH-M6、紫外分光光度計Each 840-37（上海俊升科學器材有限公司），高效液相色譜儀LC-100（上海伍豐科學儀器有限公司），移液槍Eppendorf 1～100 mL、50 ～200 μL（德國艾本德公司），離心機TLG-16、酶標儀Multiskan FC（美國ThermoFisher Scientific 公司），研缽（天翼灃生物科技有限公司）。

蟲源：蘋果蠹蛾蟲源采自于新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)和田縣拉依喀鄉(xiāng)核桃園中，將采集的老熟幼蟲帶回室內(nèi)置于人工氣候培養(yǎng)箱中連續(xù)飼喂2 代，飼養(yǎng)條件為溫度（25 ± 1） ℃，濕度（60 ±5）%，光周期16∶8（L∶D），幼蟲以核桃果實飼喂，成蟲以10%的蜂蜜水補充能量，將幼蟲飼喂至4 齡備用。

供試核桃品種為‘扎343’，種植于和田縣拉依喀鄉(xiāng)，選取長勢一致、無病蟲害的核桃果實作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 接蟲及取樣 接蟲：將供試蘋果蠹蛾4 齡幼蟲接蟲前進行6 h 的饑餓處理備用，在野外選擇進入硬核期（花后80 d）的大小一致、無病蟲害核桃果實供試。以小毛筆輕輕的將備用的蘋果蠹蛾4 齡幼蟲接于核桃果實表面，每顆核桃果實接種1 頭幼蟲，并以網(wǎng)兜將果實包裹防止幼蟲逃逸，以未接蟲的核桃果實作對照（為害0 h）。

收樣：從幼蟲蛀食果實外果皮開始計時，分別接蟲12、24、36、48 和72 h 后取樣，每個時間段生物學重復3 次，共計接蟲核桃果實90 顆。為了避免果實不同發(fā)育時期造成的影響，以不同時間接蟲，同一時間收集核桃果皮。將所取的樣品以純凈水將果實表面清洗干凈，以手術(shù)刀切取蛀孔周圍1 cm2的核桃果皮，將切取的樣品在冰塊上切成小塊，迅速置于液氮罐中，備用于各項指標的測定。

1.2.2 營養(yǎng)物質(zhì)的測定 可溶性糖含量的測定：采用蒽酮比色法[14]。

可溶性蛋白含量的測定：采用考馬斯亮藍G-250 法[15]。

1.2.3 代謝物質(zhì)的測定 胡桃醌含量的測定：采用高效液相色譜法（圖1）[16]。

單寧含量的測定：采用試劑盒測定，試劑盒購自蘇州格銳思生物科技有限公司。稱取約0.1 g 核桃果皮鮮樣，加入1 mL 蒸餾水，以研缽充分勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管中，用80 ℃水浴鍋水浴提取1 h，之后以12 000 r·min-1、4 ℃的條件下離心10 min。取上清液10 μL 與130 μL 的蒸餾水加入離心管中，加入試劑一40 μL，試劑二60 μL，用蒸餾水做標準曲線，以酶標儀在波長650 nm 下檢測單寧的含量。

總黃酮含量的測定：采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法測定黃酮總含量，以蘇州格銳思生物科技有限公司的試劑盒進行測定。稱取約0.1 g 核桃果皮鮮樣，加入1.5 mL 的60% 乙醇研磨，60℃振蕩提取2 h（若蒸發(fā)用60% 乙醇定容至1.5 mL），在12 000 r·min-1、25 ℃的條件下離心10 min，將離心管中加入50 μL 的上清液與15 μL的試劑一、30 μL 試劑二和105 μL 試劑三迅速混勻。用蒸餾水做標準曲線，以酶標儀在波長510 nm 下檢測總黃酮含量。

1.2.4 防御酶活性的測定 酶液的提?。悍Q取約0.1 g 核桃果皮鮮樣，放入帶有液氮的研缽中研磨后加入1 mL 提取液，用離心機在12 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，上清液則為酶液提取液。提取液中含有50 mmol·L-1（pH 7.8）的磷酸緩沖液和1%的聚乙烯吡咯烷酮，所用試劑盒購自蘇州格銳思生物科技有限公司。

過氧化物酶(POD)活性的測定：采用愈創(chuàng)木酚法[17]。

過氧化氫酶（CAT）活性的測定：采用鉬酸銨法[18]。

超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定：采用黃嘌呤氧化酶法[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Microsoft Excel 2013 進行數(shù)據(jù)匯總，采用SPSS 22 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差顯著性分析，采用Duncan’s 多重比較進行檢驗相關(guān)指標的差異性，采用origin 2018 軟件對數(shù)據(jù)進行處理與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

2.1.1 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮可溶性蛋白含量的影響 由圖2a 可知，核桃果皮可溶性蛋白的含量隨蘋果蠹蛾蛀食時間的推移存在較大差異。蘋果蠹蛾為害12 h 時與對照相比可溶性蛋白含量增加，增加量為3.15%，但無顯著差異（P0.05）。然而，在為害24、36、48、72 h 時可溶性蛋白含量持續(xù)降低，與對照相比分別低于13.02%、13.81%、20.67% 、23.64% ， 差異水平均顯著（P＜0.05）?？梢娫跒楹?4 h 時，可溶性蛋白含量顯著降低，核桃果皮可能開始產(chǎn)生防御反應(yīng)。

2.1.2 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮可溶性糖含量的影響 由圖2b 可知，蘋果蠹蛾為害不同時間段后，核桃果皮可溶性糖逐漸下降。為害12、24、36、48、72 h 時可溶性糖含量分別比對照低1.51%、2.78%、4.15%、20.66%、29.42%。其中，在蘋果蠹蛾為害12～36 h 內(nèi)與對照相比均無顯著差異（P＞0.05），在為害48 h 時與對照相比差異水平顯著（P＜0.05）?？梢娫谖：?8 h 時，可溶性糖含量顯著降低，進而可能抵御蘋果蠹蛾的為害。

綜上所述，核桃果皮營養(yǎng)物質(zhì)的含量隨著蘋果蠹蛾為害時間的延長而逐漸降低，由此推測核桃果皮可能通過改變營養(yǎng)物質(zhì)進而影響蘋果蠹蛾的生長發(fā)育，其中不同營養(yǎng)物質(zhì)所改變的時間有所差異。

2.2 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮次生代謝物質(zhì)含量的影響

2.2.1 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮胡桃醌含量的影響 根據(jù)圖3a 可知，隨著蘋果蠹蛾為害時間的延長，核桃果皮中胡桃醌的含量與對照相比均增加，其含量呈先上升后下降的趨勢。在蘋果蠹蛾為害24～72 h 時與對照相比胡桃醌的含量均有顯著差異（P＜0.05），其中在為害48 h 時胡桃醌含量達到最高，為976.68 μg·g-1，與對照相比增加44.48%。為害36 h 和72 h 與對照相比胡桃醌含量變化較小，分別增加25.60%和22.32%。由此可見在為害48 h 時，蘋果蠹蛾幼蟲的取食可能受到影響。

圖3 蘋果蠹蛾為害后核桃果皮次生代謝物質(zhì)含量與防御酶活性的變化Fig.3 Changes of secondary metabolite content and defense enzyme activities in walnut husk after feeding by Cydia pomonella

2.2.2 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮類黃酮含量的影響 由圖3b 可知，蘋果蠹蛾為害不同時間，與對照相比每個時間點的類黃酮的含量均增加，其含量的表達趨勢逐漸上升。在取食24 h 時與對照相比類黃酮含量差異顯著（P＜0.05），其含量為8.47 mg·g-1，是對照的1.21 倍，在為害72 h 時類黃酮含量達到最高為9.95 mg·g-1，是對照的1.41 倍。由此可知蘋果蠹蛾為害不同時間后類黃酮的大量合成，可能是因為類黃酮參與對蘋果蠹蛾的防御所導致。

2.2.3 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮單寧含量的影響

由圖3c 可知，蘋果蠹蛾為害時間不同，核桃果皮單寧含量不同，其單寧含量呈先增加后降低的趨勢。在為害12 h 時，與對照相比差異顯著（P＜0.05），單寧含量為對照的1.26 倍，在為害24 h 時，單寧含量達到最高，為4.11 mg·g-1，是對照的1.33 倍，進一步說明在為害24 h 時，核桃果皮可能已產(chǎn)生抗蟲性能。在為害12～48 h 內(nèi)，單寧的含量均顯著高于對照（P＜0.05），但在為害72 h 時，與對照相比單寧含量無顯著差異（P＞0.05），且含量是對照的97%。

綜上所述，蘋果蠹蛾為害不同時間點，核桃果皮次生代謝物的含量變化趨勢不同，可見核桃果皮中的不同次生代謝物在蘋果蠹蛾脅迫時均產(chǎn)生相應(yīng)的抗性。

2.3 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮防御酶活性的影響

2.3.1 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮CAT 活性的影響

通過對核桃果皮CAT 活性的測定，由圖3d 可知，隨著取食時間的推移CAT 活性呈先增加后降低再增加的趨勢。由于蘋果蠹蛾的取食誘導，核桃果皮CAT 的活性迅速增加，在為害12 h 時，與對照相比CAT 活性差異顯著（P＜0.05），在為害24 h 時，雖然CAT 活性增加，但是與對照相比無顯著差異（Pc0.05），在為害36～48 h 內(nèi)，與對照相比CAT 活性均顯著降低（P＜0.05），在為害36 h 時，CAT 活性達最低值（24.65 U·min-1·g-1），在為害72 h 時，CAT 活性達峰值為55.97 U·min-1·g-1，是對照的1.45倍，差異水平達到顯著（P＜0.05）。

2.3.2 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮POD 活性的影響

根據(jù)圖3e 所示，蘋果蠹蛾為害不同時間后，核桃果皮中POD 的活性具有顯著影響。在為害0～36 h 內(nèi)迅速降低，在為害36 h時，POD 活性降到最低值為12.89 U·min-1·g-1，差異水平顯著（P＜0.05），在為害48～72 h 內(nèi)，POD 活性迅速增加，均高于對照，與對照相比均差異顯著（P＜0.05），在為害72 h 時，POD 活性達到峰值為 66.44 U·min-1·g-1， 是對照的1.62 倍。

2.3.3 蘋果蠹蛾為害對核桃果皮SOD 活性的影響

通過對核桃果皮中SOD 活性的測定，根據(jù)圖3f 可知，核桃果皮應(yīng)對蘋果蠹蛾不同時間的取食脅迫時，體內(nèi)的SOD 活性迅速提升，在為害24 h 時達到峰值623.69 U·g-1，是對照的1.98 倍，之后SOD 的活性有所回落，在取食36 h（329.22 U·g-1）和48 h（335.15 U·g-1）時，核桃果皮中SOD 活性雖高于對照，但與對照相比均無顯著差異（P＞0.05），在取食72 h 時，核桃果皮中SOD活性低于對照，但與對照相比SOD 活性無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，蘋果蠹蛾為害核桃果皮時，核桃果皮防御酶會迅速應(yīng)對，由此可見核桃果皮對蘋果蠹蛾的為害產(chǎn)生明顯的誘導防御反應(yīng)。

3 討論

對于植食性昆蟲而言，取食是唯一獲取生長發(fā)育所需營養(yǎng)的必須途徑，因此植物在面對植食性昆蟲損害與入侵的時候，可通過對營養(yǎng)物質(zhì)含量的調(diào)節(jié)，進而影響植食性昆蟲的生長發(fā)育與繁殖，降低了昆蟲的存活率而獲得抗蟲性[20-22]。在李傳明[22]等人的研究中發(fā)現(xiàn)辣椒（Capsicum annuumLinnaeus）被煙粉虱（Bemisia tabaciGennadius）為害時自身的可溶性糖含量增加，可溶性蛋白含量降低，進而對煙粉虱產(chǎn)生抗性；李勝[23]等人研究表明在頸盲蝽（PachypeltisSp）為害不同時間后，薇甘菊（Mikania micranthaKunth）可溶性糖含量相比對照均顯著上升，可溶性蛋白含量逐漸下降。本研究發(fā)現(xiàn)，蘋果蠹蛾為害后，可溶性糖含量與可溶性蛋白含量均降低，其中可溶蛋白含量在為害24 h 是與對照相比差異顯著，可溶性糖含量與對照相比在為害48 h 時差異顯著。但是對于這些營養(yǎng)物質(zhì)含量與抗蟲的相關(guān)性，目前無絕對定論[24]。也有研究表明一些刺吸式的昆蟲如蝽類，此昆蟲的唾液酶中包含一些淀粉酶、蛋白酶等，有助于將食物進行體外消化，將淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖最終分解為葡萄糖[25]。因此對于蘋果蠹蛾為害后核桃果皮中可溶性糖與可溶性蛋白含量的變化是植物自身調(diào)節(jié)還是由于某些物質(zhì)的分解所導致，有待進一步研究。

在植物體內(nèi)含有一類結(jié)構(gòu)復雜、種類較多的次生代謝物質(zhì)，這類物質(zhì)不能直接參與植物的生長發(fā)育，但是在植食性昆蟲為害時，可有效抑制、干擾昆蟲的一些交配、取食行為，同時也可以吸引天敵，進而誘殺。因此在植物防御植食性昆蟲為害時發(fā)揮重要作用，也是衡量植物抗性的重要指標[26-27]。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)剛竹毒蛾（Pantana phyllostachysaeChao）為害毛竹（Phyllostachys edulisHouz）葉片時，單寧與類黃酮的含量均顯著上升；馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatusWalker）為害馬尾松（Pinus massonianaLamb）后，其葉片中的單寧含量顯著升高；當甜櫧（Castanopsis eyreiTotch ） 被紅腹柄天牛（Aphredisinm faldermannii rufiventrisGressitt）為害后，其植物體內(nèi)的類黃酮含量顯著升高[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)在蘋果蠹蛾為害不同時間后單寧含量在12～48 h 均顯著高于對照，其中在為害24 h 時單寧含量達到峰值，由此可以推斷此時間點核桃果皮可能產(chǎn)生抗性，抵御蘋果蠹蛾的為害；為害不同時間類黃酮的含量均持續(xù)升高并差異顯著，說明蘋果蠹蛾為害可誘導核桃果皮中類黃酮含量的升高，進而提高核桃果皮對蘋果蠹蛾的抗性。胡桃醌是核桃果皮中主要的次生代謝物之一，其具有抗氧化、抑菌、殺蟲的作用[31]。王雨萌[32]等人研究表明胡桃醌對小菜蛾（Plutella xylostellaLinnaeus）、蚜蟲具有較好的觸殺作用，對白粉虱（Trialeurodes vaporariorumWestwood）成蟲具有胃毒作用。Piskorski[33]等人研究表明當蘋果蠹蛾取食含有胡桃醌的飼料時與對照相比，幼蟲發(fā)育歷期延長，體重減少，當胡桃醌的含量是核桃果皮的兩倍時對幼蟲有毒殺的作用。在本研究中，蘋果蠹蛾取食核桃果皮，因此胡桃醌含量的高低與核桃果皮對蘋果蠹蛾的抗性有關(guān)，故胡桃醌的含量可以作為評價核桃種或品種抗蘋果蠹蛾的指標之一?？梢娫谔O果蠹蛾為害不同時間后，次生代謝物含量均有變化，其在24 ～48 h之間，從單寧、類黃酮和胡桃醌含量的變化趨勢推測這3 種物質(zhì)可能相互協(xié)同，因此本研究從物質(zhì)含量變化的角度揭示核桃果皮受蟲害脅迫后其防御響應(yīng)的機制，但對于更深層次的防御機制需進一步的研究。

植物與病蟲害對抗時，防御酶起著非常重要的作用，能作用昆蟲使昆蟲中毒或者營養(yǎng)失衡[34]。其中CAT、POD、SOD 等防御酶是植物在逆境脅迫下最為關(guān)鍵的酶[35]。CAT 的主要功能是將植物體內(nèi)的H2O2分解，維持植物相關(guān)組織活性；POD與植物體內(nèi)活性氧代謝有關(guān)，主要維持植物體內(nèi)自由基平衡，同時參與木質(zhì)素合成，在植物抗病蟲害中起著重要作用；SOD 的主要功能是植物在逆境條件下清除自由基，延緩植物衰老[36]。陳鵬[37]等人研究表明當二斑葉螨（Tetranychus cinnabarinusKoch）為害草莓（Fragaria ananassaDuch）葉片不同時間時，SOD 活性呈先上升后降低的趨勢；母小慶[38]等人研究梨小食心蟲（Grapholita molestaBusck）與蘋果蠹蛾對蘋果果實防御酶活性的影響中表明，在遭受害蟲為害后，SOD 活性隨時間的推移而呈上升趨勢；李勝[23]等人研究表明頸盲蝽為害薇甘菊后，隨著時間的推移，POD與CAT 活性呈先上升后下降的趨勢，而SOD 呈先降低后上升再降低的趨勢?？梢娂闹髦参锱c植食性昆蟲不同，防御酶活性趨勢也有較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)蘋果蠹蛾為害核桃果皮后，SOD 活性先上升，在為害24 h 時達到峰值，之后活性逐漸降低；CAT 活性呈先上升后降低再上升的趨勢；POD 活性呈先降低后升高的趨勢，CAT 與POD 均在在為害72 h 是達到峰值。由此可見蘋果蠹蛾為害脅迫會引起核桃果皮酶促反應(yīng)中相關(guān)酶活性的變化，進而抵御蘋果蠹蛾的為害。從防御酶活性變化趨勢推測SOD、CAT 與POD 可能存在拮抗作用，但對于防御酶相互作用的分子機制需進一步研究。

近年來農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展結(jié)構(gòu)的不斷調(diào)整與果園管理模式的改變，蘋果蠹蛾已在我國各大果區(qū)嚴重發(fā)生，尤其在核桃園區(qū)中擴散面積呈上升趨勢。因此本研究明確蘋果蠹蛾為害后，可誘導核桃果皮營養(yǎng)物質(zhì)與次生代謝物質(zhì)的含量、防御酶活性的變化，進而從物質(zhì)含量變化的角度揭示核桃果皮受蘋果蠹蛾為害后其防御的響應(yīng)機制。由于植物自身在應(yīng)對生物與非生物脅迫時，相關(guān)防御體系、代謝途徑形式多樣化，因此在今后的研究中從微觀代謝途徑的變化進一步研究，探究植物應(yīng)對蟲害脅迫時所產(chǎn)生的防御機制，為蘋果蠹蛾的綠色防控奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)蘋果蠹蛾為害誘導核桃果皮在營養(yǎng)物質(zhì)、次生代謝物質(zhì)以及防御酶活性方面產(chǎn)生防御響應(yīng)。其中單寧含量與CAT、POD、SOD活性在蘋果蠹蛾為害12 h 時較對照差異顯著（P＜0.05）；可溶性蛋白、胡桃醌以及類黃酮含量在蘋果蠹蛾為害24 h 時較對照差異顯著（P＜0.05）；可溶性糖含量在蘋果蠹蛾為害48 h 時較對照差異顯著（P＜0.05）。為之后核桃抗蟲品種的選育提供科學的理論依據(jù)。