miR-27a-3p靶向Rnd3對氧糖剝奪/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響

李俊杰 白文婭 陳文棟 楊偉 邵建林

昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科（昆明 650032）

腦缺血-再灌注損傷（cerebral ischemia reperfu?sion injury，CI-RI）是發(fā)生于缺血性腦卒中后由于血流再灌注所致的一種繼發(fā)性腦損傷。CI-RI 發(fā)病機制復雜，涉及多種病理機制，如炎癥反應、氧化損傷、胞內(nèi)鈣離子超載、線粒體功能障礙和神經(jīng)元凋亡等［1-3］。其中，神經(jīng)細胞凋亡已被證實是再灌注早期加重缺血部位腦組織損傷的主要因素之一［4］。MicroRNAs（miRNAs）是一類能特異性地與mRNA的3'-非翻譯區(qū)結合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，參與調(diào)控CI-RI所致的氧化損傷、血腦屏障破壞、細胞凋亡等病理過程［5］。前期研究的測序及驗證結果［6］發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p在缺血-再灌注損傷的大鼠腦組織中表達下調(diào)，生物信息學預測發(fā)現(xiàn)Rho家族GTP酶3（Rnd3）可能為其下游的靶基因，且Rnd3在缺血腦組織中表達上調(diào)。然而，miR-27a-3p 能否通過調(diào)控Rnd3 參與CI-RI 的病理過程目前尚未有研究報道。因此，本研究擬通過體外實驗探討miR-27a-3p 能否通過靶向調(diào)控Rnd3 的表達參與大鼠PC12神經(jīng)細胞的OGD/R損傷過程。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 PC12 神經(jīng)細胞株和293 T細胞株購自中國科學院昆明動物研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國HyClone公司；CCK-8 試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所；miR-27a-3p、Rnd3、U6 和GAPDH 引物購自北京擎科生物公司；miRNA 和mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國GeneCopoeia 生物公司；慢病毒購自上海吉凱基因科技公司；miR-27a-3p Mimic、miR-27a-3p Inhibitor 及其相應陰性對照的載體質(zhì)粒、Rnd3 干擾片段和熒光素酶相關質(zhì)粒均購自廣州復能基因有限公司；AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD 公司；Cleaved-Caspase-3（C-caspase-3）抗體購自美國CST 公司；Bax 和β-Actin 抗體購自英國Abcam 公司；Bcl-2 抗體購自美國GeneTex 公司；HRP 標記的第二抗購自美國Sigma 公司；ECL顯影液購自美國Thermo Fisher 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及OGD/R 模型制備 PC12 細胞復蘇后以104個/孔的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，在添加有10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。每2 d 換1 次液，培養(yǎng)箱環(huán)境為95%空氣+ 5% CO2，溫度為37 ℃。培養(yǎng)7 d 后，PC12 細胞用于后續(xù)實驗。將293 T 細胞接種于添加10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用于雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐８鶕?jù)先前報道的方法［7］，將PC12 細胞接種于無糖培養(yǎng)基中，在37 ℃低氧（1%O2+ 94% N2+ 5% CO2）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，之后將培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)基，于37 ℃兩氣培養(yǎng)箱（95%空氣+5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)后制備OGD/R模型。

1.2.2 最適復氧時間點的篩選 取對數(shù)期生長的細胞，接種于96 孔板，隨機分為對照組（Control，正常培養(yǎng)）、氧糖剝奪2 h 分別復氧3、6、9 和12 h 的OGD/R 模型組，每組3 復孔，分別檢測各時間點的細胞活力，胞內(nèi)miR-27a-3p 和Rnd3 mRNA 的表達，選擇合適的復氧時間點繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染和實驗分組 將PC12 細胞按104個/孔的密度接種于96 孔板，當細胞融合度達到80%后，按照生產(chǎn)商說明書，將包裝有miR-27a-3p Mimic、miR-27a-3p Inhibitor及其相應陰性對照（miR-27a-3p Mimic-NC 和miR-27a-3p Inhibitor-NC）、Rnd3干擾片段（shRnd3）及其陰性對照（shRnd3-NC）的載體慢病毒對PC12 細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h 后制備OGD/R 模型。根據(jù)實驗需求，每組3 復孔，分為Control 組（正常培養(yǎng)的細胞）、OGD/R 組（制備OGD/R 模型）、Mimic-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-27a-3p Mimic-NC 后制備OGD/R 模型）、Mimic 組（轉(zhuǎn)染miR-27a-3p Mimic 后制備OGD/R 模型）、Inhibitor-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-27a-3p Inhibitor-NC 后制備OGD/R模型）、Inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-27a-3p Inhibitor后制備OGD/R 模型）、shRnd3-NC 組（轉(zhuǎn)染shRnd3-NC 后制備OGD/R 模型）、shRnd3 組（轉(zhuǎn)染shRnd3 后制備OGD/R 模型）和shRnd3+Inhibitor 組（共轉(zhuǎn)染shRnd3和miR-27a-3p Inhibitor 后制備OGD/R 模型）。

1.2.4 CCK?8 法檢測細胞活力 在各組每孔細胞中加入10 μL 的 CCK-8 溶液，37 ℃孵育1 h 后用酶標儀測定450 nm 的吸光度。細胞活力計算公式為：細胞活力=（實驗細胞孔OD450值-空白細胞孔OD450值）/（正常細胞孔OD450值-空白細胞孔OD450值）×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 Annexin VFITC/PI 試劑盒用于檢測細胞的凋亡。收獲104個細胞后，每孔分別加入5 μL 的Annexin V-FITC 和10 μL 的PI 試劑溶液后進行避光反應，持續(xù)15 min入400 μL 1×的PBS 緩沖液后，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR?27a?3p和Rnd3 的靶向關系 利用TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測miR-27a-3p 與Rnd3 的結合區(qū)域和位點。分別構建Rnd3 3'-UTR 野生型（Rnd3/Wt）和突變型（Rnd3/Mut）的質(zhì)粒，并將其分別與miR-27a-3p Mimic-NC（NC）和miR-27a-3p Mimic（Mimic）利用脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染入293 T 細胞，利用雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)于48 h 后對海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶活性進行測定。以螢火蟲熒光素酶為對照，計算熒光素酶的相對酶活性。

1.2.7 RT?qPCR 檢測細胞內(nèi)miR?27a?3p 和Rnd3 mRNA 的表達 TRIzol 法提取細胞內(nèi)的總RNA，利用試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進行RT-qPCR 擴增。miR-27a-3p 上游引物：5′-TTCA?CAGTGGCTAAGTTCCGC-3′，下游引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；Rnd3上游引物：5′-GCAAGATAGTAGTGGTGGGCG-3′，下游引物：5′-TCTGGGTAAGAGAGGGGACGG-3′；U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物5′-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-3′。采用2-△△Ct法計算miR-27a-3p 和Rnd3 分別相對于各自內(nèi)參基因的表達量。

1.2.8 Western blot 檢測細胞內(nèi)Rnd3 和凋亡相關分子的蛋白表達 利用RIPA 裂解液裂解和提取各組細胞中的總蛋白后測定蛋白濃度。經(jīng)電泳分離，轉(zhuǎn)膜和封閉處理后分別加入Rnd3（1∶100）、Cleaved-caspase-3（1∶500）、Bax（1∶200）、Bcl-2（1∶100）和β-actin（1∶500）的第一抗體4 °C 孵育過夜。TBST 洗膜后加入HRP 標記的第二抗體37 °C 孵育1 h，ECL 顯影后采集圖像分析灰度值和計算各蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，結果以均數(shù)±標準差表示。多組比較采用單因素方差分析并進行Tukey 事后檢驗，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 復氧不同時刻細胞的活力和胞內(nèi)miR?27a?3p、Rnd3 mRNA 的表達 與Control 組比較，復氧后6、9 和12 h 時細胞的活力、miR-27a-3p 的表達水平均明顯降低（P< 0.05），12 h 最低；Rnd3 mRNA表達水平在3、6 和12 h 時均明顯升高（P< 0.05），12 h 時表達最高，在9 h 時表達無明顯變化；因此，選擇復氧12 h 進行后續(xù)實驗，見表1。

表1 復氧不同時刻細胞的活力和胞內(nèi)miR-27a-3p、Rnd3 mRNA 的表達Tab.1 Cell viability and the expression of miR-27a-3p and Rnd3 mRNA at different time of reoxygenation ±s

表1 復氧不同時刻細胞的活力和胞內(nèi)miR-27a-3p、Rnd3 mRNA 的表達Tab.1 Cell viability and the expression of miR-27a-3p and Rnd3 mRNA at different time of reoxygenation ±s

注：與Control組比較，*P < 0.05

組別Control組復氧3 h組復氧6 h組復氧9 h組復氧12 h組F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.10 2.56 ± 0.14*2.59 ± 0.08*1.36 ± 0.04 5.85 ± 0.14*323.10< 0.001細胞的活力（%）100.00 ± 2.27 90.46 ± 3.83 66.30 ± 2.61*76.80 ± 3.18*62.66 ± 2.82*28.08< 0.001 miR-27a-3p 1.01 ± 0.08 0.45 ± 0.01*0.31 ± 0.02*0.49 ± 0.02*0.08 ± 0.01*79.10< 0.001

2.2 上調(diào)miR?27a?3p 和下調(diào)miR?27a?3p 對OGD/R 損傷細胞的活力、胞內(nèi)凋亡相關蛋白的表達和細胞總凋亡率的影響 與Control 組比較，OGD/R組PC12 細胞內(nèi)miR-27a-3p 的表達下調(diào)、細胞的活力降低、C-caspase-3 和Bax 的蛋白表達升高、Bcl-2蛋白表達降低、細胞的總凋亡率增加（P< 0.05）；與Mimic-NC 組比較，Mimic 組細胞內(nèi)miR-27a-3p的表達上調(diào)、細胞的活力增加、C-caspase-3 和Bax的蛋白表達降低、Bcl-2 蛋白表達升高、細胞的總凋亡率降低（P< 0.05）；與Inhibitor-NC 組比較，Inhibitor 組細胞內(nèi)miR-27a-3p 的表達下調(diào)、Ccaspase-3 和Bax 的蛋白表達升高、細胞的總凋亡率增加（P< 0.05），細胞的活力和Bcl-2 蛋白表達無明顯變化（P> 0.05），見表2 和圖1、2。

圖1 各組凋亡相關蛋白C-caspase-3、Bax 和Bcl-2 表達的Western blot 圖Fig.1 Western blot of apoptosis-related proteins C-caspase-3，Bax and Bcl-2 in each group

圖2 各組細胞凋亡率的流式細胞術檢測圖Fig.2 Flow cytometry analysis of apoptosis rate in each group

表2 各組細胞的活力，miR-27a-3p、凋亡相關蛋白的表達和細胞總凋亡率Tab.2 Cell viability，the expression of miR-27a-3p、apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group ±s

表2 各組細胞的活力，miR-27a-3p、凋亡相關蛋白的表達和細胞總凋亡率Tab.2 Cell viability，the expression of miR-27a-3p、apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group ±s

注：與Control組比較，*P < 0.05；與Mimic-NC組比較，△P < 0.05；與Inhibitor-NC組比較，▲P < 0.05

組別Control組OGD/R組Mimic-NC組Mimic組Inhibitor-NC組Inhibitor組F值P值細胞總凋亡率（%）3.55 ± 0.14 11.25 ± 0.09*12.44 ± 0.76 5.28 ± 0.43△11.93 ± 0.55 15.67 ± 0.50▲95.94< 0.001 miR-27a-3p 1.02 ± 0.14 0.27 ± 0.00*0.23 ± 0.01 0.70 ± 0.06△0.23 ± 0.01 0.15 ± 0.01▲30.47< 0.001細胞的活力（%）100.00 ± 1.21 59.01 ± 1.71*60.95 ± 3.08 74.84 ± 2.25△59.95 ± 2.29 53.58 ± 3.04 52.92< 0.001 C-caspase-3 0.42 ± 0.02 1.00 ± 0.04*0.79 ± 0.07 0.49 ± 0.06△0.82 ± 0.05 1.17 ± 0.08▲24.28< 0.001 Bax 0.28 ± 0.04 0.78 ± 0.07*0.89 ± 0.03 0.40 ± 0.06△0.77 ± 0.05 1.14 ± 0.07▲33.10< 0.001 Bcl-2 0.96 ± 0.01 0.41 ± 0.03*0.42 ± 0.02 0.69 ± 0.07△0.37 ± 0.02 0.30 ± 0.08 29.78< 0.001

2.3 miR?27a?3p靶向調(diào)控Rnd3的表達 與Control組比較，OGD/R 組PC12 細胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的表達均上調(diào)（P< 0.05）；與Mimic-NC 組比較，Mimic 組細胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的表達均下調(diào)（P< 0.05）；與Inhibitor-NC 組比較，Inhibitor 組細胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的表達均上調(diào)（P< 0.05），見表3 和圖3。TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測結果顯示miR-27a-3p與Rnd3存在緊密結合位點，見圖4。雙熒光素酶報告基因結果顯示，與Rnd3/Wt和Mimic-NC共轉(zhuǎn)染組比較，Rnd3/Wt 和Mimic 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對活性降低（P< 0.01）；與Rnd3/Mut 和Mimic-NC共轉(zhuǎn)染組比較，Rnd3/Mut和Mimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05），證實miR-27a-3p 能靶向調(diào)控Rnd3 的表達，見表4。

圖3 各組細胞內(nèi)Rnd3 蛋白表達的Western blot 圖Fig.3 Western blot of Rnd3 protein in each group

圖4 TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測的miR-27a-3p 與Rnd3 之間的結合位點Fig.4 Binding sites between miR-27a-3p and Rnd3 predicted by TargetScan database

表3 上調(diào)miR-27a-3p 和下調(diào)miR-27a-3p 對Rnd3 mRNA和蛋白表達的影響Tab.3 Effects of up-regulation and down-regulation of miR-27a-3p on the expression of Rnd3 mRNA and protein±s

表3 上調(diào)miR-27a-3p 和下調(diào)miR-27a-3p 對Rnd3 mRNA和蛋白表達的影響Tab.3 Effects of up-regulation and down-regulation of miR-27a-3p on the expression of Rnd3 mRNA and protein±s

注：與Control組比較，*P < 0.05；與Mimic-NC組比較，△P < 0.05；與Inhibitor-NC組比較，▲P < 0.05

Rnd3 蛋白0.14 ± 0.01 0.64 ± 0.05*0.64 ± 0.05 0.45 ± 0.04△0.56 ± 0.05 1.05 ± 0.08▲34.14< 0.001組別Control組OGD/R組Mimic-NC組Mimic組Inhibitor-NC組Inhibitor組F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.08 3.12 ± 0.11*3.72 ± 0.44 1.71 ± 0.14△3.32 ± 0.12 5.81 ± 0.14▲63.35< 0.001

表4 miR-27a-3p 與Rnd3 結合的各組細胞的熒光素酶相對活性Tab.4 Relative luciferase activity of miR-27a-3p combined with Rnd3 in each group±s

表4 miR-27a-3p 與Rnd3 結合的各組細胞的熒光素酶相對活性Tab.4 Relative luciferase activity of miR-27a-3p combined with Rnd3 in each group±s

注：與Rnd3/Wt+Mimic-NC組比較，*P < 0.05

組別Rnd3/Wt+Mimic-NC組Rnd3/Wt+Mimic組Rnd3/Mut+Mimic-NC組Rnd3/Mut+Mimic組F值P值熒光素酶相對活性1.00 ± 0.02 0.73 ± 0.06*1.01 ± 0.04 1.00 ± 0.05 9.303< 0.001

2.4 Rnd3 干擾片段的篩選結果 與shRnd3-NC組比較，shRnd3-002、shRnd3-003 和shRnd3-004 組細胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的相對表達量均降低（P< 0.05）；與shRnd3-003 和shRnd3-004 組比較，shRnd3-002 組細胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的相對表達量均降低（P< 0.05），因此選擇shRnd3-002 干擾片段進行后續(xù)下調(diào)Rnd3 表達的實驗，見表5和圖5。

圖5 各Rnd3 干擾片段作用下Rnd3 蛋白表達的Western blot 圖Fig.5 Western blot of Rnd3 protein expression with the various Rnd3 interference fragments

表5 各Rnd3 干擾片段對Rnd3 mRNA 和蛋白表達的影響Tab.5 Effects of Rnd3 interference fragments on the expression Rnd3 mRNA and protein±s

表5 各Rnd3 干擾片段對Rnd3 mRNA 和蛋白表達的影響Tab.5 Effects of Rnd3 interference fragments on the expression Rnd3 mRNA and protein±s

注：與shRnd3-NC組比較，*P < 0.05；與shRnd3-003組比較，△P <0.05；與shRnd3-004組比較，▲P < 0.05

Rnd3 蛋白0.87 ± 0.12 0.97 ± 0.12 1.08 ± 0.19 0.38 ± 0.03*△▲0.66 ± 0.03*0.63 ± 0.08*5.63< 0.001組別Control組shRnd3-NC組shRnd3-001組shRnd3-002組shRnd3-003組shRnd3-004組F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.11 1.03 ± 0.04 1.28 ± 0.04 0.07 ± 0.02*△▲0.63 ± 0.03*0.47 ± 0.09*47.65< 0.001

2.5 下調(diào)Rnd3 對OGD/R 損傷PC12 細胞活力和細胞凋亡的影響以及下調(diào)miR?27a?3p 的逆轉(zhuǎn)作用 與Control 組比較，OGD/R 組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達均升高、細胞的活力降低、C-caspase-3 和Bax 的蛋白表達升高、Bcl-2 蛋白表達降低、細胞總凋亡率增加（P< 0.05）；與shRnd3-NC 組相比，shRnd3 組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達均降低、細胞的活力增加、C-caspase-3 和Bax 的蛋白表達降低、Bcl-2蛋白表達升高、細胞總凋亡率降低（P< 0.05）；與shRnd3 比較，shRnd3+Inhibitor 組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達均升高、細胞的活力降低、C-caspase-3和Bax 的蛋白表達升高、細胞總凋亡率增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。下調(diào)miR-27a-3p 逆轉(zhuǎn)了下調(diào)Rnd3 的作用，進一步證明miR-27a-3p 靶向調(diào)控 Rnd3 的表達，見表6、7和圖6、7。

圖6 各組Rnd3 蛋白和凋亡相關蛋白C-caspase-3、Bax 和Bcl-2 表達的Western blot 圖Fig.6 Western blot of Rnd3 protein and apoptosis-related proteins C-caspase-3，Bax and Bcl-2 in each group

圖7 各組細胞凋亡率的流式細胞術檢測圖Fig.7 Flow cytometry analysis of apoptosis rate in each group

表6 各組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達量Tab.6 Expression of Rnd3 mRNA and protein in each group±s

表6 各組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達量Tab.6 Expression of Rnd3 mRNA and protein in each group±s

注：與Control組比較，*P < 0.05；與shRnd3-NC組比較，△P < 0.05；與shRnd3組比較，▲P < 0.05

Rnd3 蛋白0.11 ± 0.02 0.71 ± 0.05*0.69 ± 0.02 0.22 ± 0.03△0.52 ± 0.07▲41.17< 0.001組別Control組OGD/R組shRnd3-NC組shRnd3組shRnd3+Inhibitor組F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.05 1.52 ± 0.06*1.02 ± 0.06 0.12 ± 0.00△1.02 ± 0.02▲127.40< 0.001

表7 各組細胞的活力、凋亡相關蛋白的表達和細胞總凋亡率Tab.7 Cell viability，the expression of apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group±s

表7 各組細胞的活力、凋亡相關蛋白的表達和細胞總凋亡率Tab.7 Cell viability，the expression of apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group±s

注：與Control組比較，*P < 0.05；與shRnd3-NC組比較，△P < 0.05；與shRnd3組比較，▲P < 0.05

組別Control組OGD/R組shRnd3-NC組shRnd3組shRnd3+Inhibitor組F值P值細胞總凋亡率（%）3.38 ± 0.16 11.59 ± 0.69*12.10 ± 0.73 4.09 ± 0.35△8.96 ± 0.85▲44.81< 0.001細胞的活力（%）100.00 ± 3.08 62.86 ± 2.05*64.77 ± 3.53 88.12 ± 2.74△68.16 ± 2.13▲35.34< 0.001 C-caspase-3 0.07 ± 0.00 0.64 ± 0.04*0.49 ± 0.03 0.17 ± 0.01△0.62 ± 0.04▲81.70< 0.001 Bax 0.14 ± 0.01 0.92 ± 0.04*0.74 ± 0.03 0.27 ± 0.01△0.98 ± 0.04▲150.8< 0.001 Bcl-2 0.68 ± 0.02 0.36 ± 0.01*0.18 ± 0.01 0.49 ± 0.02△0.46 ± 0.02 124.5< 0.001

3 討論

CI-RI 常常給患者的神經(jīng)功能帶來不可逆的損害，然而，目前治療方法有限。MicroRNAs 能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達，并參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如缺血性卒中［8］、膠質(zhì)瘤［9］、阿爾茨海默?。?0］等。神經(jīng)細胞的凋亡是CI-RI 后的常見病理事件，與后期的神經(jīng)功能缺損密切相關。CI-RI 早期促凋亡蛋白如Cleaved Caspase-3、Bax 等的大量表達都會加重細胞的凋亡［11］。

本研究在CI-RI 的體外模型中觀察到PC12 神經(jīng)細胞在OGD/R 后細胞活力下降，細胞的凋亡增加。同時，OGD/R 后胞內(nèi)的miR-27a-3p 表達下調(diào)，由此推測miR-27a-3p 可能參與了細胞凋亡的過程。miR-27a-3p 是一種具有多種調(diào)控功能的miRNA，已有研究［12］表明，miR-27a-3p 參與了多種疾病的細胞凋亡調(diào)控過程。在缺血再灌注損傷的心肌細胞中，miR-27a-3p 的上調(diào)通過抑制自噬介導了七氟烷的抗凋亡作用。此外，miR-27a-3p 的上調(diào)通過靶向抑制LITAF 和TLR4 通路，減輕腦缺血-再灌注損傷大鼠的炎癥反應和細胞凋亡［13］。另有研究［14］表明，miR-27a-3p 的上調(diào)可減輕LPS誘導的炎癥反應，并通過靶向調(diào)控OXSR1 表達抑制腎小管上皮HK-2 細胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-27a-3p 提高了OGD/R 損傷后的細胞活力和抑制了細胞的凋亡，而下調(diào)miR-27a-3p 則作用相反，表明在OGD/R 損傷模型中，miR-27a-3p 能抑制細胞凋亡而發(fā)揮保護作用。

生物信息學預測結果顯示Rnd3 的3'-UTR 區(qū)具有miR-27a-3p 的結合位點，雙熒光素酶實驗證實miR-27a-3p 能夠靶向作用于Rnd3，此外，上調(diào)miR-27a-3p 能使其表達下調(diào)，下調(diào)miR-27a-3p 則使其表達上調(diào)，進一步證明了miR-27a-3p 能夠靶向調(diào)控Rnd3 的表達。Rnd3 也被稱為RhoE，是一種小GTP 結合蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可大量表達［15］。已有研究［16-17］發(fā)現(xiàn)，Rnd3 的上調(diào)具有促進細胞凋亡的作用，而Rnd3 基因的缺失則抑制了神經(jīng)細胞的凋亡。此外，研究［18］證實Rnd3 可通過激活IRAK/ERK/NF-KB 信號通路，加重乙醇誘導的星形膠質(zhì)細胞的細胞凋亡。本研究結果顯示，OGD/R 損傷后細胞凋亡加劇，而胞內(nèi)Rnd3 的表達明顯升高。因此，在OGD/R 損傷的PC12 細胞中，miR-27a-3p 的抗凋亡作用可能與其對Rnd3 的抑制作用有關。

為了進一步證實Rnd3 的作用及其是否參與了miR-27a-3p 的抗凋亡機制，筆者構建了特異性的shRNA 下調(diào)PC12 細胞中Rnd3 的表達。結果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRnd3 后，胞內(nèi)Rnd3 的表達降低，同時，細胞的活力提高、細胞凋亡下降，表明下調(diào)Rnd3具有抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。然而，下調(diào)miR-27a-3p 則消除了miR-27a-3p 對Rnd3 的抑制效應，在轉(zhuǎn)染shRnd3 的情況下使Rnd3 的表達上調(diào)，逆轉(zhuǎn)了shRnd3 產(chǎn)生的抗凋亡作用，導致shRnd3 不能進一步減輕OGD/R 引發(fā)的細胞損傷，由此表明，miR-27a-3p 通過抑制Rnd3 的表達減輕了細胞凋亡。

綜上所述，上調(diào)miR-27a-3p 對OGD/R 損傷的PC12 神經(jīng)細胞具有保護作用，其作用機制是通過靶向抑制Rnd3 的表達進而抑制細胞凋亡。本研究將為CI-RI 損傷治療靶點的選擇提供理論參考，但也存在一定的局限性，僅僅進行了細胞實驗，缺乏相關動物實驗的證據(jù)，下一步有待進一步通過動物實驗來闡明miR-27a-3p 調(diào)控Rnd3 對CI-RI的影響。

【Author contributions】LI Junjie performed the experiments and wrote the article.BAI Wenya performed the experiments.CHEN Wen?dong and YANG Wei revised the article.SHAO Jianlin designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.