抑制細(xì)胞衰老在骨關(guān)節(jié)炎軟骨再生治療中的研究進(jìn)展

葉啟程 聶萍

【提要】 近年來，細(xì)胞衰老在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展中的作用已成為研究熱點(diǎn)，現(xiàn)有證據(jù)已基本明確軟骨細(xì)胞衰老、間充質(zhì)細(xì)胞（Mesenchymal cells，MSCs）衰老與軟骨修復(fù)異常及骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）的發(fā)生與發(fā)展存在一定因果關(guān)系。定向清除衰老細(xì)胞，促進(jìn)干細(xì)胞的年輕化可有效延緩OA。本文針對細(xì)胞衰老在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展中的病理作用及潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行綜述。細(xì)胞衰老是OA 發(fā)生、發(fā)展中的重要生物學(xué)現(xiàn)象及潛在治療靶點(diǎn)，深入研究其生物學(xué)機(jī)制有助于OA 的早期防治。

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種以軟骨細(xì)胞肥大和凋亡、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解、滑膜炎性浸潤，以及軟骨下骨重塑作為主要病理特征的慢性退行性疾病。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退化、軟骨下骨硬化、骨贅形成，并伴有關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形及活動障礙等，且多發(fā)于膝、髖等負(fù)重關(guān)節(jié)。OA 不是一種獨(dú)特的疾病，而是一種具有不同臨床表型和分子生物學(xué)的異質(zhì)性綜合征，經(jīng)不斷演變，最終導(dǎo)致上述臨床表現(xiàn)[1]。

針對OA 的治療手段目前大多僅為對癥處理，缺乏疾病干預(yù)的有效藥物，絕大部分患者最終仍需通過關(guān)節(jié)置換來緩解疼痛并恢復(fù)關(guān)節(jié)功能。對調(diào)控OA 發(fā)生、發(fā)展分子信號網(wǎng)絡(luò)的研究，有望從根本上解決OA 的防治難題[2]。本文將從細(xì)胞衰老和OA 的機(jī)制，目前已被研究的治療靶點(diǎn)與藥物進(jìn)行綜述，并對潛在的治療靶點(diǎn)進(jìn)行簡單的介紹。

1 細(xì)胞衰老

倫納德·海夫里克（Leonard Hayflick）和保羅·摩爾黑德（Paul Moorhead）于 1961 年首次提到“細(xì)胞衰老”一詞，它是指在特征性的細(xì)胞倍增后出現(xiàn)的不可逆的細(xì)胞生長停滯現(xiàn)象。細(xì)胞衰老被認(rèn)為是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，可導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定的生長停滯狀態(tài)，但能保持代謝活性，現(xiàn)被擴(kuò)展描述為不同應(yīng)激因素誘導(dǎo)的持久性增殖停滯狀態(tài)，是對許多不同的觸發(fā)因素的反應(yīng)，包括DNA 損傷、端粒功能障礙、癌基因激活和細(xì)胞器應(yīng)激，并與腫瘤抑制、組織修復(fù)、胚胎發(fā)生和器官老化等過程相關(guān)[3]。

細(xì)胞衰老可分為復(fù)制性衰老和早衰。復(fù)制性衰老是指端?？s短導(dǎo)致的復(fù)制能力降低的狀態(tài)，而氧化應(yīng)激和DNA 損傷導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯的過早衰老。這類細(xì)胞衰老的典型特征包括p21、p16和p53 的表達(dá)增加，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性和活性氧水平升高。同時，衰老細(xì)胞中衰老相關(guān)分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype，SASP）和促炎細(xì)胞因子的代謝活性和分泌水平也會隨之發(fā)生變化[4]。

1.1 軟骨細(xì)胞衰老與OA

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨（Articular cartilage，AC）中的獨(dú)特細(xì)胞，對細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrixc）的產(chǎn)生和周轉(zhuǎn)至關(guān)重要，細(xì)胞外基質(zhì)占AC 的95%。

軟骨細(xì)胞衰老可能是由兩方面因素共同決定的，包括應(yīng)激誘導(dǎo)（DNA 損傷、氧化應(yīng)激、炎性衰老以及表觀遺傳等）和有限的原位復(fù)制能力。OA 的病理機(jī)制涉及多種關(guān)節(jié)組織和細(xì)胞類型，但軟骨細(xì)胞一直是衰老研究的重點(diǎn)。

目前關(guān)于細(xì)胞衰老和OA 的分子機(jī)制研究主要集中于三個方面：①衰老發(fā)生共同通路的上游調(diào)控機(jī)制；②衰老細(xì)胞產(chǎn)生SASP 的調(diào)控機(jī)制；③衰老細(xì)胞影響周圍健康細(xì)胞的機(jī)制。

1.1.1 細(xì)胞衰老的兩條上游調(diào)控機(jī)制

p53、p16 和p21 在細(xì)胞衰老中的重要作用已被廣泛研究，可分為兩種主要的信號通路：p53/p21 和Rb/p16。許多應(yīng)激刺激可以激活不同的信號通路，并最終通過p53/p21 和/或Rb/p16 通路導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯[4]。盡管這兩種途徑共享幾種常見的調(diào)節(jié)因子，但p16/pRB 途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞生長停滯被認(rèn)為是不可逆的，而p53/p21 途徑誘導(dǎo)的生長停滯是可逆的[5]。

Diekman 等[6]通過小鼠及人體研究發(fā)現(xiàn)，p16的表達(dá)僅僅是軟骨細(xì)胞增殖能力缺失的標(biāo)志之一，而衰老細(xì)胞產(chǎn)生的SASP 才是衰老軟骨細(xì)胞與OA之間的驅(qū)動因素。

1.1.2 SASP 的調(diào)控機(jī)制

衰老的細(xì)胞不僅表現(xiàn)出生長停滯的特征，而且促進(jìn)SASP的產(chǎn)生。SASP影響周圍的細(xì)胞和組織。SASP 中包含一系列細(xì)胞因子、生長因子、蛋白酶、氧化應(yīng)激物質(zhì)等，這些物質(zhì)會對周圍細(xì)胞的增殖、分化和代謝等產(chǎn)生影響[7]。

SASP 的影響主要包括兩個方面：①SASP 中的一些細(xì)胞因子和生長因子可以誘導(dǎo)周圍細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)或者促進(jìn)細(xì)胞分化；②SASP 中的一些蛋白酶和氧化應(yīng)激物質(zhì)可以誘導(dǎo)周圍細(xì)胞凋亡或者損傷[8-9]。

1.1.3 衰老細(xì)胞（Senescent cells，SNCs）對周圍健康細(xì)胞活性的影響

SNCs 通過SASP 對周圍健康細(xì)胞產(chǎn)生影響。SASP 中含有多種生物活性分子，如細(xì)胞因子、生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等，這些分子可以對周圍的健康細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的影響，包括細(xì)胞周期的停滯、細(xì)胞凋亡、DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞枯萎等，最終影響組織的功能和結(jié)構(gòu)[10]。

膝關(guān)節(jié)中的間充質(zhì)細(xì)胞（Mesenchymal cells，MSCs）具有自我更新的能力，可根據(jù)組織特異性分為滑膜、脂肪源性和骨髓源性間充質(zhì)細(xì)胞。已有研究表明，衰老軟骨細(xì)胞可以抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能和增殖，從而促進(jìn)OA 的產(chǎn)生。

此外，近年還發(fā)現(xiàn)一些其他的潛在靶點(diǎn)。Liu等[11]提 出，細(xì) 胞 外 小 泡（Extracellular vesicles，EVs）可以攜帶供體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，并介導(dǎo)細(xì)胞通信，從而在OA 疾病的發(fā)展中發(fā)揮一系列作用，如傳播炎癥、改變代謝和促進(jìn)細(xì)胞衰老，有望作為OA 早期診斷和評估病理類型、嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。經(jīng)修飾和未經(jīng)修飾的EVs 擁有治療OA的潛力，但是仍然面臨許多挑戰(zhàn)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）應(yīng)激是指ER 中蛋白質(zhì)錯誤折疊/未折疊的積累。Wen 等[12]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過影響一系列細(xì)胞的生理功能，參與了OA 的病理變化。靶向ER 應(yīng)激已被證明能夠在體外和體內(nèi)緩解OA 進(jìn)展，ER 應(yīng)激是OA 的一個有吸引力和有前途的靶點(diǎn)。

2 治療策略

細(xì)胞衰老在OA 發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，為研發(fā)靶向衰老細(xì)胞治療OA 的藥物提供了理論依據(jù)。根據(jù)作用方式的不同，目前常用藥物有通過誘導(dǎo)衰老細(xì)胞凋亡的Senolytics（槲皮素、達(dá)沙替尼、USP7抑制劑、ABT263）和通過阻斷SASP 旁分泌的Senmorphics（Nutlin-3a、Canakinumab、CL82198）。此外，近年還有研究提出干細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞等新的治療靶點(diǎn)。

2.1 靶向清除衰老細(xì)胞

衰老細(xì)胞相關(guān)的藥物目前主要有三種：Senolytics、SASP 抑制劑和營養(yǎng)信號調(diào)節(jié)劑，其中以Senolytics 應(yīng)用最為廣泛。

Senolytics 是一種選擇性消除衰老細(xì)胞的藥物，包括達(dá)沙替尼、槲皮素、navitoclax、A1331852、A1155463、非西汀、木犀草素、HSP90 抑制劑等[9]。作為第一代Senolytics 的達(dá)沙替尼，是一種用于治療白血病的化療藥物，后續(xù)被用于治療細(xì)胞衰老[4]。Jeon 等[13]的研究結(jié)果表明，Senolytics 類藥物UBX0101 可以從OA 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物中選擇性去除SNCs。

Miura 等[14]用ABT-263 預(yù)處理OA 患者的滑膜MSCs，結(jié)果表明，在軟骨形成過程中，預(yù)處理的細(xì)胞產(chǎn)生了更多的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原，衰老標(biāo)志物（p16 和p21）和SASP 因子（MMP-13 和IL-6）及Ⅰ型膠原的表達(dá)降低。同樣，Yang 等[15]也發(fā)現(xiàn)ABT263 關(guān)節(jié)內(nèi)注射，改善了創(chuàng)傷后OA 大鼠軟骨和軟骨下骨的病理變化。

此外，近年還發(fā)現(xiàn)一些新的潛在靶點(diǎn)。如軟骨祖細(xì)胞（Cartilage progenitor Cells，CPC）被定義為干細(xì)胞樣細(xì)胞，具有優(yōu)異的自我更新和多向分化潛力，被認(rèn)為是OA 中的主要軟骨修復(fù)劑。CPC在體外或體內(nèi)也可以獲得衰老表型[16]。Dai 等[17]證明了CPC 的衰老和SASP 的形成是相互依賴的，并與關(guān)節(jié)牽張成形術(shù)的不良結(jié)果相關(guān)，通過Senolytics 消除衰老的CPC 可以降低SASP 的形成。

2.2 靶向拮抗SASP

衰老細(xì)胞分泌一些因子或釋放信號分子主動改變周圍環(huán)境，引起組織細(xì)胞發(fā)生衰老，這種現(xiàn)象稱為復(fù)制性衰老相關(guān)分泌表型[18]。與Senolytics優(yōu)先誘導(dǎo)衰老細(xì)胞凋亡不同，Senmorphics 通過抑制SASP 信號通路，以減少旁分泌炎癥因子的釋放和組織損傷來治療OA。目前已發(fā)現(xiàn)多種化合物可以抑制與SASP 相關(guān)的通路而不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。Schieker 等[19]發(fā)現(xiàn)，抗IL-1β 抗體卡納單抗可以顯著降低心血管事件高風(fēng)險人群的膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)置換率。Coryell 等[20]證明了IL-6 受體抑制劑拖珠單抗在治療OA 中有效，目前已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗。Wang 等[21]發(fā)現(xiàn)，注射MMP-13 抑制劑CL82198 可以明顯緩解小鼠半月板韌帶損傷OA 模型中的軟骨退變，提高關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原水平，可抑制軟骨細(xì)胞死亡。此外，還有更多靶向SASP的藥物正在被發(fā)現(xiàn)，例如通過清除活性氧達(dá)到拮抗SASP 效果的石斛堿、鈰納米顆粒等[22-23]。

2.3 激活內(nèi)源性干細(xì)胞再年輕化

干細(xì)胞是未分化的細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)免疫、抵抗炎癥、促進(jìn)血管生成和修復(fù)再生的作用。其他三種類型的干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞，是OA 治療軟骨再生的潛在候選細(xì)胞。ESCs 和iPSCs 都具有本質(zhì)上的多能性特征，可以分化為其他細(xì)胞類型，包括軟骨細(xì)胞。

Murphy 等[24]研究了與年齡相關(guān)的常駐骨骼干細(xì)胞（Skeletal stem cells，SSCs）群體的再生軟骨能力，發(fā)現(xiàn)通過微創(chuàng)手術(shù)刺激成年小鼠四肢關(guān)節(jié)軟骨表面區(qū)域，可以引發(fā)SSCs 的局部擴(kuò)張和再生反應(yīng)。

間充質(zhì)干細(xì)胞在過去幾十年中作為治療OA的一種新興技術(shù)被廣泛探索。根據(jù)現(xiàn)有研究，間充質(zhì)干細(xì)胞可通過干擾細(xì)胞免疫和分泌大量活性化學(xué)物質(zhì)來限制OA 中的軟骨降解[25]。研究發(fā)現(xiàn)，旁分泌機(jī)制是間充質(zhì)干細(xì)胞的主要作用方式。外泌體是已知最小的膜結(jié)合納米囊泡。Zhang 等[26]在小鼠OA 模型中發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可以通過促進(jìn)滑膜巨噬細(xì)胞從M1 到M2 的表型轉(zhuǎn)化來緩解骨關(guān)節(jié)炎。Jin 等[27]在大鼠OA 模型關(guān)節(jié)內(nèi)注射人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow MSCs，BM-MSC）外泌體，BM-MSC 和BM-MSC衍生的外泌體均減輕了軟骨破壞和軟骨下骨重塑。

?amernik 等[28]的研究表明，原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的病理過程伴隨著骨間充質(zhì)干細(xì)胞衰竭，軟骨下骨MSCs 耗竭與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎在病理學(xué)上相關(guān)。通過其潛在的軟骨分化能力、旁分泌作用及免疫調(diào)節(jié)作用，為OA 治療提供了可能[29]。MSCs 對OA 治療的作用是雙重的，包括軟骨生成和免疫調(diào)節(jié)活性。MSCs 不僅具有分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子的能力，還具有免疫調(diào)節(jié)作用[30]。

Wei 等[31]也提出關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSCs 可改善膝關(guān)節(jié)OA 患者的功能并減輕疼痛。不同來源的MSCs 的治療對組織再生有積極影響。同時，多個薈萃分析證明了用于治療OA 的MSCs 移植的安全性和有效性，Peeters 等[32]對治療OA 的自體MSCs進(jìn)行了系統(tǒng)分析，包括平均隨訪21 個月的844 名患者，結(jié)果表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的關(guān)節(jié)內(nèi)注射在治療骨關(guān)節(jié)炎中是有效和安全的。

根據(jù)目前的信息，就MSCs 的最終有效性得出結(jié)論還為時過早。仍需要額外的放射學(xué)和組織學(xué)數(shù)據(jù)，以及更多的臨床試驗數(shù)據(jù)支持。同時，間充質(zhì)干細(xì)胞對OA 的潛在治療機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

2.4 靶向Sirtuins 治療OA

沉默信息調(diào)節(jié)蛋白（Silent information regulator proteins，Sirtuins）是NAD+依賴性脫乙酰酶家族，從細(xì)菌到人類高度保守，控制各種細(xì)胞過程，包括DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期、線粒體穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞衰老。已經(jīng)有證據(jù)表明，Sirtuin 家族成員（sirt1、sirt6）與OA 的發(fā)展相關(guān)，可能是治療OA 的新靶點(diǎn)。Yan 等[33]通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過microRNA-34a/SIRT1 途徑調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的衰老和增殖。此外，Wu 等[34]發(fā)現(xiàn)，Sirt6 的過度表達(dá)可以通過減少炎癥反應(yīng)和軟骨細(xì)胞衰老來阻止OA 的發(fā)展。同樣，Ji 等[35]使用來自O(shè)A 患者和對照組的臨床樣本，發(fā)現(xiàn)Sirt6 在軟骨組織和軟骨細(xì)胞中顯著降低，并在動物模型中驗證了Sirt6 可以預(yù)防OA，并強(qiáng)調(diào)了Sirt6 在軟骨細(xì)胞衰老中的關(guān)鍵作用，表明Sirt6 可能是OA 的新的潛在治療靶點(diǎn)。

3 總結(jié)與展望

現(xiàn)有研究表明，衰老細(xì)胞可能通過SASP 和改變關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境來參與OA 的發(fā)病和進(jìn)展。此外，關(guān)節(jié)內(nèi)衰老的骨骼細(xì)胞和滑膜細(xì)胞之間的相互作用對OA 的發(fā)生至關(guān)重要。但是，目前相關(guān)機(jī)制的研究并不完善，例如關(guān)節(jié)組織中負(fù)責(zé) OA 發(fā)生、發(fā)展的特異衰老細(xì)胞和特異SASP因子尚未完全闡明[11]。

OA 的傳統(tǒng)治療包括非手術(shù)治療以及外科治療，但是并不能降低疾病早期的發(fā)病率，也不能防止軟骨退化或促進(jìn)再生。新興療法（如干細(xì)胞治療）也存免疫排斥和致瘤性等風(fēng)險。最近，包括Senolytics 和Senmorphics 在內(nèi)的幾種治療藥物已成功研發(fā)，并陸續(xù)在細(xì)胞和動物實驗中驗證。越來越多的證據(jù)表明，靶向衰老細(xì)胞將有助于治療OA 這類與年齡相關(guān)的慢性疾病。