皮膚衰老相關(guān)的生物標(biāo)志物及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展

王玨 王佳琦 陳珩 邱馨毅 郭曉晴 周栩

【提要】 皮膚老化是人體衰老的直接表現(xiàn)，是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，表現(xiàn)為皮膚結(jié)構(gòu)、功能和外觀的累積性變化，如皺紋增多、松弛、彈性減退、毛細(xì)血管擴(kuò)張、皮膚色素異常等，延緩皮膚老化對(duì)維護(hù)人們的心理健康和皮膚的正常生理功能具有重要意義。皮膚老化是一個(gè)高度復(fù)雜且尚未完全明了的過(guò)程，目前還無(wú)法根據(jù)單一的生物標(biāo)志物明確檢測(cè)和評(píng)估衰老。本文對(duì)衰老相關(guān)的生物標(biāo)志物及其作用機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)闡述。

皮膚是人體最大的器官，占體質(zhì)量的10%～15%，是人體與外部環(huán)境之間的首要防御屏障，具有重要的功能，包括保護(hù)、體溫調(diào)節(jié)、感知、分泌、排泄和免疫等[1-2]。皮膚老化可分為內(nèi)在老化（自然老化）和外在老化（主要指光老化）。自然老化指的是因年齡增長(zhǎng)而產(chǎn)生的變化，不僅發(fā)生于皮膚，也發(fā)生在所有組織上；而作為人體最外層的器官，皮膚遭受著環(huán)境因素的損害，由此產(chǎn)生的皮膚老化被稱為外在老化，例如空氣污染、吸煙，以及被稱為光老化原因的紫外線照射等[3]。無(wú)論是內(nèi)因還是外因產(chǎn)生的老化，都會(huì)導(dǎo)致皮膚結(jié)構(gòu)完整性的下降和生理功能的喪失，造成皮膚干燥、功能失調(diào)、皮膚病發(fā)生率增加[4]。

皮膚衰老相關(guān)生物標(biāo)志物的研究，有助于更深入地理解皮膚老化的分子機(jī)制，有助于皮膚老化的早期診斷，并為皮膚年輕化提供潛在的新治療靶點(diǎn)。本文對(duì)皮膚老化的相關(guān)原因以及生物標(biāo)志物及其作用機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。

1 內(nèi)在老化

皮膚的內(nèi)在老化是一個(gè)漸變的生理過(guò)程，內(nèi)在老化最明顯的組織學(xué)變化表現(xiàn)在基底細(xì)胞層，隨著年齡增加，基底細(xì)胞層的細(xì)胞增殖減少，真皮成纖維細(xì)胞的數(shù)量減少，細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）中膠原蛋白和彈性蛋白的合成能力下降，特別是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，導(dǎo)致真皮變薄，皺紋增加和彈性減弱。其明顯特征是皮膚變薄、干燥、細(xì)小皺紋、出汗不足，以及對(duì)溫度的敏感性增加；皮脂的分泌隨著年齡的增長(zhǎng)而減少[5]。此外，慢性瘙癢在衰老的皮膚中極為常見，表明與年齡有關(guān)的麥克爾細(xì)胞的損失導(dǎo)致觸覺(jué)轉(zhuǎn)為瘙癢[6]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在衰老的成纖維細(xì)胞中表達(dá)增加，而金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）表達(dá)減少，是另一個(gè)與皮膚老化有關(guān)的因素。然而，由于暴露于外界，皮膚往往同時(shí)經(jīng)歷著內(nèi)在老化和外在老化，以面部、頸部、前臂和小腿皮膚為著[7]。

2 外在老化

早在1969 年，有研究提出，除了內(nèi)在因素，陽(yáng)光照射也會(huì)導(dǎo)致皮膚老化[8]。暴露在紫外線下導(dǎo)致的光老化約占面部老化的80%以上[9]。陽(yáng)光中的紫外線根據(jù)其波長(zhǎng)主要包括三種類型，長(zhǎng)波紫外線（UVA，320～400 nm）、中波紫外線（UVB，280～320 nm）和短波紫外線（UVC，200～280 nm）[10]。UVC 具有極強(qiáng)的致突變性，但受阻于臭氧層而無(wú)法到達(dá)地表；UVA 有很強(qiáng)的穿透能力，可以影響真皮甚至皮下組織區(qū)域，但誘變性較弱；UVB 誘變性強(qiáng)，可直接與DNA 發(fā)生作用，產(chǎn)生胸腺嘧啶二聚體光產(chǎn)物，導(dǎo)致DNA 損傷[11]。

紫外線導(dǎo)致的光老化會(huì)使皮膚變得粗糙、失去彈性、產(chǎn)生皺紋；此外，還會(huì)導(dǎo)致皮膚下毛細(xì)血管擴(kuò)張，引起表皮增厚，與內(nèi)在老化造成的表皮變薄形成鮮明對(duì)比[12]。光老化引發(fā)了角質(zhì)細(xì)胞活性下降，皮膚更新速度減緩，導(dǎo)致表皮層的屏障功能減弱，臨床表現(xiàn)為皮膚干燥和脫皮。與內(nèi)在老化相比，光老化真皮層的成纖維細(xì)胞數(shù)量減少更為嚴(yán)重，膠原蛋白和彈性蛋白的合成速率降低，同時(shí)分解加速[13]。由于膠原蛋白降解的增加，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白減少，導(dǎo)致真皮變?。唤琴|(zhì)細(xì)胞中Ⅶ型膠原蛋白的表達(dá)減少。Ⅶ膠型原蛋白是真皮-表皮交界處的錨定纖維，由于真皮和表皮之間的連接減弱，導(dǎo)致了皺紋的產(chǎn)生[14]。同時(shí)，朗格漢斯細(xì)胞減少，導(dǎo)致免疫力下降；無(wú)定形彈性纖維積累，膠原蛋白破壞和紊亂，導(dǎo)致皮膚彈性降低[15]。此外，紫外線照射會(huì)刺激黑色素細(xì)胞，促進(jìn)黑色素的生成和遷移，從而形成老年斑。紫外線輻射還會(huì)導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，引發(fā)有害的氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活花生四烯酸途徑，并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[16]。急性紫外線照射還可能引發(fā)曬傷、異常色素沉積，而長(zhǎng)期暴露則可能導(dǎo)致惡性腫瘤[17]。

3 皮膚老化的生物標(biāo)志物

盡管受到不同的刺激誘導(dǎo)，皮膚中的老化細(xì)胞有一些共同特征，使其在體外和體內(nèi)都能被識(shí)別。皮膚老化相關(guān)的生物標(biāo)志物，可以評(píng)估皮膚老化的程度，以及老化相關(guān)疾病導(dǎo)致的變化，并有效識(shí)別干預(yù)措施的效果對(duì)。皮膚衰老相關(guān)生物標(biāo)志物及其作用機(jī)制的了解，有助于進(jìn)一步了解皮膚衰老的現(xiàn)象和機(jī)制。

3.1 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（Senescence associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal）

Dimiri 等[18]發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下溶酶體β-半乳糖苷酶在pH 為4 時(shí)可以檢測(cè)到，而衰老細(xì)胞在pH 為6 時(shí)亦可檢測(cè)到β-半乳糖苷酶，被稱為衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal），成為識(shí)別體外和體內(nèi)衰老細(xì)胞最廣泛使用的生物標(biāo)志物。Lee 等[19]發(fā)現(xiàn)，SA-β-gal 活性的增加來(lái)源于編碼溶酶體β-半乳糖苷酶的基因GLB1。隨著年齡增長(zhǎng)，有絲分裂后細(xì)胞中溶酶體內(nèi)的脂褐素積累，溶酶體的數(shù)量和大小隨之增加[20]。體外和體內(nèi)衰老細(xì)胞（低溫保存組織）中脂褐素和SA-β-gal 的共定位被證實(shí)，表明脂聯(lián)素也可作為細(xì)胞衰老的生物標(biāo)志物[21]。SA-β-galactivity 與衰老細(xì)胞高度相關(guān)，但并不是所有的衰老細(xì)胞都表達(dá)SA-β-Gal，其在老化的成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，但在靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞和終末分化的角質(zhì)細(xì)胞中則不表達(dá)[18]。

3.2 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)器

衰老細(xì)胞不可或缺的標(biāo)志是其穩(wěn)定的細(xì)胞周期停滯：衰老細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G1/S 期，失去有絲分裂的能力，但仍保持代謝活性。與靜止期不同，衰老細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯是永久性的，不能被任何生理性刺激激活，即使在有利的生長(zhǎng)條件下，也喪失了重新進(jìn)入細(xì)胞周期的能力。同時(shí)，衰老細(xì)胞也不同于終末分化細(xì)胞，后者盡管也不可逆地退出了細(xì)胞周期，但其是一個(gè)明確的發(fā)育程序的結(jié)果，而細(xì)胞衰老是基于細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)形成的[22]。衰老細(xì)胞退出細(xì)胞周期是由p53/p21 CIP1 和p16 INK4a/Rb 腫瘤抑制通路的激活所控制的[23]。p21 是p53 最經(jīng)典的靶基因。在衰老期，被激活的p21 特異性地與G1 期的細(xì)胞周期蛋白/循環(huán)蛋白激酶復(fù)合物結(jié)合，抑制周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2） 的 活 性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein，Rb）磷酸化減少和細(xì)胞周期退出[24]。細(xì)胞受到暫時(shí)的應(yīng)激時(shí)，p53 誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)并激活DNA 修復(fù)過(guò)程，應(yīng)激消除后，細(xì)胞恢復(fù)周期。持續(xù)應(yīng)激可激活p16INK4a（CDK4 和CDK6 的抑制劑），導(dǎo)致細(xì)胞周期長(zhǎng)期停滯[25]。紫外線照射后的人類皮膚成纖維細(xì)胞（hDFs）顯示p53、p21 和p16 的上調(diào)[26]。此外，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）和人類黑色素瘤細(xì)胞也顯示了同樣的結(jié)果[27]。

3.3 衰老相關(guān)異染色質(zhì)灶（Senescence-associated heterochromatin foci，SAHF）

Narita 等[28]發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞的DNA 包含點(diǎn)狀異染色質(zhì)域，極易與非衰老細(xì)胞的染色質(zhì)區(qū)分開來(lái)。衰老的啟動(dòng)引發(fā)了不同異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生和積累，這些結(jié)構(gòu)被稱為衰老相關(guān)異染色質(zhì)灶，異染色質(zhì)區(qū)域常常發(fā)生組蛋白H3 上第9 位賴氨酸Lys9 的甲基化（K9M-H3），其為異染色質(zhì)蛋白HP-1（Heterochromatin protein 1，異 染 色 質(zhì) 整合時(shí)必需的銜接分子家族）提供了結(jié)合位點(diǎn)，由于衰老細(xì)胞中HP-1、K9M-H3 與SAHF 定位的一致性，兩者成為標(biāo)示SAHF 的標(biāo)志蛋白，可通過(guò)DNA 染料DAPI 檢測(cè)[29]。p16 的過(guò)量表達(dá)可以通過(guò)激活Rb 促進(jìn)SAHF 的形成，表明p16/Rb 途徑在SAHF 的形成中起著重要作用。在用Ras 誘導(dǎo)衰老并抑制p16 或Rb 的細(xì)胞中，盡管細(xì)胞仍然進(jìn)入衰老狀態(tài)，但SAHF 的形成明顯減弱[30]。高遷移率蛋白A（High-mobility group A，HMGA）是一種富集在染色質(zhì)中的非組蛋白，當(dāng)HMGA 的表達(dá)量增加時(shí)，SA-β-Gal 的活性增加，SAHF 的形成增強(qiáng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制。當(dāng)HMGA 在衰老細(xì)胞中被抑制時(shí)，SAHF 的形成會(huì)減弱，其他衰老跡象也會(huì)減少，這表明HMGA 蛋白對(duì)SAHF 的形成至關(guān)重要[30]。p16 和HMGA 可以以協(xié)同的方式共同促進(jìn)SAHF 的形成。但SAHF 不能在所有物種的衰老細(xì)胞中檢測(cè)到，因此作為一個(gè)衰老的生物標(biāo)志物有其局限性。

3.4 核纖層蛋白B1（Lamin B1）

細(xì)胞核通常由核孔復(fù)合體、核基質(zhì)和核纖層組成。核纖層位于內(nèi)核膜的核基質(zhì)表面，是一種由核纖層蛋白（Lamin）構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Lamin屬于中間纖維蛋白家族，為核膜提供支撐和維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在動(dòng)物細(xì)胞中，存在A、B 兩種Lamin 類型，B 型Lamin 由LMNB1 和LMNB2 編碼[31]。近年來(lái)，有研究表明，在復(fù)制性衰老和致癌基因誘導(dǎo)的衰老中，Lamin B1 的表達(dá)降低，通過(guò)依賴于p53 和Rb 的信號(hào)通路延緩了細(xì)胞增殖并促進(jìn)了細(xì)胞衰老[32-33]。此外，Lamin B1 與自噬過(guò)程也存在密切關(guān)聯(lián)。在細(xì)胞衰老時(shí)，核自噬被異常激活，從而導(dǎo)致Lamin B1 的表達(dá)下降[32]。Lamin B1 與自噬相關(guān)蛋白LC3 結(jié)合后，通過(guò)囊泡從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，然后由溶酶體降解。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)阻斷肽（Lamin B1 類似物）抑制LC3 和Lamin B1之間的相互作用可以延緩細(xì)胞衰老[34]。

另外，Lamin B 受體（LBR）和核纖層蛋白相 關(guān) 多 肽（Lamina-associated poly-peptide 2α，LAP2α）也顯示下調(diào)[35]。然而，LBR 在不同表皮層中的表達(dá)存在差異，這可能限制了其作為皮膚老化的適當(dāng)生物標(biāo)志物的使用。研究發(fā)現(xiàn)，Lamin B1 的表達(dá)在靜止細(xì)胞中保持穩(wěn)定，而LAP2α 的丟失不僅發(fā)生在衰老細(xì)胞中，也發(fā)生在靜止細(xì)胞中。因此，共同檢測(cè)Lamin B1 和LAP2α 可以更好地區(qū)分衰老細(xì)胞和靜止細(xì)胞[35]。

3.5 端粒

端粒是真核細(xì)胞線性染色體末端的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，由富含G 的核酸重復(fù)序列和蛋白質(zhì)組成，被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的生物標(biāo)志之一[36]。人類端粒主要由5’-(TTAGGG)n-3’重復(fù)DNA 序列構(gòu)成，總長(zhǎng)度2～15 kb。在DNA 半保留復(fù)制過(guò)程中，由于DNA 聚合酶無(wú)法進(jìn)行3’→5’合成，導(dǎo)致子鏈末端無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)展。隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，端粒逐漸縮短。端粒的關(guān)鍵作用是維持染色體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以阻止染色體融合、降解或不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)形成，端?？s短使端粒失去保護(hù)染色體的能力，縮短至極限時(shí)，正常的端粒結(jié)構(gòu)無(wú)法維持，細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)不可逆的生長(zhǎng)停滯，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生衰老和死亡。雖然DNA 損傷不是衰老的生物標(biāo)志物，但由此產(chǎn)生的端粒功能障礙誘發(fā)的病灶（Telomere dysfunction-induced foci，TIF）經(jīng)常被用來(lái)檢測(cè)和量化衰老細(xì)胞[37]。

在靈長(zhǎng)類皮膚成纖維細(xì)胞中，隨著年齡增長(zhǎng)，觀察到TIF 逐漸增多，端粒酶被激活。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白復(fù)合體，由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）、端粒酶RNA 模板（hRNA）和相關(guān)蛋白組成[36]，具備自主合成端粒DNA 序列的能力，并將其附加到端粒末端，從而有助于維持端粒的長(zhǎng)度，修復(fù)斷裂的染色體末端，減輕細(xì)胞分裂過(guò)程中的端粒損傷，減緩細(xì)胞的老化過(guò)程，進(jìn)而起到維護(hù)遺傳穩(wěn)定性的作用。然而，在人體內(nèi)，端粒酶的表達(dá)水平除了在造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞中較高外，幾乎無(wú)法在正常細(xì)胞中檢測(cè)到。因此，將端粒酶檢測(cè)應(yīng)用于衰老判斷時(shí)，主要適用于生殖細(xì)胞、干細(xì)胞和多數(shù)癌細(xì)胞的研究，而不適用于正常細(xì)胞。

3.6 衰老相關(guān)分泌表型（Senescence -associated secretory phenotype，SASP）

SASP 是指衰老細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、蛋白酶和脂質(zhì)的現(xiàn)象，通過(guò)自分泌和旁分泌途徑可能引發(fā)機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并向周圍細(xì)胞傳遞衰老信號(hào)[38]。分泌物的組成因衰老觸發(fā)因素而異，包括促炎因子（IL-1、IL-6 和IL-8 等）、趨化因子（CXCL-1、CXCL-3、CXCL-10）、生長(zhǎng)因子（HGF、GM-CSF 和TGF-β 等）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBPs）和金屬蛋白酶（MMPs），以及金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）等[39]。SASP 有助于加強(qiáng)衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，刺激免疫系統(tǒng)清除潛在的致癌細(xì)胞，限制纖維化，促進(jìn)傷口愈合和組織再生；另外，SASP 還可能介導(dǎo)了慢性炎癥，加速機(jī)體老化，刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的免疫功能下降、自噬失調(diào)和端粒縮短等變化導(dǎo)致衰老細(xì)胞的積累增多，從而引發(fā)了炎癥因子水平的上升，這可能進(jìn)一步促使疾病發(fā)生。因此，SASP 可被視為細(xì)胞老化的一個(gè)重要特征[40]。

研究指出，IL-6 與由DNA 損傷引起的角質(zhì)細(xì)胞、黑素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的老化過(guò)程相關(guān)聯(lián)[41]。在老化的成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及由化療誘導(dǎo)的老化腫瘤細(xì)胞中，IL-1 的表達(dá)增加，能夠與IL-1 受體或Toll 樣受體結(jié)合，進(jìn)而激活NFκB，促進(jìn)SASP 的表達(dá)[42]。Quan 等[43]在年齡老化和光老化的皮膚中觀察到MMPs 的高水平表達(dá)，以及膠原蛋白基質(zhì)的快速降解。

研究衰老對(duì)細(xì)胞或組織微環(huán)境的影響時(shí)，SASP同樣具有重要的生物學(xué)意義；然而，SASP 作為皮膚老化的生物標(biāo)志物有一定的局限性，比如IL-6和IL-8 也參與炎癥反應(yīng)等其他生理過(guò)程，因此需結(jié)合其他生物標(biāo)志物來(lái)共同判斷衰老的發(fā)生[44]。

3.7 皮膚老化的其他生物標(biāo)志物

皮膚老化過(guò)程中膠原蛋白持續(xù)減少，而皮膚膠原蛋白中以羥脯氨酸的含量最高，因此羥脯氨酸可以作為評(píng)價(jià)皮膚老化的一個(gè)指標(biāo)[45]。透明質(zhì)酸是一種酸性黏多糖，由皮膚中的纖維母細(xì)胞分泌，具有重要的保水作用，其含量隨著年齡的增加而逐漸減少[46]。Ishitsuka 等[47]發(fā)現(xiàn)，鹵化酪氨酸在光暴露和光保護(hù)的皮膚中隨年齡增長(zhǎng)而增加，表明其可能是一個(gè)有用的皮膚老化生物標(biāo)志物。在衰老的細(xì)胞中，高遷移率族蛋白B1（High mobility group box 1，HMGB1）從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外空間，促進(jìn)SASP 的釋放，如IL-1β、IL-6 和MMP-3[48]。

綜上所述，皮膚老化是人體衰老的直接表現(xiàn)，是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，延緩皮膚老化對(duì)維護(hù)人們的心理健康和皮膚的正常生理功能具有重要意義。檢測(cè)衰老生物標(biāo)志物可以對(duì)體外或體內(nèi)的衰老細(xì)胞進(jìn)行定性或定量分析，并有助于對(duì)衰老組織和機(jī)體中細(xì)胞衰老的功能進(jìn)行研究。但是，目前的生物標(biāo)志物存在很多局限性，尚無(wú)一種生物標(biāo)志物能夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定地檢測(cè)出衰老細(xì)胞。因此，我們需要在不同情況下選擇合適的生物標(biāo)志物，并且繼續(xù)不斷發(fā)現(xiàn)、改進(jìn)新的生物標(biāo)志物和檢測(cè)皮膚老化的方法，以更進(jìn)一步理解皮膚衰老的生理、生化機(jī)制。