AFS-9700型原子熒光光度計測定尿中砷的研究

許可清 閩侯縣疾病預(yù)防控制中心 （福建 福州 350100）

內(nèi)容提要： 目的：利用AFS-9700型原子熒光光度計建立尿中砷的測定方法。方法：尿樣經(jīng)硫酸、硝酸、過氧化氫處理后，將硫脲、鹽酸和抗壞血酸試劑直接加入10mL具塞刻度消化管內(nèi)定容后，上機測定。調(diào)整儀器條件為最佳的情況下，分析研究測定中鹽酸和硼氫化鉀的最適濃度、樣品前處理、加標(biāo)回收率、精密度及檢出限等，并對比該方法與WS/T 474-2015《尿中砷的測定氫化物發(fā)生原子熒光法》的結(jié)果。結(jié)果：該文建立的測定方法中，尿砷處于0～100μg/L的含量范圍時，熒光強度與砷濃度間有線性關(guān)系，檢出限0.07μg/L、加標(biāo)回收率95%～105%、相關(guān)系數(shù)不低于0.9995，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。相比標(biāo)準(zhǔn)方法而言，P＞0.05，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：該文建立的方法相比標(biāo)準(zhǔn)方法而言，彌補了前處理中過多取樣量、使用器材復(fù)雜、酸用量多、操作繁瑣等缺點，且操作簡便、檢出限低、線性范圍寬、基體干擾少，在低、中、高及大批量尿中砷測定中適用，可行性與應(yīng)用價值可觀。

砷是一種廣泛存在于自然界中的元素，它可以以多種形式存在于環(huán)境中，并與許多生物和無機物質(zhì)相互作用。砷的存在對人類健康構(gòu)成了潛在的威脅，因為它被認(rèn)為是一種致癌物質(zhì)。尿液中的砷含量是評估個體砷暴露水平的重要指標(biāo)之一[1]。目前，砷斑法、催化極譜法、原子吸收法、分光光度法、HPLC與HG-AFS聯(lián)用技術(shù)等都適用于尿砷的檢測，其中原子熒光光度計已經(jīng)成為測定尿液中微量元素含量的常用方法之一[2]。AFS-9700型原子熒光光度計是一種高靈敏度和高精確度的儀器，廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、食品安全和醫(yī)學(xué)檢驗等領(lǐng)域[3]。本文利用AFS-9700型原子熒光光度計來測定尿液中砷的含量，探索經(jīng)濟、簡便、準(zhǔn)確、快速且具備較強適用性的分析方法，為環(huán)境監(jiān)測、食品安全和醫(yī)學(xué)檢驗等領(lǐng)域提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持[4]。同時，希望能夠進一步了解尿液中砷的來源、分布規(guī)律以及與人體健康之間的關(guān)系，為預(yù)防和控制相關(guān)疾病提供參考依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 一般材料

研究起止時間：2022年6月～2023年6月。

儀器：AFS-9700 原子熒光光度計（北京海光儀器公司）；AED-IV多孔（60孔）自控電熱消化器（北京博瑞賽科技有限責(zé)任公司）；砷空心陰極燈及配套分析軟件（北京瑞利分析儀器公司）；1%電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；10.0mL（15mm×140mm）具塞刻度消化管。在進行試驗前，所有使用到的玻璃器皿都經(jīng)過了處理，先被浸泡在20%硝酸中一整夜，然后用去離子水進行沖洗，以確保干凈無雜質(zhì)。

試劑：96%硫酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、5%、18%鹽酸（重慶川東化工有限公司），66%硝酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、30%過氧化氫（東莞市喬科化學(xué)有限公司），均為優(yōu)級純；內(nèi)含0.5%氫氧化鈉（上海山海工學(xué)團實驗二廠，優(yōu)級純）的2%硼氫化鉀（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、10%抗壞血酸（上海四赫維化工有限公司）與10%硫脲（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）混合溶液，均為分析純；砷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），ρ（As）=1.0μg/mL：吸取ρ（As）=1 000.0μg/L的砷標(biāo)準(zhǔn)液，逐級配制為應(yīng)用液，濃度1.0μg/mL；試驗采用正常人尿液混合成的尿液樣本；載氣為氬氣，純度＞99.99%；試驗用水為超純水，比電阻≥18.2MΩ·cm·25°C。

1.2 方法

1.2.1 儀器工作條件

光電倍增管負(fù)高壓280 PMT（V）；原子儀器高度8mm；燈電流50mA；氣壓0.2MPa；輔陰極電流25mA；屏蔽氣流量900mL/min；截氣流量400mL/min。

1.2.2 試驗原理

在對尿樣進行濕法消化處理之后，為將尿樣中的五價砷還原為三價砷，可在酸性介質(zhì)中添加硫脲和抗壞血酸混合液。使用硼氫化鉀作為還原劑，得到砷化氫[5]。通過添加氬氣，砷化氫會與氬氣一起進入石英原子化器，砷化氫經(jīng)過分解后轉(zhuǎn)變?yōu)樵討B(tài)砷。原子態(tài)砷經(jīng)砷空心陰極燈發(fā)射光照射后會發(fā)出特定的光譜信號，在固定的條件下，被測液中砷濃度與原子熒光強度間呈正比關(guān)系[6]。同時，采用標(biāo)準(zhǔn)系列展開對比。

1.2.3 樣品前處理

在具塞刻度消化管（10.0mL）內(nèi)裝入尿樣（1.0mL），添加30%過氧化氫0.5mL、66%硝酸0.3mL、96%硫酸0.2mL，置于AED-IV自控電熱消化器，200°C條件下持續(xù)50min消化處理，得到呈無色或淡黃色的0.2mL溶液，若有棕黃色煙或溶液顏色偏深，表明有較多雜質(zhì)，需取出冷卻后添入過氧化氫0.5mL并加熱分解，直至管壁內(nèi)無回流現(xiàn)象，當(dāng)消化管內(nèi)的白色或黃色氣體消失，并且原本有顏色的液體經(jīng)過反應(yīng)而變得無色透明，表示消化已經(jīng)完成[7]。為了確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，在進行消化試驗時制作3個空白試驗。

1.2.4 試驗方法

穩(wěn)定性試驗：取42份尿樣，分別添加砷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用溶液，加標(biāo)定容至10.0μg/L。選擇其中6份展開測定，余下樣品保存至4°C下環(huán)境內(nèi)，后續(xù)每間隔2d選擇6份進行測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍：取6支具塞刻度消化管，每支容量10.0mL，分別加入濃度為1.0μg/mL、體積不同的砷標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、1.00mL）后，添加正常人混合尿溶液1.0mL、30%過氧化氫0.5mL、96%硫酸0.2mL、66%硝酸0.3mL，搖勻后置于AED-IV自控電熱消化儀上，200°C條件下持續(xù)50min消化處理，處理后的溶液呈淡黃色或無色，體積0.2mL；冷卻后，分別加入18%鹽酸1.0mL、10%抗壞血酸和10%硫脲混合溶液1.0mL，并選擇超純水定容至10.0mL，制成一系列不同濃度的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.0、10.0、30.0、50.0、70.0和100.0μg/L），混勻、靜置20～min，上機測定。

檢出限：以上文1.2.1儀器工作條件為參照，重復(fù)11次對恒定含量的10.0μg/L標(biāo)準(zhǔn)液展開評價測定。

精密度：配制三種不同濃度的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為10.0μg/L、50.0μg/L和100.0μg/L。重復(fù)測定每種濃度溶液11次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。選擇同一尿樣，采用本文建立的方法與標(biāo)準(zhǔn)方法平行測定6次，對兩種方法測定同一尿樣進行對比分析。

準(zhǔn)確度：選擇的樣本為正常人混合尿液，向樣品中添加不同濃度的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定。對試驗結(jié)果進行觀察和分析。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn)

分析研究測定中鹽酸和硼氫化鉀的最適濃度、樣品前處理、加標(biāo)回收率、精密度及檢出限等，并對比該方法與WS/T 474-2015《尿中砷的測定氫化物發(fā)生原子熒光法》的結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

選擇Excel 2010軟件作為數(shù)據(jù)錄入的工具，采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2.結(jié)果

2.1 穩(wěn)定性試驗

根據(jù)1.2.4試驗結(jié)果顯示，在2周時間范圍內(nèi)，能夠較好地保存樣品。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

確定縱坐標(biāo)為熒光強度If、橫坐標(biāo)為砷濃度C，線性回歸，得到If=79.192×C+100.843 的線性方程，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

2.3 檢出限

經(jīng)計算得到1.96%的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，參考3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以斜率，檢出限為0.07μg/L。

2.4 精密度

結(jié)果顯示，10.0μg/L溶液的RSD為1.96%，50.0μg/L溶液的RSD為3.97%，100.0μg/L溶液的RSD為2.73%，皆與《研制生物樣品檢測檢驗方法指南》（WS/T 68-1996）等相關(guān)要求相符合。采用本文建立的方法與標(biāo)準(zhǔn)方法平行測定6次，得到表1所示結(jié)果。

表1.兩種方法測定同一尿樣的對比分析(μg/L)

從表1中可以看出，兩種方法所測值均處于標(biāo)準(zhǔn)差偏差允許范圍，10%的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差進一步表明方法精密度較高。對比兩種方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，本文建立方法為2.8%，而標(biāo)準(zhǔn)方法為4.9%，前者精密度、穩(wěn)定性更高。采取Grubbs檢驗和F雙邊檢驗，結(jié)果顯示兩組數(shù)據(jù)均無異常值，并且在精密度方面的差異在統(tǒng)計學(xué)上沒有意義。采取t檢驗來比較兩種方法的測定結(jié)果。計算得到的統(tǒng)計量t=0.353，在給定α=0.05和自由度f=10的情況下，查表得到t0.05（10）=2.228。由于t＜0.05（10），說明本文建立方法測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法測定結(jié)果沒有顯著性差異。

2.5 準(zhǔn)確度

通過對試驗結(jié)果進行觀察和分析發(fā)現(xiàn)，測定結(jié)果的回收率在95.0%～105.0%，測定值未超出標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍，表明所采用的方法具有較高的精確性和穩(wěn)定性，在實際應(yīng)用中可以得到可靠的結(jié)果。同時，試驗結(jié)果符合《職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南第5部分：生物材料中化學(xué)物質(zhì)的測定方法》（GBZ/T 210.5-2008）的要求。表2列出試驗相關(guān)數(shù)據(jù)情況。

表2.準(zhǔn)確度試驗(μg/L)

3.討論

3.1 消化儀及消化管的選擇

砷屬于易揮發(fā)元素，處于消解中的尿液樣品所面臨的干擾因素諸多，如硝酸根殘留、消解程度及溫度等，同時還有尿液中的有機物和鹽分[8]。因此，在檢測過程中，樣品的消化至關(guān)重要。采用具塞刻度消化管和AED-IV多孔（60孔）自控電熱消化器[9]。在200°C的條件下，依照50min的時間消化處理尿樣和標(biāo)準(zhǔn)系列，在F與t檢驗驗證后發(fā)現(xiàn)，在統(tǒng)計學(xué)方面兩種方法的差異并不顯著，所測值沒有超過不確定范圍。

3.2 載流-鹽酸度濃度的選擇

在特定條件下，在2%～20%的范圍內(nèi)對載流鹽酸濃度進行調(diào)整，同時觀察相應(yīng)的熒光強度變化[10]。通過試驗觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽酸為5%的體積分?jǐn)?shù)時，熒光強度將達到最高點，此時也能達到最高的靈敏度。基于該觀察結(jié)果，確定5%的鹽酸體積分?jǐn)?shù)。

3.3 硼氫化鉀濃度的確定

在特定條件下進行試驗后發(fā)現(xiàn)，硼氫化鉀的濃度會在一定程度上影響測定結(jié)果。選擇25.0μg/L內(nèi)控樣濃度的砷標(biāo)準(zhǔn)液作為比對，試驗結(jié)果顯示，在不同硼氫化鉀溶液濃度下，熒光強度表現(xiàn)出不同程度的變化：30μg/L濃度時，能夠達到最良好的熒光強度；濃度為20μg/L次之。在關(guān)注經(jīng)濟性的基礎(chǔ)上，確定硼氫化鉀溶液為20μg/L的濃度，即2%[11]。需要注意的是，由于該溶液穩(wěn)定性不高，因此需要結(jié)合2g/L 0.2%氫氧化鉀或5g/L 0.5%氫氧化鈉進行溶解。

3.4 方法抗干擾分析

通過嚴(yán)格控制分析方法應(yīng)用過程，能為試驗數(shù)據(jù)提供可靠的質(zhì)量保證。在相同條件下，直接在消化處理后的樣品和標(biāo)準(zhǔn)系列中添加鹽酸、硫脲和抗壞血酸試劑并定容，上機。樣品空白值用“0”管測定，本底值扣除后，能消除樣品消化、儀器及試劑等干擾。硫脲和抗壞血酸具有抗干擾的隱蔽劑作用，在一定程度上可以去除共存物的干擾，且尿樣加標(biāo)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線也能在一定程度上消除干擾[12]。所以，存在于尿樣中的干擾原始基本上都不會對結(jié)果產(chǎn)生顯著影響的水平。本文建立的方法，0～100.0μg/L范圍內(nèi)尿砷含量呈線性關(guān)系，達到不低于0.9995的相關(guān)系數(shù)，支持0.07μg/L的最低檢測濃度，重復(fù)試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%（n=6）。尿樣加標(biāo)回收率在95.0%～105.0%，說明了該方法的準(zhǔn)確性和可靠性。此外，經(jīng)過試驗驗證，樣品在4°C下至少可保存2周。這意味著該方法具有較高的穩(wěn)定性，并且在實際應(yīng)用中具有很強的實用性。尤其是針對高砷環(huán)境條件下的砷含量檢測，該方法表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性和可行性。在試劑用量、取樣量方面，本文建立的方法優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法。在自控電熱消化器AED-IV多孔（60孔）的作用下，結(jié)合具塞刻度消化管，試驗操作更加簡便，適用于處理大批量尿液中的砷含量測定。

綜上所述，相比其他方法，本文建立的新方法具有許多優(yōu)勢。首先，該方法精密度高且靈敏度良好。通過試驗數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)該方法在標(biāo)準(zhǔn)偏差方面較低。其次，該方法簡便快捷，外界干擾較少，成本低且實用性強，線性范圍寬，用于測定尿液中砷含量時簡單易行。