青藏高原冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌群落特征研究

賈譜超， 張 威， 劉 陽(yáng)， 田 茂， 張昺林，章高森， 劉光琇， 陳 拓

（1. 中國(guó)科學(xué)院 西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 沙漠與沙漠化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 2. 中國(guó)科學(xué)院 西北生態(tài)環(huán)境資源研究院冰凍圈科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 3. 甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

0 引言

冰川是由積雪經(jīng)過(guò)多年反復(fù)融凍、累積和壓實(shí)等作用而形成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，主要由雪、冰和融水3 種相互關(guān)聯(lián)的生境組成。冰川因其低溫、寡營(yíng)養(yǎng)、強(qiáng)輻射等惡劣的自然條件，構(gòu)成了冰川特有生態(tài)環(huán)境特征，這種極端寒冷的生境中生存的大量微生物使其成為一個(gè)天然的微生物資源保藏庫(kù)。隨著全球氣候變暖引發(fā)冰川消融，大量封存在冰川中的微生物逐漸被釋放出來(lái)［1］，導(dǎo)致冰川中大量的微生物資源隨著冰川的消融而流失。

冰川微生物主要來(lái)源于周?chē)h(huán)境，包括細(xì)菌、病毒、原生生物和真菌及其孢子等等，隨著冰川發(fā)育，這些微生物被封存在冰川冰中。在冰川微生物的研究中，高通量測(cè)序、宏基因組等各種分子水平上的研究方法現(xiàn)已十分普遍，但傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法因其可得到完整的生命體，并能在個(gè)體水平研究微生物的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，是獲得微生物資源和微生物全基因組的必要手段，仍被廣泛應(yīng)用［2］。研究表明，冰川中微生物細(xì)胞數(shù)量范圍為2×102～7×107CFU·mL-1（colony forming units per milliliter）［3-8］，細(xì)菌群落豐富度低于土壤、水體和其他富營(yíng)養(yǎng)生境。大量研究中冰川可培養(yǎng)細(xì)菌大多來(lái)源于放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，但在不同生境中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同，可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量也因生境的改變而不同［9-13］。然而，目前對(duì)于冰川微生物的可培養(yǎng)研究仍不夠，且冰川微生物資源的流失從未停止。

冬克瑪?shù)妆ㄎ挥谔乒爬矫}，其融水作為長(zhǎng)江源頭之一，部分冰川微生物會(huì)隨融水進(jìn)入下游，這些幸存者中包含一些遠(yuǎn)古時(shí)期的細(xì)菌，可能對(duì)下游生態(tài)系統(tǒng)造成重大影響。該區(qū)域的氣候主要受西風(fēng)帶和印度洋季風(fēng)的影響，呈現(xiàn)出冬季干冷、夏季暖濕的特性［14］，年平均氣溫為-5 ℃［15］，降水集中于5—9 月，降水量436.6 mm，占全年比例為92.5%～94.1%［16］。相關(guān)可培養(yǎng)細(xì)菌的研究工作表明，冬克瑪?shù)妆ㄑ又屑?xì)菌來(lái)源于放線菌門(mén)、變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，且放線菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)門(mén)［13］；而冰川前沿土壤可培養(yǎng)細(xì)菌研究同樣發(fā)現(xiàn)放線菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)門(mén)，且25 ℃培養(yǎng)條件下分離的屬的豐度和多樣性大于4 ℃［17］。通過(guò)非培養(yǎng)手段研究發(fā)現(xiàn)冬克瑪?shù)妆┒吮韺颖突妆簿哂胁煌募?xì)菌群落［18］。這些研究表明：冰川中不同生境條件下，微生物的群落分布差異較大，可培養(yǎng)微生物在異質(zhì)的生境中系統(tǒng)進(jìn)化會(huì)發(fā)生改變［10］。目前，對(duì)于冬克瑪?shù)妆ㄎ⑸锏难芯坎欢?，且都只研究了一種冰川生境，同時(shí)研究雪、冰和融水3種生境能夠更系統(tǒng)全面地了解冰川生態(tài)系統(tǒng)可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性和群落構(gòu)成。

本文通過(guò)可培養(yǎng)方法，研究冬克瑪?shù)妆? 430 m、5 550 m 和5 670 m 海拔表層雪、表層冰及冰下融水3種生境中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)疑似新種48 株，豐富了冬克瑪?shù)妆ㄎ⑸镔Y源的理論基礎(chǔ)，對(duì)唐古拉山區(qū)域生態(tài)環(huán)境評(píng)估及微生物物種資源發(fā)掘有一定參考價(jià)值，以期為之后的冰川微生物研究提供科學(xué)依據(jù)，為微生物資源庫(kù)提供數(shù)據(jù)支撐及菌種資源。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

唐古拉山脈，位于中國(guó)西藏自治區(qū)東北部與青海省邊境處，東段為西藏與青海的界山，東南部延伸接橫斷山脈的云嶺和怒山。本研究樣品于2021年9月下旬在唐古拉山冬克瑪?shù)妆ǎ▓D1），海拔每隔120 m 采集冰、雪和融水樣品，采集的所有樣品用無(wú)菌采樣袋（Bombardier， 加拿大）和無(wú)菌瓶（比克曼，中國(guó)）分裝，每個(gè)海拔不同類(lèi)型的樣品均采集三個(gè)平行樣（圖1）。將采集的樣品放入冰箱-20 ℃低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)以進(jìn)行后續(xù)細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

圖1 冬克瑪?shù)妆ú蓸狱c(diǎn)Fig. 1 Sampling sites of Dongkemadi Glacier

1.2 樣品理化性質(zhì)的測(cè)定

將解凍后的樣品使用定性濾紙過(guò)濾，然后取其中一部分用pH 測(cè)量?jī)x（PT-10， Sartorius， 德國(guó)）對(duì)水體樣品pH 值進(jìn)行測(cè)定；取另一部分樣品用電導(dǎo)率測(cè)量?jī)x（DDSJ-308A，上海雷磁）對(duì)水體電導(dǎo)率（electrical conductance， EC）進(jìn)行測(cè)量；Cl-、NO3-、SO42-、Na+、K+、Mg2+及Ca2+的含量均在中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院冰凍圈科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，具體方法參照文獻(xiàn)［19］。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

選用5 種不同的培養(yǎng)基：R2A 瓊脂培養(yǎng)基（R2A）、R2A 改良瓊脂培養(yǎng)基（R2A-Y，培養(yǎng)基中每升額外添加1 g酵母膏）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和腦心浸出液肉湯（BHI），培養(yǎng)基參考德國(guó)菌種保藏中心（https：//www.dsmz.de）配方。

在超凈臺(tái)中將冰樣置于滅菌的5 L 燒杯中，切除表面1 cm，取出冰樣置于無(wú)菌瓶在4 ℃冰箱緩慢融化，雪樣同樣置于4 ℃冰箱緩慢融化。在超凈臺(tái)中從冰樣和融水樣分別取200 μL 涂布于R2A、R2A-Y、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、TSB 和BHI 瓊脂培養(yǎng)基上。在超凈臺(tái)中將200 mL雪樣融水過(guò)濾到0.22 μm無(wú)菌Millipor微孔濾膜上，將濾膜懸浮在2 mL 0.9%的生理鹽水中，充分震蕩以懸浮細(xì)菌細(xì)胞，然后取200 μL 涂布在培養(yǎng)基表面進(jìn)行培養(yǎng)。所有樣品在無(wú)光條件下培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基做6個(gè)平行樣，其中3個(gè)置于25 ℃條件下培養(yǎng)，另外3 個(gè)置于10 ℃條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后開(kāi)始對(duì)25 ℃培養(yǎng)箱的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)和不同表型特征菌落的分離和純化，3 周后開(kāi)始對(duì)10 ℃培養(yǎng)箱的平板進(jìn)行同樣操作。分離、純化出的細(xì)菌加入25%的甘油混合后放置于凍存管中并保存至-80 ℃冰箱中。

1.4 可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rRNA 基因的擴(kuò)增以及序列測(cè)定

對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增，引物采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）［20］。擴(kuò)增體系（25 μL）：12.5 μLTaqDNA 聚合酶，10.5 μL ddH2O，1 μL 引物。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s 和72 ℃延伸45 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸20 min。PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物送至西安擎科生物公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)定得到的16S rRNA 基因序列提交至GeneBank（NCBI）獲取序列登錄號(hào)：ON693689-ON693837。

1.5 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將提交至NCBI 的16S rRNA 基因序列在EZBioCloud 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（www. ezbiocloud. net）；clustal muscle 方法進(jìn)行比對(duì)，p-distance 方法計(jì)算的距離，選擇鄰近相接法對(duì)序列進(jìn)行分析；用MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬克瑪?shù)妆悠防砘再|(zhì)分析

冰川樣品中，雪的pH 值呈弱酸性，5.71～5.86；EC 較低，3.45～5.51 μS·cm-1。Cl-、NO3-、Na+、Mg2+和Ca2+含量隨著海拔變化差異顯著；其中Na+、Mg2+和Ca2+含量隨海拔增加含量降低（表1）。雪樣的SO42-和K+含量隨著海拔變化無(wú)顯著性差異（表1）。

冰的pH 值的范圍為6.55～6.57，電導(dǎo)率較低，10.93～48.30 μS·cm-1。Cl-、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、NO3-和SO42-含量隨著海拔變化差異顯著，其中NO3-和SO42-含量隨海拔增加而增加（表1）。

冰川融水的pH 值的范圍為6.93～7.30；電導(dǎo)率范圍在73.30～134.77 μS·cm-1之間。Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、NO3-和SO42-含量隨著海拔變化差異顯著，其中Cl-、NO3-和SO42-含量隨著海拔增加而增加（表1）。

2.2 冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌數(shù)量

不同溫度下可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著不同；在10 ℃培養(yǎng)條件下，10 ℃培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)得到的細(xì)菌數(shù)量平均值為539 CFUs·mL-1，顯著高于25 ℃的189 CFUs·mL-1［圖2（a）］。雪樣在10 ℃培養(yǎng)條件下，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量平均值是8 CFUs·mL-1，在25 ℃時(shí)是12 CFUs·mL-1，10 ℃培養(yǎng)得到的數(shù)量平均值低于25 ℃［圖2（b）］；冰樣和融水樣在10 ℃培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)得到的細(xì)菌數(shù)量平均值（冰樣1567 CFUs·mL-1，融水樣44 CFU·mL-1）均顯著高于25 ℃（冰樣528 CFU·mL-1，融水樣27 CFU·mL-1）［圖2（c）～2（d）］。

圖2 冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌數(shù)量Fig. 2 Abundance of the culturable bacteria from the Dongkemadi Glacier

研究還發(fā)現(xiàn)不同樣品類(lèi)型，培養(yǎng)得到的細(xì)菌數(shù)量也不同。在10 ℃培養(yǎng)條件下從雪、冰和融水樣培養(yǎng)得到的細(xì)菌數(shù)量顯著不同，表現(xiàn)為冰樣＞融水樣＞雪樣。在25 ℃從雪、冰和融水樣培養(yǎng)得到的細(xì)菌數(shù)量同樣表現(xiàn)為冰樣＞融水樣＞雪樣，但雪樣和融水樣間的差異性不顯著。

2.3 冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)培養(yǎng)基上細(xì)菌菌落的表型特征，分離、純化得到149 株細(xì)菌。將這些細(xì)菌的16S rRNA 基因序列在EZBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，分析發(fā)現(xiàn)冬克瑪?shù)妆ǚ蛛x出的菌株分別歸屬于4 個(gè)門(mén)，放線菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）。

本次研究共分離得到了放線菌門(mén)中的16個(gè)屬，分別是庫(kù)克菌屬（Kocuria）、微桿菌屬（Microbacterium）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、紅球菌屬（Rhodococcus）、土壤球菌屬（Agrococcus）、密執(zhí)安棍狀桿菌屬（Clavibacter michiganensis）、類(lèi)諾卡氏菌屬（Nocardioides）、纖維素單胞菌屬（Cellulomonas）、血桿菌屬（Sanguibacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、冷桿菌屬（Cryobacterium）、氣微菌屬（Aeromicrobium）、居真菌細(xì)菌屬（Mycetocola）、根戈德里谷氨酸桿屬（Paeniglutamicibacter）和鹽地桿菌屬（Salinibacterium），庫(kù)克菌屬為優(yōu)勢(shì)屬（圖3）。

圖3 放線菌門(mén)可培養(yǎng)細(xì)菌基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of Actinobacteria culturable bacteria based on 16S rRNA gene sequence

變形菌門(mén)中分離得到13個(gè)屬，分別是馬賽菌屬（Massilia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、副球菌屬（Paracoccu）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、極單胞菌屬（Polaromonas）、皺紋單胞菌屬（Rugamonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Aquirhabdus和紅育菌屬（Rhodoferax），馬賽菌屬為優(yōu)勢(shì)屬（圖4）。

圖4 變形菌門(mén)可培養(yǎng)細(xì)菌基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of Proteobacteria culturable bacteria based on 16S rRNA gene sequence

擬桿菌門(mén)中分離出4 個(gè)屬，分別是黃桿菌屬（Flavobacterium）、薄層菌屬（Hymenobacter）、土地桿菌屬（Pedobacter）和Kaistella，其中黃桿菌屬是優(yōu)勢(shì)屬（圖5）厚壁菌門(mén)分離出3個(gè)屬，分別是芽孢桿菌屬（Bacillus）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）和類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus），芽孢桿菌屬是優(yōu)勢(shì)屬（圖6）。

圖6 厚壁菌門(mén)可培養(yǎng)細(xì)菌基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 6 Phylogenetic tree of Firmicutes culturable bacteria based on 16S rRNA gene sequence

研究表明，16S rRNA 基因同一性為98.7%作為物種級(jí)臨界值［21］，本研究中發(fā)現(xiàn)與已分離發(fā)表的菌種相似度低于98.7%的細(xì)菌有46 株，均為潛在新種。

2.4 冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌分布特征

統(tǒng)計(jì)不同溫度下可培養(yǎng)細(xì)菌物種發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)得到的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同，具體表現(xiàn)在物種數(shù)目和組成。在10 ℃培養(yǎng)條件下，共分離出55個(gè)種（28個(gè)屬），而在25 ℃只分離出43個(gè)種（23個(gè)屬）。有些細(xì)菌只在一個(gè)培養(yǎng)溫度發(fā)現(xiàn)，氣微菌屬、冷桿菌屬、居真菌細(xì)菌屬、根戈德里谷氨酸桿屬、鹽地桿菌屬、Aquirhabdus、副球菌屬、嗜冷桿菌屬、極單胞菌屬、皺紋單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬和土地桿菌屬只從10 ℃培養(yǎng)溫度分離得到，纖維素單胞菌屬、密執(zhí)安棍狀桿菌屬、血桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、副球菌屬、鞘氨醇盒菌屬、芽孢桿菌屬和微小桿菌屬只從25 ℃培養(yǎng)溫度分離得到，而其他屬在兩個(gè)培養(yǎng)溫度下均能分離得到［圖7（a）］。

圖7 冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌物種數(shù)（a）和CFU（b）Fig. 7 Number of species （a） and colony forming units （b） of the culturable bacteria from the Dongkemadi Glacier

研究還發(fā)現(xiàn)，不同生境，培養(yǎng)得到的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也不同。本次培養(yǎng)共分離出36個(gè)屬，雪中分離出8 個(gè)屬，冰中28 個(gè)，融水中14 個(gè)。在10 ℃培養(yǎng)條件下，雪中分離出5 個(gè)種，冰中35 個(gè)，融水中21 個(gè)；在25 ℃下，雪中分離出5 個(gè)種，冰中32 個(gè)，融水中8個(gè)。微桿菌屬在3 種生境中均能分離得到，土壤球菌屬僅在雪樣中分離得到；纖維素單胞菌屬、密執(zhí)安棍狀桿菌屬、庫(kù)克菌屬、居真菌細(xì)菌屬、根戈德里谷氨酸桿屬、假節(jié)桿菌屬、鹽地桿菌屬、血桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、紫色桿菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、皺紋單胞菌屬和微小桿菌屬僅在冰樣中分離得到；氣微菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬、Aquirhabdus、紅育菌屬、鞘氨醇盒菌屬和類(lèi)芽孢桿菌僅在融水樣中分離得到［圖7（a）］。

在10 ℃和25 ℃培養(yǎng)條件下，放線菌門(mén)均為優(yōu)勢(shì)門(mén)，分別占60.64%和77.76%，在屬水平上，以庫(kù)克菌屬（24.49%和44.31%）、微桿菌屬（19.83%和25.52%）和馬賽菌屬（10.35%和4.48%）為優(yōu)勢(shì)屬。冰樣中的最優(yōu)勢(shì)屬為庫(kù)克菌屬，而融水樣和雪樣中的最優(yōu)勢(shì)屬均為微桿菌屬［圖7（b）］。

2.5 冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌多樣性

辛普森多樣性指數(shù)（Simpson’s diversity index）、物種均勻度指數(shù)（species evenness index）、香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon-Weiner index）和物種數(shù)目（number of species）4個(gè)多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果均表明不同培養(yǎng)溫度，冬克瑪?shù)妆? 種樣品總的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性不同，且10 ℃培養(yǎng)條件下，可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性高于25 ℃［圖8（a）］。

圖8 冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌α-多樣性（a）和β-多樣性（b）Fig. 8 α-diversity （a） and β-diversity （b） of the culturable bacteria from the Dongkemadi Glacier

4 個(gè)多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)不同生境，可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性也不同。其中，香農(nóng)-威納指數(shù)和物種數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致，在10 ℃和25 ℃兩個(gè)培養(yǎng)條件下多樣性均表現(xiàn)為冰樣＞融水樣＞雪樣。兩個(gè)溫度培養(yǎng)條件下辛普森多樣性一致表現(xiàn)為融水樣＞冰樣＞雪樣［圖8（a）］。10 ℃培養(yǎng)條件下物種均勻度：雪樣＞融水樣＞冰樣；25 ℃培養(yǎng)條件下物種均勻度：融水樣＞雪樣＞冰樣［圖8（a）］。NMDS 圖結(jié)果顯示冬克瑪?shù)妆?種不同生境的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯不同，且相比雪樣，冰樣與融水樣的可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相近［圖8（b）］。

3 討論

3.1 可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

本研究從冬克瑪?shù)妆ǚ蛛x得到的可培養(yǎng)細(xì)菌可分為4個(gè)門(mén)，分別是放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，與其他冰川研究結(jié)果一致［10，13，22-24］。無(wú)論在可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量還是物種數(shù)目方面，放線菌門(mén)都是冰川生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)［25-27］，本研究中冬克瑪?shù)妆ㄒ灿蓄?lèi)似的結(jié)果。

不同溫度下冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量顯著不同，在10 ℃培養(yǎng)條件下可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量高于25 ℃。相關(guān)研究結(jié)果表明，不同培養(yǎng)溫度下可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異顯著［17］，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量與溫度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［28-29］。冰川細(xì)菌經(jīng)過(guò)了一定時(shí)間的反復(fù)融凍和低溫封存，冰樣和融水樣的細(xì)菌群落已發(fā)生了變化，部分不耐冷的細(xì)菌因不適應(yīng)低溫環(huán)境而被淘汰，存活下來(lái)的細(xì)菌可能更適應(yīng)低溫環(huán)境。冷桿菌屬、嗜冷桿菌屬和極單胞菌屬等只在10 ℃培養(yǎng)條件下被分離的耐冷細(xì)菌，極大可能在冰川消融的大趨勢(shì)下消失；而纖維素單胞菌屬、血桿菌屬和副球菌屬這些只在25 ℃培養(yǎng)溫度分離得到的非耐冷細(xì)菌，隨著冰川消融，它們可能在經(jīng)過(guò)低水溫的冰前河流時(shí)就被淘汰。

本研究結(jié)果與其他冰川對(duì)比，包括安第斯山脈玻利瓦爾冰川［26］、北極斯瓦爾巴群島冰川［30］、卓奧友峰冰川［31］、天山烏魯木齊河源1 號(hào)冰川［32-33］、老虎溝12 號(hào)冰川［33-34］和慕士塔格冰川［22，33，35］等［11，36-38］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)包括優(yōu)勢(shì)屬（庫(kù)克菌屬、微桿菌屬和馬賽菌屬）在內(nèi)的28 個(gè)屬在其他冰川均被發(fā)現(xiàn)，而纖維素單胞菌屬、假節(jié)桿菌屬、根戈德里谷氨酸桿屬、血桿菌屬、Aquirhabdus、皺紋單胞菌屬、鞘氨醇盒菌屬和Kaistella在其他冰川未見(jiàn)報(bào)道。冬克瑪?shù)妆òl(fā)現(xiàn)的細(xì)菌門(mén)和優(yōu)勢(shì)屬在其他冰川相關(guān)研究中也被發(fā)現(xiàn)，可能是由于這些冰川相似的極端環(huán)境對(duì)于細(xì)菌的選擇性造就了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性。冬克瑪?shù)妆ù嬖诖罅开?dú)有的屬，這可能是由于其微生物來(lái)源不同，并且受到溫度、濕度、太陽(yáng)輻射程度和營(yíng)養(yǎng)水平等一系列環(huán)境條件的影響而造成的［39］。研究還發(fā)現(xiàn)疑似新種49 株，分離的可培養(yǎng)細(xì)菌中32.21%為潛在新種，說(shuō)明冰川是一個(gè)極好的微生物資源庫(kù)［40］，可以為冰凍圈微生物資源開(kāi)發(fā)及利用提供數(shù)據(jù)支撐及菌種資源。目前，冰川消融的情況十分嚴(yán)峻，在冰川消失前相關(guān)領(lǐng)域的科研工作者應(yīng)盡力保存微生物資源以便進(jìn)一步研究和利用［41］。

3.2 不同生境中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異

比較三種生境可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同生境中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性不同。不同生境中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異顯著。在其他冰川也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似現(xiàn)象，有研究表明崇測(cè)冰帽雪樣、土樣和冰磧物中的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異很大［10］；祁連山七一冰川雪和融水中的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異同樣很大［38］。冰樣中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)高于融水樣和雪樣，這可能與樣品中的非水溶性固形物有關(guān)，冰樣中非水溶性固形物含量最多，為細(xì)菌提供了穩(wěn)定棲息的微環(huán)境。

在屬水平雪樣、冰樣和融水樣中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌有重合，但部分屬是單一樣品獨(dú)有的。相似結(jié)果在其他冰川也有報(bào)道，如崇測(cè)冰帽雪樣、土樣和冰磧物［10，42］；青藏高原竹溪冰川融化池和冰周河流［42］；玉龍雪山白水1 號(hào)冰川前沿土壤和融水［44］。這3 種生境重合的細(xì)菌是微桿菌屬，在其他冰川的生境中也比較常見(jiàn)［24，27，45］，微桿菌屬還是冬克瑪?shù)妆ǖ膬?yōu)勢(shì)屬，其很有可能在冰川生態(tài)系統(tǒng)中穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。冰樣中發(fā)現(xiàn)的屬最多，雪樣有75%的屬與冰樣重合，融水樣有64.3%的屬與冰樣重合，雪樣只有12.55%的屬與融水樣重合；說(shuō)明相比融水樣，雪樣和冰樣的群落相似度更高；且相比雪樣，融水樣和冰樣的群落相似度更高。冬克瑪?shù)妆?月末的平均溫度在0 ℃以下［15］，冰川雪消融較少，冰川融水大部分來(lái)自受冰體壓力和地?zé)崛诨牡讓颖?，?dǎo)致了雪與融水細(xì)菌群落差異巨大。

3.3 可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子相關(guān)性分析

研究發(fā)現(xiàn)冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌數(shù)量與Cl-、K+和Ca2+的含量，以及pH 和EC 呈正相關(guān)關(guān)系，與海拔（EL）呈反相關(guān)關(guān)系（表2）。相關(guān)研究表明，K+和Ca2+等離子濃度可代表冰雪中粉塵的含量［46-47］，粉塵不僅可作為細(xì)菌的“載體”，將微生物從冰川周?chē)h(huán)境中攜帶至冰川，其中還含有微生物賴以生存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為微生物提供了生存的微生態(tài)環(huán)境。已有的研究表明pH 值同樣對(duì)細(xì)菌數(shù)量影響顯著［48-49］，主要原因可能是本次雪樣的pH 呈弱酸性，而冰和融水的pH 值均在7左右，中性的環(huán)境更適合絕大多數(shù)細(xì)菌的生存。

表2 可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性Table 2 Correlation between culturable bacterial diversity and environmental factor

研究結(jié)果表明，環(huán)境因子還會(huì)影響微生物群落的多樣性［50-51］。在之前冰川微生物相關(guān)研究中未發(fā)現(xiàn)多樣性與Cl-濃度的明顯相關(guān)性，但在鹽堿化土壤微生物的研究中發(fā)現(xiàn)了與本研究相似的結(jié)果［50］。對(duì)于pH 值與細(xì)菌多樣性的相關(guān)性，部分研究與本研究有類(lèi)似的結(jié)論［52］，但還有研究結(jié)果表明pH 值與細(xì)菌多樣性在不同生境的相關(guān)關(guān)系不同［53］。pH值與細(xì)菌多樣性的相關(guān)關(guān)系受生境酸堿性影響，大多微生物更適合中性環(huán)境，環(huán)境是酸性時(shí)，pH 值與細(xì)菌多樣性是正相關(guān)關(guān)系［54-55］，環(huán)境是堿性時(shí)，pH值與細(xì)菌多樣性是負(fù)相關(guān)關(guān)系［56］。

4 結(jié)論

本研究以冬克瑪?shù)妆ㄑ?、冰和融水為研究?duì)象，分離得到三類(lèi)樣品中放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，其中放線菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。雪樣在不同培養(yǎng)溫度下得到的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異不顯著；而冰樣和融水樣在不同培養(yǎng)溫度下得到的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異顯著。

冰樣中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)高于融水樣和雪樣，這可能與樣品中的非水溶性固形物有關(guān)，冰樣中非水溶性固形物含量最多，為細(xì)菌提供了穩(wěn)定棲息的微環(huán)境。在屬水平，雪樣、冰樣和融水樣中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌有重合，雪樣和冰樣的群落相似度更高。

Cl-、K+、Ca2+、Na+和Mg2+的含量和pH 與冬克瑪?shù)妆膳囵B(yǎng)細(xì)菌數(shù)量和多樣性均呈正相關(guān)關(guān)系，且與Cl-、Ca2+的含量和pH 的相關(guān)性較大，這可能與冰川中粉塵的含量有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)疑似新種49株，分離的可培養(yǎng)細(xì)菌中32.21%為潛在新種，說(shuō)明冰川是一個(gè)極好的微生物資源庫(kù)，可以為冰凍圈微生物資源開(kāi)發(fā)及利用提供數(shù)據(jù)支撐及菌種資源。

致謝：對(duì)唐古拉冰凍圈與環(huán)境觀測(cè)研究站全體成員在本研究采樣階段提供的幫助與指導(dǎo)表示衷心的感謝。