蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面法優(yōu)化及其抗氧化活性測定

鐘鑫榮，白偉娟，周春梅，林金福，黃千慧，張維瑞，劉盛榮，魏 奇*

（1.寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100;2.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002;3.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100;4.廈門市燕之屋絲濃食品有限公司，福建 廈門 361100)

蛹蟲草（Cordyceps militaris）也稱北冬蟲夏草和北蟲草,其蛹多為鱗翅目昆蟲的蛹，草則為真菌的子實體部分，由這兩部分組成的復(fù)合體即為蛹蟲草.真正的蛹蟲草含有蟲體，沒有蟲體的為蟲草花.蛹蟲草具有益腎補(bǔ)陽、止血化痰、抗疲勞、改善睡眠質(zhì)量等作用[1-3]，其主要天然活性成分包括蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸、蟲草甾醇、蟲草多肽、凝集素、超氧岐化酶和類胰島素蛋白等[4-6]，其中，蟲草多糖與超氧化物歧化酶是蛹蟲草的重要活性成分，藥用價值顯著.已有研究表明，蟲草多糖能使機(jī)體的血清免疫球蛋白抗體的含量增加，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫能力和抑制腫瘤細(xì)胞的生長[7-8]；蟲草酸對增加免疫力和緩解心腦血管等疾病具有積極的作用[9-12]；蟲草素作為一類核苷酸物質(zhì)，具有抑菌和抑制癌細(xì)胞生長的作用[13].

傳統(tǒng)的發(fā)酵方法主要包括液體發(fā)酵和固體發(fā)酵.固體發(fā)酵是將微生物接種于沒有或幾乎沒有游離水的固態(tài)基質(zhì)上進(jìn)行發(fā)酵，傳統(tǒng)的固體發(fā)酵技術(shù)常應(yīng)用于白酒和陳醋等產(chǎn)品的生產(chǎn)[14-16].液體發(fā)酵是指將物料首先制備成液態(tài)，再將微生物接入而產(chǎn)生的生物反應(yīng)過程.相比于固體發(fā)酵，液體發(fā)酵具有速度快、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點[17-19].研究發(fā)現(xiàn)，采用液體深層發(fā)酵的方法制備的蛹蟲草菌絲體具有和天然采集的蛹蟲草相類似的活性物質(zhì)，利用蛹蟲草液體發(fā)酵技術(shù)制備蛹蟲草活性物質(zhì)能夠縮短蛹蟲草的生產(chǎn)周期[20].

鑒于此，本研究以蛹蟲草生物量為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化蛹蟲草的液體培養(yǎng)基組成配方，以期為食品工業(yè)化利用蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蛹蟲草天然活性物質(zhì)提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要材料

蛹蟲草（寧德師范學(xué)院微生物室提供）、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、MgSO4，以及分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）.

馬鈴薯液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g、蛋白胨4 g、酵母粉5 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g,水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min.滅菌后將液體種子培養(yǎng)基分別裝入容量為250 mL三角錐形瓶中，每瓶裝液100 mL.

1.2 主要儀器設(shè)備

DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱（上海飛越實驗儀器有限公司），YP802N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司），HH-4 型恒溫水浴鍋（常州億通分析儀器制造有限公司），NRY-200 型恒溫培養(yǎng)搖床（上海南榮實驗室設(shè)備有限公司），SC-3612 型低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）.

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 使用接種針取適量斜面保存的菌株接種至馬鈴薯液體培養(yǎng)基，并置于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d.

1.3.2 種子液制備 從蛹蟲草母種液體培養(yǎng)基中取5 mL的菌種液體，接種到裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖床培養(yǎng)60 h（25 ℃，150 r·min-1），然后重新轉(zhuǎn)接一次，接種量5 mL,搖床培養(yǎng)60 h（25 ℃，150 r·min-1）.

1.3.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化 單因素試驗：根據(jù)蛹蟲草生長所需要營養(yǎng)條件，設(shè)定葡萄糖添加量（10、20、30、40 g·L-1），蔗糖添加量（10、20、30、40 g·L-1），蛋白胨添加量（1、3、5、7、9 g·L-1）和酵母粉添加量（1、3、5、7、9 g·L-1），以生物量為指標(biāo)，先對碳源作出篩選，再對氮源進(jìn)行篩選，由此獲得蛹蟲草最優(yōu)液體培養(yǎng)基配方.

正交試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對葡萄糖、蔗糖和蛋白胨添加量進(jìn)行3 因素3 水平正交試驗，優(yōu)化培養(yǎng)基組成.響應(yīng)面因素水平見表1.

表1 響應(yīng)面因素與水平表

1.3.4 生物量測定 菌絲用紗布過濾，蒸餾水清洗3 遍，然后置于55 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，稱量即得生物量.

1.3.5 蛹蟲草對DPPH自由基的清除能力測定 參考文獻(xiàn)[21]的方法進(jìn)行測定，以水溶性維生素E為對照組.

1.3.6 蛹蟲草對ABTS自由基的清除能力測定 參考文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行測定，以水溶性維生素E為對照組.

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實驗重復(fù)測定3 次，取其平均值，應(yīng)用SPSS 16.0 和Design-Expert 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用Graphpad Prism 9作圖.

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對蛹蟲草生物量的影響

由圖1 可知，蛹蟲草生物量隨著碳源（蔗糖或葡糖糖）添加量的增加，呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢.當(dāng)碳源的添加量為20 g·L-1時，蛹蟲草生物量達(dá)到最大值；當(dāng)碳源添加量大于20 g·L-1時，蛹蟲草生物量呈現(xiàn)下降的趨勢.當(dāng)2種碳源添加量相同時，蔗糖液體培養(yǎng)基所獲得的蛹蟲草生物量高于葡萄糖液體培養(yǎng)基所獲得的蛹蟲草生物量.由此可見，蔗糖液體培養(yǎng)基更適合蛹蟲草菌絲體生長.故選定蔗糖作為蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，最佳添加量為20 g·L-1.

圖1 不同碳源添加量對蛹蟲草生物量的影響

2.2 蛋白胨添加量對蛹蟲草生物量的影響

如圖2所示，隨著蛋白胨添加量的升高，蛹蟲草生物量逐漸增加，當(dāng)添加量為7 g·L-1時，蛹蟲草生物量顯著增加（P<0.05），其生物量達(dá)最大值（2.45 g）；隨后，隨著蛋白胨添加量的增加，蛹蟲草生物量呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢，當(dāng)添加量為9 g·L-1時，蛹蟲草生物量與添加量為7 g·L-1時蛹蟲草生物量不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），此時繼續(xù)增加蛋白胨無法提高蛹蟲草的生物量.故選定蛋白胨最佳添加量為7 g·L-1.

圖2 蛋白胨添加量對蛹蟲草生物量的影響

2.3 酵母粉添加量對蛹蟲草的影響

由圖3可知，當(dāng)酵母粉添加量小于3 g·L-1時，隨著酵母粉添加量的增加，蛹蟲草生物量顯著增加（P<0.05），在添加量為3 g·L-1時，生物量達(dá)到最大值（2.13 g）；而當(dāng)酵母粉添加量大于3 g·L-1時，隨著酵母粉添加量的增加蛹蟲草生物量逐漸減少.因此，選定酵母粉最佳添加量為3 g·L-1.

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

表2 為試驗設(shè)計優(yōu)化后的結(jié)果.應(yīng)用Design Expert 8.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，由此獲得由蔗糖（A）、蛋白胨（B）和酵母粉（C）對蛹蟲草生物量的回歸方程：Y(生物量）=2.53+0.0887A+0.1137B-0.0125C-0.0775AB-0.065AC+0.025BC-0.1652A2-0.1302B2-0.1427C2.

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

由表3可知，Y（生物量）的回歸模型的F=28.91且P=0.000 1<0.05，說明該模型具有顯著的線性關(guān)系.失擬性P=0.075 2>0.05，不存在顯著性差異，說明該方程具有良好的擬和性.由此可見，此驗證方法可靠，該模型可用于預(yù)測蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化.對蔗糖添加量和酵母粉添加量，蔗糖添加量和蛋白胨添加量之間的顯著性分析表明：AB 和AC 的P值均小于0.05，說明蔗糖添加量和酵母粉添加量，蔗糖添加量和蛋白胨添加量對蛹蟲草生物量具有顯著影響；BC項P>0.05，說明酵母粉添加量和蛋白胨添加量之間對蛹蟲草生物量的影響不顯著.

表3 方差分析表

如圖4A所示，蔗糖添加量和蛋白胨添加量較小時，蛹蟲草生物量較小.蛹蟲草生物量隨著蔗糖添加量和蛋白胨添加量的增加而增加，蔗糖添加量和蛋白胨添加量之間的交互作用能夠顯著影響蛹蟲草的生物量（P<0.05）.此時等高線圖呈現(xiàn)為橢圓形，表明蔗糖添加量和蛋白胨添加量這兩個因素的交互作用明顯（圖4a）.

圖4 兩因素交互作用對蛹蟲草生物量的響應(yīng)面圖及等高圖

當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿恳欢〞r，酵母粉添加量和蔗糖添加量對蛹蟲草生物量的影響結(jié)果如圖4B 所示.酵母粉添加量固定時，隨著蔗糖添加量的增加，蛹蟲草生物量先增加然后降低；蔗糖添加量固定時，增加酵母粉添加量，蛹蟲草生物量先增加然后減少.酵母粉添加量和蔗糖添加量的交互作用對蛹蟲草生物量存在顯著性影響（P<0.05），并且等高圖為橢圓形，說明酵母粉添加量和蔗糖添加量這兩個因素對蛹蟲草生物量的交互作用明顯（圖4b）.

由圖4C 可知，當(dāng)酵母粉添加量固定時，蛹蟲草生物量隨著蛋白胨添加量的增加呈現(xiàn)出先增加然后減少的趨勢.如圖4c 所示，等高線形狀為圓形由此表明蛋白胨添加量和酵母粉添加量之間的交互作用不顯著（P>0.05）.故最優(yōu)的配方為：蔗糖32 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母粉4 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、磷酸二氫鉀1.0 g·L-1，在此條件下，蛹蟲草生物量為2.41 g，接近理論值（2.37 g），說明優(yōu)化結(jié)果可靠.

2.5 蛹蟲草的抗氧化活性分析

2.5.1 蛹蟲草清除DPPH 自由基能力的測定 由圖5 可知，隨著蛹蟲草菌絲體濃度的增加，蛹蟲草對DPPH 自由基的清除率也隨之增加，并且呈現(xiàn)出量效關(guān)系.當(dāng)濃度為0.4 mg·mL-1時，蛹蟲草菌絲體對DPPH 自由基的清除率為25.86%；當(dāng)濃度為2.0 mg·mL-1時，蛹蟲草菌絲體對DPPH 自由基的清除率最大（82.88%），顯著高于其他處理組（P<0.05）.當(dāng)濃度為0.4 mg·mL-1時，水溶性維生素E 對DPPH 自由基的清除率為94.17%.由此可知，在相同濃度條件下，水溶性維生素E 對DPPH 自由基的清除作用強(qiáng)于蛹蟲草菌絲體.

圖5 蛹蟲草對DPPH 自由基的清除能力

2.5.2 蛹蟲草清除ABTS自由基能力的測定 由圖6所示，蛹蟲草菌絲體對ABTS自由基具有清除能力，當(dāng)蛹蟲草菌絲體濃度為0.4～2.4 mg·mL-1時，ABTS 自由基清除率與蛹蟲草菌絲體濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，蛹蟲草菌絲體對ABTS 自由基清除率隨著蛹蟲草濃度的升高而增強(qiáng).當(dāng)濃度為2.4 mg·mL-1時，ABTS 清除率為77.48%，說明蛹蟲草菌絲體具有體外清除ABTS 自由基的能力.當(dāng)濃度為0.4 mg·mL-1時，水溶性維生素E 對ABTS 自由基的清除率為94.90%.由此可知，在相同濃度的條件下，水溶性維生素E對ABTS自由基的清除作用強(qiáng)于蛹蟲草菌絲體.

圖6 蛹蟲草對ABTS 自由基的清除能力

3 討論與結(jié)論

人工種植蛹蟲草因周期長、技術(shù)難度大，不利于大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用開發(fā)，而采用液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得蛹蟲草菌絲體，具有節(jié)約成本、生長周期短和操作技術(shù)簡單等優(yōu)點，有利于大規(guī)模制備蛹蟲草的天然活性物質(zhì).楊爽等[23]研究發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化蛹蟲草液體發(fā)酵條件，能夠提高醇溶蛋白的必需氨基酸含量；周廣乙等[24]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖可以作為蛹蟲草液體培養(yǎng)基的碳源，增加蛹蟲草生物量的產(chǎn)率.本研究以蔗糖添加量、酵母粉添加量和蛋白胨添加量為變量，以蛹蟲草生物量為指標(biāo)，通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化得到蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最為配方為蔗糖32 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母粉4 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、磷酸二氫鉀1.0 g·L-1，此最佳配方的蛹蟲草生物量為2.41 g，接近預(yù)測值（2.37 g）.該研究結(jié)果與秦鵬等[25]關(guān)于蛹蟲草生物量（2.57 g）的研究結(jié)果相近.

郭笑等[26]研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草子實體中分離得到的腦苷脂類單體能夠增加氧化損傷細(xì)胞中的超氧化物歧化酶含量，并且能夠有效降低其丙二醛含量.由此可知，蛹蟲草具有體外抗氧化作用.郭靜科等[27]研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草子實體粉末和菌絲體粉末對DPPH 和氧自由基具有清除作用，這可能是因為蛹蟲草中的蟲草素和蟲草多糖等物質(zhì)具有抗氧化活性有關(guān).該研究結(jié)果與本研究關(guān)于蛹蟲草菌絲體的研究結(jié)果相一致，證實了蛹蟲草菌絲體對DPPH 自由基具有體外清除作用.本研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌絲體具有出一定的體外抗氧化活性，蛹蟲草菌絲體能夠有效清除DPPH 和ABTS 自由基的作用.本研究可為蛹蟲草功能性產(chǎn)品的開發(fā)利用及抗氧化評價提供理論研究基礎(chǔ)，對蛹蟲草資源的利用具有參考意義.