一款益生菌復(fù)合制劑雙向調(diào)節(jié)斑馬魚腸道動(dòng)力作用研究

◎ 吳綺霞，高前程，梁枝聰，郭亞娟，高業(yè)成，豐時(shí)運(yùn)

（1.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400；2.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400）

腸道運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱在一定程度上影響著腸道的生理功能，最終影響著人體的健康[1]。腸道動(dòng)力紊亂是腸易激綜合征（Irritable Bowel Syndrome，IBS）癥狀發(fā)生的重要病理表現(xiàn)[2]。以腹瀉為主的IBS 患者呈腸道動(dòng)力亢進(jìn)的表現(xiàn)，腸道收縮次數(shù)增加，排泄次數(shù)頻繁，大便性狀改變；便秘型IBS 則表現(xiàn)為腸道動(dòng)力不足，排泄困難。此外，還有以上兩種腸動(dòng)力異常類型的混合型及不定型IBS。這類疾病的發(fā)病機(jī)制可能與飲食、內(nèi)臟敏感性、神經(jīng)心理、胃腸道炎癥和腸道動(dòng)力紊亂等多種因素相關(guān)[3]。

益生菌是一種具有多種益生作用的微生物，對(duì)人體健康有重要作用。具有腸道定植能力的益生菌能通過(guò)改善腸道菌群提高消化系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)吸收能力以及機(jī)體免疫力[4-6]。所以，研究開發(fā)能夠調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力的益生菌功能食品，有助于對(duì)腸道動(dòng)力紊亂疾病進(jìn)行有效的預(yù)防和治療。

斑馬魚被廣泛應(yīng)用于研究疾病機(jī)制和藥物研發(fā)及篩選[7-8]，其與人類的遺傳基因高度相似，且其腸道結(jié)構(gòu)和解剖結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物非常相似[9]，是腸道疾病研究的理想模型。發(fā)育至5～6 d 的幼魚，腸道會(huì)自發(fā)蠕動(dòng)，可通過(guò)統(tǒng)計(jì)幼魚腸道蠕動(dòng)次數(shù)評(píng)價(jià)藥物的腸道功能活性[10]。本文利用斑馬魚模型，研究了益生菌復(fù)合制劑中的復(fù)合益生菌定植能力、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)作用以及緩解由番瀉葉引起的非細(xì)菌性腹瀉作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB 品系斑馬魚，自然成對(duì)交配繁殖，年齡為受精后4～5 d，用于腸腔定植、促腸道蠕動(dòng)、改善非細(xì)菌性腹瀉實(shí)驗(yàn)。用28 ℃養(yǎng)魚用水（pH 值為6.5～8.5，硬度為50～100 mg·L-1CaCO3，電導(dǎo)率為450～550 μS·cm-1）飼養(yǎng)斑馬魚，實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為 SYXK（浙）2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國(guó)際 AAALAC 認(rèn)證（認(rèn)證編號(hào)：001458）要求。

1.2 材料與試劑

益生菌復(fù)合制劑（主要成分為植物乳植桿菌LPPerfectus?001、鼠李糖乳酪桿菌LRPerfectusTM158、鼠李糖乳酪桿菌HN001、嗜酸乳桿菌NCFM、動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HN019），由完美（廣東）日用品有限公司提供，淡紫紅色粉末，1.5 g/袋，345 億CFU/袋，-20 ℃保存。使用前將益生菌復(fù)合制劑常溫放置1 h，準(zhǔn)確稱取0.15 g 于15 mL 離心管中，向其中加入10 mL 0.01 mol·L-1PBS，振蕩混合均勻，益生菌的最終濃度為3.45×108CFU·mL-1。將菌液于4 ℃，4 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，并重復(fù)2 次，將益生菌復(fù)合制劑中添加的輔料清洗干凈，現(xiàn)配現(xiàn)用。尼羅紅Nile Red：批號(hào)SLBP9326V，Sigma，用DMSO 配制成濃度為 10 mg·mL-1的母液，-20 ℃保存，使用前用胚胎培養(yǎng)液配制成10 ng·mL-1溶液。CM-DiI（紅色熒光）：批號(hào)C5324420，翌圣，使用前，加入50 μL DMSO 使其徹底溶解，然后使用PBS 將其稀釋至工作濃度5 μg·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用。二甲基亞砜（DMSO）：批號(hào)20210701，天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲基纖維素：批號(hào)20210402，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：批號(hào)8122734，gibco 公司；番瀉葉提取物：批號(hào)A3042221，由廣東一方制藥有限公司提供，番瀉苷A（C43H38O20）和番瀉苷B（C42H38O20）的含量為12.2 mg·g-1，使用前用胚胎培養(yǎng)液配制成8 mg·mL-1溶液。胚胎培養(yǎng)液：分別稱取7.000 g NaCl、0.400 g NaHCO3、0.100 g KCl、0.235 g CaCl2用超純水溶解，定容至2 L 容量瓶。使用真空過(guò)濾器（孔徑0.2 μm）過(guò)濾后滅菌備用。實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。6 孔、12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，康寧公司。

1.3 儀器與設(shè)備

BX43 正置熒光顯微鏡，OLYMPUS 公司；ZXGPA2160 恒溫培養(yǎng)箱，上海智成分析儀器制造有限公司；愛生研究級(jí)斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)；MS1003S/01 電子分析天平，梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司；5430/R 小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 復(fù)合益生菌在斑馬魚腸腔定植存活實(shí)驗(yàn)

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)確定復(fù)合益生菌對(duì)正常斑馬魚的無(wú)可見有害作用（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）濃度為3.45×108CFU·mL-1。在經(jīng)前處理后的菌體中加入10 mL 含5 μg·mL-1CM-Dil 的1×PBS 溶液，37 ℃孵育20 min，孵育結(jié)束后離心收集菌體，并用0.01 mol·L-1PBS 清洗兩遍，再次離心后加入10 mL 胚胎培養(yǎng)液振蕩混合均勻，復(fù)合益生菌終濃度為3.45×108CFU·mL-1。

隨機(jī)挑選發(fā)育正常的5 dpf 斑馬魚胚胎置于12 孔板中，每孔15 尾，每孔加入熒光標(biāo)記后的益生菌菌液1 mL，28 ℃培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)24 h，于共培養(yǎng)期間的2 h、6 h、18 h、24 h 進(jìn)行拍照，分別隨機(jī)選取10 尾斑馬魚，用正置熒光顯微鏡拍照，觀察各時(shí)間段內(nèi)復(fù)合益生菌于其腸腔內(nèi)分布情況。共同培養(yǎng)結(jié)束后，用無(wú)菌的胚胎培養(yǎng)液將斑馬魚胚胎清洗3 次，轉(zhuǎn)入到新的孔板中，每天更換胚胎培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 dpf。于胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)的2 h、6 h、18 h、24 h 和48 h 進(jìn)行熒光拍攝，觀察移除復(fù)合益生菌培養(yǎng)后，斑馬魚腸腔內(nèi)熒光情況。用ImageJ 圖像處理軟件進(jìn)行熒光圖像分析，計(jì)算斑馬魚腸腔內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.4.2 對(duì)斑馬魚腸道蠕動(dòng)的促進(jìn)作用評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)參考賈福懷等[11]實(shí)驗(yàn)方法，并加以修改。在經(jīng)前處理后的菌體中加入10 mL 胚胎培養(yǎng)液振蕩混合均勻，使復(fù)合益生菌濃度為3.45×108CFU·mL-1。隨機(jī)挑選5 dpf 幼魚，水溶給予尼羅紅（終質(zhì)量濃度為10 ng·mL-1）于28 ℃培養(yǎng)箱避光暴露4 h，使斑馬魚腸道完全充滿尼羅紅染料。尼羅紅暴露結(jié)束，清洗染色后的斑馬魚3 次，將斑馬魚隨機(jī)分配于六孔板中，每孔30 尾斑馬魚，給予前處理后的益生菌3.45×108CFU·mL-1，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，于28 ℃培養(yǎng)箱避光暴露12 h，期間不投餌。暴露12 h 后，每組隨機(jī)選取10 尾斑馬魚，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，使用ImageJ 軟件處理圖像并計(jì)算腸道尼羅紅熒光強(qiáng)度（S），以腸蠕動(dòng)促進(jìn)率評(píng)價(jià)樣品對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用。斑馬魚腸蠕動(dòng)促進(jìn)作用計(jì)算公式為

式中：S1為正常對(duì)照組平均值，Pixels；S2為復(fù)合益生菌實(shí)驗(yàn)組平均值，Pixels。

1.4.3 緩解斑馬魚非細(xì)菌性腹瀉功效評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)參考趙文嘉[12]實(shí)驗(yàn)方法，并加以修改。隨機(jī)挑選5 dpf 幼魚，分配于6 孔板中，每孔各30 尾，設(shè)置正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)合益生菌實(shí)驗(yàn)組。除正常對(duì)照組外，其余各組均給予番瀉葉溶液8 mg·mL-1的方式建立斑馬魚非細(xì)菌性腹瀉模型，于28 ℃培養(yǎng)箱避光處理10 h。造模結(jié)束后，清洗至少3 遍，復(fù)合益生菌實(shí)驗(yàn)組加入前處理后的益生菌3.45×108CFU·mL-1，模型對(duì)照組、正常對(duì)照組加入胚胎培養(yǎng)液，于28 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)6 h。最后各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚避光暴露于尼羅紅水溶液中（終質(zhì)量濃度10 ng·mL-1），于28 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)3 h。孵育結(jié)束后清洗3 遍，每組隨機(jī)選取10 尾斑馬魚，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，使用ImageJ 軟件處理圖像并計(jì)算腸道熒光強(qiáng)度（F），以腹瀉緩解率評(píng)價(jià)樣品改善非細(xì)菌性腹瀉的功效，斑馬魚改善非細(xì)菌性腹瀉的緩解作用計(jì)算公式為

式中：F1為復(fù)合益生菌實(shí)驗(yàn)組平均值，Pixels；F2為正常對(duì)照組平均值，Pixels；F為模型對(duì)照組平均值，Pixels。

1.4.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

腸道蠕動(dòng)促進(jìn)評(píng)價(jià)及緩解腹瀉功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，斑馬魚腸腔益生菌定植存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。結(jié)果使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析，用Dunnett's-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌在斑馬魚腸腔定植實(shí)驗(yàn)

大腸和小腸是益生菌發(fā)揮作用的消化部位，而益生菌能否最終發(fā)揮應(yīng)有的功用，則需要它們?cè)谀c道存活一定時(shí)間[13]。如果益生菌不能黏附定植，就將成為過(guò)路菌，直接被排除出體外。如圖1、圖2 所示，斑馬魚與CM-Dil 紅色熒光標(biāo)記的復(fù)合益生菌共同培養(yǎng)2 h、6 h、18 h、24 h 后，其腸腔的熒光逐漸增強(qiáng)，2 h 時(shí)，復(fù)合益生菌已經(jīng)進(jìn)入斑馬魚腸腔。與2 h 對(duì)比，6 h 時(shí)充滿腸腔，24 h時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最高。共同培養(yǎng)24 h后，腸道熒光強(qiáng)度均隨時(shí)間的推移逐漸下降，且在24 h 仍有熒光信號(hào)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，該復(fù)合益生菌可在腸腔定植，并可存活24 h 以上。

圖1 不同時(shí)間段斑馬魚腸道中的復(fù)合益生菌熒光強(qiáng)度典型圖

圖2 不同時(shí)間段斑馬魚腸道中的復(fù)合益生菌熒光強(qiáng)度圖

2.2 復(fù)合益生菌對(duì)斑馬魚腸道蠕動(dòng)的促進(jìn)作用

給斑馬魚喂食尼羅紅一定時(shí)間后，斑馬魚腸道內(nèi)會(huì)充滿尼羅紅，但腸道內(nèi)的尼羅紅不會(huì)被斑馬魚吸收。因此，在尼羅紅熒光淬滅之前，通過(guò)斑馬魚腸道內(nèi)尼羅紅熒光信號(hào)的強(qiáng)弱可判定斑馬魚腸腔內(nèi)蠕動(dòng)狀況[14]。尼羅紅水溶液染色4 h 后斑馬魚腸腔內(nèi)熒光情況見圖3。使用ImageJ 圖像處理軟件計(jì)算斑馬魚腸腔內(nèi)熒光強(qiáng)度，分析該復(fù)合益生菌對(duì)斑馬魚腸道蠕動(dòng)促進(jìn)作用，結(jié)果見表1。由表1 可知，與正常對(duì)照組相比，斑馬魚給予復(fù)合益生菌6 h后，斑馬魚腸腔內(nèi)的熒光強(qiáng)度顯著降低，腸道蠕動(dòng)促進(jìn)率為28.68%（P＜0.05），表明該益生菌復(fù)合制劑對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)有一定的促進(jìn)作用。

表1 斑馬魚腸腔熒光強(qiáng)度以及復(fù)合益生菌對(duì)斑馬魚腸道蠕動(dòng)促進(jìn)率結(jié)果表

圖3 復(fù)合益生菌對(duì)斑馬魚腸道蠕動(dòng)促進(jìn)作用典型圖

2.3 復(fù)合益生菌緩解斑馬魚非細(xì)菌性腹瀉

番瀉葉有效成分主要為番瀉苷A、B，經(jīng)消化系統(tǒng)吸收分解后，分解產(chǎn)物蒽醌會(huì)刺激骨盆神經(jīng)節(jié)以收縮大腸，引起腹瀉[15]。復(fù)合益生菌對(duì)番瀉葉提取物誘導(dǎo)斑馬魚非細(xì)菌性腹瀉結(jié)果見圖4。使用ImageJ 圖像處理軟件計(jì)算斑馬魚腸腔內(nèi)熒光強(qiáng)度，分析該款復(fù)合益生菌緩解非細(xì)菌性腹瀉效果，結(jié)果見表2。由表2可知，與模型對(duì)照組相比，正常對(duì)照組腸腔內(nèi)熒光強(qiáng)度極極顯著增加（P＜0.001）。斑馬魚腸道內(nèi)容物減少，出現(xiàn)類似腹瀉癥狀。斑馬魚給予復(fù)合益生菌6 h 后，相比于模型對(duì)照組，斑馬魚腸腔內(nèi)的熒光強(qiáng)度顯著增加，腹瀉緩解率為30.25%（P＜0.05），表明該益生菌復(fù)合制劑對(duì)斑馬魚非細(xì)菌性腹瀉具有一定的緩解作用。

表2 斑馬魚腸腔熒光強(qiáng)度以及復(fù)合益生菌對(duì)斑馬魚緩解非細(xì)菌性腹瀉效果結(jié)果表

圖4 該復(fù)合益生菌對(duì)斑馬魚非細(xì)菌性腹瀉緩解作用典型圖

3 討論

3.1 益生菌的腸道定植能力

目前的研究表明，益生菌具有改善腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫、調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功效，主要通過(guò)4 種機(jī)制發(fā)揮作用：抑制病原菌、增強(qiáng)腸道上皮屏障功能、調(diào)節(jié)宿主免疫功能以及參與腸-腦軸調(diào)節(jié)[16]。在機(jī)體中益生菌主要存在于胃、小腸和大腸中[17]。因此，能夠在腸道定植是益生菌發(fā)揮作用的關(guān)鍵?？诜且环N常見的益生菌攝入方式，但由于胃腸道環(huán)境特殊，大多數(shù)定植能力差的益生菌無(wú)法在腸道內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存活，在食用后不久便會(huì)排出體外，導(dǎo)致無(wú)法發(fā)揮出應(yīng)有的益生作用[18]。

在有關(guān)益生菌腸道定植能力的研究中，CHEN等[16]通過(guò)給予斑馬魚乳雙歧桿菌，發(fā)現(xiàn)在6 h 時(shí)益生菌可充滿斑馬魚腸腔，且可存活24 h 以上。郭亞娟等[19]通過(guò)給予斑馬魚復(fù)合益生菌，發(fā)現(xiàn)4 h 時(shí)斑馬魚腸腔已布滿益生菌，并可以在腸腔中穩(wěn)定存活。在本研究中，在斑馬魚與益生菌共同培養(yǎng)期間，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，斑馬魚腸道中檢測(cè)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在6 h 時(shí)復(fù)合益生菌布滿腸道，24 h 時(shí)腸道內(nèi)總熒光強(qiáng)度達(dá)到最高12 781.90±725.91；在無(wú)益生菌培養(yǎng)期間，48 h 時(shí)仍可在斑馬腸道內(nèi)檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明該款益生菌復(fù)合制劑中添加的益生菌具有較好的腸道定植能力。

3.2 益生菌的促腸道蠕動(dòng)作用

隨著飲食的變化和持續(xù)的社會(huì)以及心理壓力，IBS 的患病人數(shù)也在逐年上升，通?；颊哂兄煌潭鹊谋忝匕Y狀[20]。在以往的研究中，一般使用營(yíng)養(yǎng)療法進(jìn)行治療，但大多數(shù)治療只能短期改善，使用益生菌等微生物制劑治療功能性腸胃病正逐漸被人們所接受，大量研究表明腸道菌群對(duì)人體的健康至關(guān)重要[21]。有研究證實(shí)，益生菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸和多肽等具有調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力促進(jìn)腸道蠕動(dòng)作用。益生菌也可以促進(jìn)5-羥色胺分泌，來(lái)調(diào)控腸神經(jīng)反射，作用于迷走神經(jīng)，調(diào)節(jié)胃腸的收縮功能[22]。

已有多項(xiàng)研究表明了益生菌及其組合物的促腸道蠕動(dòng)作用，陳家倫等[23]研究中通過(guò)對(duì)小鼠給予益生菌組合物，發(fā)現(xiàn)低、高劑量均可促進(jìn)小鼠小腸推進(jìn)率，顯著降低首粒黑便時(shí)間。程光麗等[24]的研究中，志愿者在連續(xù)3 個(gè)月服用益生菌產(chǎn)品后，食物在腸道內(nèi)停留時(shí)間顯著性減少，腸動(dòng)次數(shù)及腸道收縮力顯著增加。在本研究中，斑馬魚給予復(fù)合益生菌6 h 后，腸腔內(nèi)的尼羅紅熒光強(qiáng)度下降（P＜0.05），腸道內(nèi)容物減少，腸道蠕動(dòng)促進(jìn)率為28.68%，表明該款益生菌復(fù)合制劑具有促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)的作用。

3.3 益生菌的緩解腹瀉作用

腹瀉主要癥狀為排便量增加，患腹瀉的原因有多種[5]。此外，腸道微生態(tài)系統(tǒng)紊亂會(huì)使炎癥因子增加，引起腸道免疫系統(tǒng)障礙，最終導(dǎo)致腸道黏膜、組織受損[25-26]。已有研究證明，益生菌可以實(shí)現(xiàn)在小腸黏膜上皮細(xì)胞上定植以促進(jìn)β-防御素的產(chǎn)生，進(jìn)一步提高腸上皮細(xì)胞的自我保護(hù)及修復(fù)受損；此外，益生菌的代謝活動(dòng)會(huì)合成具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫的有益代謝物，使病原菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制[27-29]。

在一些研究中，通過(guò)益生菌干預(yù)能夠達(dá)到緩解或治療腹瀉癥狀。汪家琦等[30]利用添加抗生素建立小鼠腹瀉模型，并通過(guò)復(fù)合益生菌灌胃進(jìn)行治療，結(jié)果表明益生菌治療具有修復(fù)隱窩、保護(hù)腸粘膜、減輕腹瀉的功效。在王慕華等[31]的研究中腹瀉患者在益生菌干預(yù)后大便次數(shù)從原來(lái)的4.8 次/日恢復(fù)到了1 次/日，并能夠減輕腹瀉引起的腹痛等癥狀。在本研究中，使用番瀉葉構(gòu)建斑馬魚腹瀉模型，給予該款復(fù)合益生菌進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑馬魚腸道尼羅紅熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著高于模型組，表明該款益生菌復(fù)合制劑具有緩解腹瀉的作用。

4 結(jié)論

該款益生菌復(fù)合制劑經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究，具有良好的腸道定植能力，在斑馬魚腸腔存活時(shí)間較長(zhǎng)。在健康斑馬魚上可有效促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，具有潤(rùn)腸通便的功效；在斑馬魚非細(xì)菌性腹瀉模型上，可有效緩解腹瀉癥狀，減少過(guò)度排泄。綜合上述，該款益生菌復(fù)合制劑能增強(qiáng)健康腸道蠕動(dòng)功能，減輕腸道受到刺激而導(dǎo)致的過(guò)度收縮排泄，維持腸道動(dòng)力平衡，具有雙向調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力作用，可能對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫調(diào)節(jié)、消化等腸道生理功能有著潛在的積極影響，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。