大豆油中蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定方法學(xué)研究

◎ 巫建新，唐順之，李 遙，白 柏，魏劭恒，楊玉瓊，李佳俐，許文東

（1.廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510240；2.中藥制藥過(guò)程技術(shù)與新藥創(chuàng)制國(guó)家工程研究中心，廣東 廣州 510240；3.廣東省藥用脂質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510240）

大豆油是日常生活中常見(jiàn)的一種植物油，主要成分為脂肪，是人體重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，可以為機(jī)體提供能量，維持機(jī)體體溫，支撐臟器，促進(jìn)糖代謝和脂溶性維生素吸收等作用[1]。大豆油含有豐富的脂肪酸，其中亞油酸含量在48%～58%，亞油酸有助于降低血清膽固醇和抑制動(dòng)脈血栓的形成[2]，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

通過(guò)壓榨或者溶劑提取得到的大豆毛油含有較多的雜質(zhì)，不能直接食用，必須經(jīng)過(guò)脫膠、脫酸、脫色、脫臭等精煉工序處理，去除其中殘留的膠質(zhì)、色素、氧化物、磷脂、蛋白質(zhì)、游離脂肪酸、金屬元素等大部分雜質(zhì)，才能有較好的外觀、氣味、滋味和貯藏穩(wěn)定性。其中油脂和蛋白質(zhì)混合受熱會(huì)產(chǎn)生更多的苯并芘[3]，而苯并芘是一種強(qiáng)致癌物[4]，我國(guó)食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食用植物油中苯并芘的限量不超過(guò)10 μg·kg-1。因此控制大豆油中蛋白質(zhì)殘留量有利于減少大豆油煎炸過(guò)程中苯并芘的產(chǎn)生，提高食用大豆油的安全性。

蛋白質(zhì)測(cè)定方法有定氮法、福林酚法、雙縮脲法、燃燒法、考馬斯亮藍(lán)法以及紫外-可見(jiàn)分光光度法等[5]。雙縮脲法靈敏度偏低，考馬斯亮藍(lán)法對(duì)于不同樣品的蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果可能存在一定偏差，紫外-可見(jiàn)分光光度法易受溶液中的雜質(zhì)影響，標(biāo)準(zhǔn)曲線難以準(zhǔn)確繪制。此外由于大豆油不溶于水，無(wú)法通過(guò)溶解后顯色測(cè)定蛋白質(zhì)；而采用定氮法，可以對(duì)大豆油進(jìn)行消解，去除大豆油基質(zhì)的影響，測(cè)定氮含量，再換算為蛋白質(zhì)含量，更適合測(cè)定大豆油中的蛋白質(zhì)殘留量。本文旨在通過(guò)開(kāi)發(fā)適用于大豆油中蛋白質(zhì)殘留量的分析方法，測(cè)定大豆油中蛋白質(zhì)殘留量，為評(píng)估大豆油中蛋白質(zhì)殘留風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸（AR）、乙醇（AR）、硼酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑，以上試劑均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸滴定液（0.02 mol·L-1），購(gòu)自深圳市博林達(dá)科技有限公司；硫酸銨（≥99.99%），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec? 8420 自動(dòng)凱氏定氮儀，丹麥福斯有限公司；MS204S 電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際有限公司；消化爐，丹麥福斯有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

硼酸（H3HO3）溶液（10 mg·mL-1）：稱取10 g H3HO3，用水溶解并稀釋至1 000 mL；氫氧化鈉（NaOH）溶液（400 mg·mL-1）：稱取40 g NaOH 加水溶解后，放冷，并稀釋至100 mL；甲基紅乙醇溶液（1 mg·mL-1）：稱取0.1 g 甲基紅，用乙醇溶解并稀釋至100 mL，可用超聲水浴促進(jìn)溶解；溴甲酚綠乙醇溶液（1 mg·mL-1）：稱取0.1 g 溴甲酚綠，用乙醇溶解并稀釋至100 mL；混合指示液：每10 L 硼酸溶液添加70 mL 甲基紅乙醇溶液與100 mL 溴甲酚綠乙醇溶液制成；硫酸銨[(NH4)2SO4]標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取105 ℃干燥2 h 的(NH4)2SO4約33 mg，置于100 mL 容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含(NH4)2SO4約0.33 mg 的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液。

濃度梯度基準(zhǔn)物質(zhì)溶液：分別精密吸取硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL 于干燥的250 mL 凱氏消化管中，按照樣品制備方法操作制得系列濃度梯度基準(zhǔn)物質(zhì)溶液。

1.3.2 樣品制備

取供試品0.5 g，精密稱定，移入干燥的250 mL凱氏消化管中，加入2 片凱爾特催化片Cu 3.5 及12 mL硫酸，搖勻。待以上樣品完全浸濕后移至預(yù)熱好的FOSS 消化爐（420 ℃）中，套上排廢罩，開(kāi)啟冷凝水（開(kāi)始時(shí)需將水抽氣泵全開(kāi)，5 min 后調(diào)小抽氣泵水流使酸霧恰好被吸入滌氣罩），開(kāi)始消化，直至全部樣品變?yōu)橥该鞯乃{(lán)綠色澄清液體（大約90 min）后，消化完畢，將消化管連同消化管架和滌氣罩一起從消化爐中取出，冷卻10～20 min 后，加入50 mL 水，備用。同時(shí)制備樣品空白溶液。按照 Foss Kjeltec? 8420 自動(dòng)分析定氮儀的要求，設(shè)定凱氏定氮分析程序進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 試樣中蛋白質(zhì)的計(jì)算

計(jì)算公式為

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100 g；v為樣品溶液消耗鹽酸滴定液（0.02 mol·L-1）的體積，mL；v0為試劑空白消耗鹽酸滴定液（0.02 mol·L-1）的體積，mL；c為鹽酸滴定液濃度，mol·L-1；0.014 0 為鹽酸滴定液（0.02 mol·L-1）相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；m為供試品的質(zhì)量，g；6.25 為供試品中氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用基準(zhǔn)硫酸銨制備6 個(gè)濃度基準(zhǔn)物質(zhì)溶液并使用自動(dòng)分析定氮儀測(cè)定，以氮含量為橫坐標(biāo)，滴定體積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。如表1 所示，氮含量在0.063 6～0.635 9 mg（即相當(dāng)于樣品中蛋白質(zhì)含量在0.080%～0.795%）時(shí)線性關(guān)系良好。

表1 線性和范圍表

2.2 取樣量考察

分別稱取同一大豆油供試品0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、5.0 g，按照供試品溶液的制備方法平行制備2 份。結(jié)果顯示，稱樣量為1.0 g、1.5 g、2.0 g、5.0 g 時(shí)，供試品未能完全消解，消解物呈黑色團(tuán)塊狀，并膨脹至消解管上部，硫酸也因長(zhǎng)時(shí)間消解而揮干。稱樣量為0.5 g 時(shí)，供試品可消解為藍(lán)綠色透明狀液體，因此方法采用的稱樣量為0.5 g。

2.3 檢出限和定量限

制備7 份樣品空白溶液并測(cè)定，通過(guò)空白試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限（Method Detection Limit，MDL），計(jì)算公式如下

式中：n為樣品的平行測(cè)定次數(shù)；t為自由度為n-1，置信度為99%時(shí)的t分布值（單側(cè)），此處t=3.143；S為n次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

計(jì)算結(jié)果如表2 所示，該方法的檢出限為0.027%。

表2 檢出限結(jié)果表

分別稱取同一大豆油供試品9 份，每3 份各添加硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL、0.08 mL、0.10 mL，按照供試品溶液制備方法，制備理論氮加入量為0.035 mg、0.056 mg、0.070 mg 的加標(biāo)供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表3 所示，當(dāng)?shù)尤肓繛?.070 mg 時(shí)，加標(biāo)回收率在92.7%～98.3%，重復(fù)性（n=3）RSD ≤4%，符合定量限要求，此時(shí)對(duì)應(yīng)的含量0.087%即為方法定量限。

表3 定量限結(jié)果表

2.4 精密度

分別稱取同一大豆油供試品6 份，添加硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 mL，按照供試品溶液制備方法，制備理論氮加入量為0.070 mg的加標(biāo)供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算6 份樣品氮含量的RSD 值作為重復(fù)性結(jié)果。另一人員同法操作，計(jì)算兩人員12 份樣品氮含量的RSD值作為中間精密度結(jié)果。同一人員連續(xù)3 d 同法操作，計(jì)算18份樣品氮含量的RSD值作為日間精密度結(jié)果。如表4 所示，重復(fù)性（n=6）、中間精密度（n=12）和日間精密度（n=18）的RSD ≤4%，說(shuō)明本方法精密度良好。

表4 精密度結(jié)果表

2.5 準(zhǔn)確度

分別稱取同一大豆油供試品6 份，添加硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 mL，按照供試品溶液制備方法，制備理論氮加入量為0.070 mg 的加標(biāo)供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果如表5 所示，加標(biāo)回收率在92.1%～97.9%，重復(fù)性（n=6）RSD ≤4%，符合方法學(xué)要求，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度良好。

表5 準(zhǔn)確度結(jié)果表

2.6 樣品測(cè)定

取多批白云山漢方公司自制的大豆油樣品按驗(yàn)證后的蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示大豆油中蛋白質(zhì)殘留量均低于檢出限（0.027%），說(shuō)明大豆油中蛋白質(zhì)殘留風(fēng)險(xiǎn)較低。

3 結(jié)論

本文對(duì)氮測(cè)定法進(jìn)行方法驗(yàn)證，開(kāi)發(fā)出適用于大豆油蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定方法，該方法最高取樣量是0.5 g，繼續(xù)增加取樣量會(huì)導(dǎo)致消化不完全，影響檢測(cè)進(jìn)行。該方法檢出限和定量限分別為0.027%和0.087%。本方法在0.080%～0.795%線性關(guān)系良好，且精密度和準(zhǔn)確度均符合方法學(xué)要求，能滿足大豆油蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定，可以為大豆油蛋白質(zhì)殘留的安全性評(píng)估提供方法依據(jù)。