亞慢性鋁暴露致大鼠認知障礙的Sirt1-Keap1/Nrf2信號通路機制*

劉 衍，劉建華，蕭非凡，王彬鴻，陳薪茹，姜 斌，陳 歡，林 立，張 璟△，李 歡△

（1濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，山東 濱州 256600；2濟寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 濟寧 272000）

鋁是地殼中僅次于氧和硅的第三大化學(xué)元素，也是含量最多的金屬元素［1］，其可通過多種不同形式進入人體，對機體各組織都會造成傷害［2］，神經(jīng)系統(tǒng)對鋁最為敏感［3］。鋁的神經(jīng)毒性是神經(jīng)退行性疾病潛在的危險因素，認知障礙是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中常見的癥狀，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能減退［4］。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一種內(nèi)源性、高度保守的非編碼RNA，可參與多種病理生理過程［5］。研究表明miR-128-3p 是一種多功能的miRNA，可以參與調(diào)控神經(jīng)炎癥性疾病和氧化應(yīng)激，與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)［6］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator1，Sirt1）是一種Ⅲ類組蛋白脫乙酰酶，主要用來檢測氧化底物的缺乏［7］，Sirt1 是miR-128-3p 的一個重要靶點，miR-128-3p 可以調(diào)節(jié)Sirt1 的表達水平［8］。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)抗氧化防御系統(tǒng)［9］，是Sirt1的關(guān)鍵下游靶點［10］。氧化應(yīng)激在許多慢性疾病中有著重要的作用，如糖尿病、腫瘤和神經(jīng)退行性疾病［11］。Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）-Nrf2應(yīng)激反應(yīng)通路在對抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用［12］?；趍iR-128-3p 和Sirt1-Keap1/Nrf2 通路對氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用，為探究鋁暴露神經(jīng)毒性的Sirt1-Keap1/Nrf2 通路機制，本項工作應(yīng)用鋁暴露動物模型，觀察鋁暴露對大鼠海馬組織中miR-128-3p 和Sirt1、Keap1 和Nrf2 蛋白表達水平的影響，探討miR-128-3p 是否可以通過調(diào)控Sirt1-Keap1/Nrf2通路調(diào)節(jié)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激，進而影響大鼠的認知狀況。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

三氯化鋁（分子式： AlCl3·6H2O，結(jié)晶型）（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；麥芽酚（分析純，純度99.0%，Sigma-Aldrich）；兔 抗GAPDH 抗 體（ET1601-4，華安生物科技有限公司）；鼠抗Sirt1抗體（60303-1-Ig）、兔抗Nrf2 抗體（16396-1-AP）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠Ⅱ抗（SA00001-1）（三鷹生物科技有限公司）；兔抗Keap1 抗體（bs-4900R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。Morris 水迷宮及視頻軌跡跟蹤分析系統(tǒng)（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）。

2 實驗方案

2.1 麥芽酚鋁的暴露劑量設(shè)計與制備 2011 年世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（WHO/FAO）將鋁的每周可容許攝入量暫修訂為2.0 mg/kg［13］。對于 1個體質(zhì)量 60 kg 的成人，鋁的每天攝入量不超過17 mg，即成人鋁的每日攝入量不超過 0. 283 mg/kg。根據(jù)人和動物體表面積折算的等效劑量比值計算，大鼠的鋁口服劑量為1.785 mg/kg；根據(jù)不同給藥途徑的劑量換算，大鼠的鋁腹腔注射劑量為 0.535 mg/kg。鋁摩爾質(zhì)量為26. 98 g/mol，故鋁離子濃度約為19.85 μmol/kg；根據(jù)前期實驗的經(jīng)驗［14］，將染毒劑量定為對照組、低、中、高劑量組：0 μmol/kg、10 μmol/kg、20 μmol/kg 和40 μmol/kg。溶液配制方法參照前期實驗［15］，用滅菌的蒸餾水來溶解三氯化鋁，配制成80、40 和20 mmol/L 的氯化鋁溶液；用PBS 溶解麥芽酚，配制成240、120 和60 mmol/L 的麥芽酚溶液，然后將等體積的80 mmol/L 的氯化鋁溶液和240 mmol/L 的麥芽酚溶液混合，得到濃度為40 mmol/L 的麥芽酚鋁溶液，將等體積的40 和20 mmol/L 的氯化鋁溶液分別與120 和60 mmol/L 的麥芽酚溶液相混合，得到20 mmol/L和10 mmol/L的麥芽酚鋁溶液。

2.2 分組和干預(yù)方案 32只6周齡SPF級健康雄性SD 大鼠購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號為SCXK（京）2016-0002］，體重（190±20） g。將大鼠喂養(yǎng)在濟寧醫(yī)學(xué)院動物房內(nèi)，室內(nèi)溫度22～26 ℃，濕度50%左右。大鼠12 h 黑暗/光照（8：00～20：00），普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。大鼠在動物房適應(yīng)一周后，開始分組，按照體質(zhì)量隨機分為4組：對照（control，CG）組、低劑量（low-dose，LG）組、中劑量（medium-dose，MG）組、高劑量（high-dose，HG）組，每組8 只，本實驗采用腹腔注射麥芽酚鋁進行大鼠染毒模型建立。具體方案：4 組大鼠按照1 mL/kg體質(zhì)量給藥，對照組給予生理鹽水溶液（相當(dāng)于麥芽酚鋁暴露劑量為0 μmol/kg），低、中、高組分別給予濃度為10、20和40 μmol/kg 體質(zhì)量的麥芽酚鋁溶液，每周染毒5 d，停2 d，連續(xù)染毒3個月。在染毒期間，每天觀察大鼠攝食及飲水情況、精神和生長發(fā)育等整體狀況。每周對大鼠進行體重測量并記錄。

3 主要實驗方法

3.1 Morris水迷宮訓(xùn)練與測試 實驗步驟：（1）定位巡航實驗［16］：將Morris 水迷宮水池等分為4 個象限，將平臺固定于其中的一個象限內(nèi)，進行實驗，水溫保持在（20～24） ℃之間，周圍環(huán)境恒定。在正式開始實驗的前1 d，將大鼠放入水迷宮中自由活動2 min，并暴露平臺，讓大鼠熟悉迷宮的環(huán)境。正式開始實驗時，將平臺高度放于水面下2 cm 左右，在前5 d 的實驗中，每天將大鼠面向池壁放入水中。記錄大鼠從入水到找到平臺的時間和游過的路線，計算4 個象限內(nèi)找到平臺時間的平均值作為逃避潛伏期，如果大鼠在120 s 內(nèi)沒有找到平臺，將其引導(dǎo)至平臺并讓其在平臺上停留10 s，逃避潛伏期記錄為120 s。（2）空間探索實驗：在第6 天，撤去水下平臺，將大鼠從固定象限放入水中，記錄120 s 內(nèi)大鼠穿越平臺位置和平臺象限的次數(shù)。

3.2 冰凍切片檢測活性氧（reactive oxygen species，ROS） 用冰凍機將大腦皮層進行切片，冰凍切片用純水洗滌后稍甩干，用組化筆在組織周圍畫圈以用來防止抗體的流走，在圈內(nèi)滴入ROS 染液，在37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min。置于PBS 中洗滌3次，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI 染液，室溫避光孵育10 min。PBS 洗滌3 次。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像（DAPI 紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm，發(fā)藍光；CY3 激發(fā)波長510～560 nm，發(fā)射波長590 nm，發(fā)紅光）。

3.3 谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測 取凍存的大鼠海馬，稱重后加入一定量預(yù)冷的PBS，并在冰上充分研磨，1 000×g離心20 min，離心后取上清。按照試劑盒說明書檢測大腦皮層GSH-Px活力；采用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測樣品吸光度（A），計算海馬GSH-Px的含量。

3.4 RT-qPCR 檢測海馬miR-128-3p 表達 用1 mL Trizol 提取海馬組織總RNA，測量RNA 濃度與純度，設(shè)計miR-128-3p的上游引物（序列見表1），下游引物由試劑盒提供。擴增條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變形34 s，60 ℃退火34 s，共40 個循環(huán)。以U6 為內(nèi)參照（引物序列見表1），用2-ΔΔCt法計算miR-128-3p相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

3.5 Western blot檢測海馬組織中Srit1、Nrf2和Keap1蛋白的表達 稱取一定量的海馬組織并加入裂解液、研磨，離心取上清，測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE，電泳條件：80 V 電泳至條帶跑出濃縮膠，升高至120 V，電泳停止后將分離的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜完成后將PVDF 膜浸泡在5%的脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2 h，結(jié)束后用TBST 漂洗。然后分別加入Ⅰ抗（Srit1和Nrf2抗體稀釋比為1∶5 000；Keap1抗體稀釋比為1∶500），4 ℃孵育過夜，分別加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠抗體和山羊抗兔抗體（稀釋比為1∶5 000）。洗膜后ECL 顯色，于暗室中曝光顯影，以目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH 的灰度值比值代表目的蛋白的表達量，用Gelpro32軟件進行統(tǒng)計分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗，計量資料符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，各組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊采用LSD 法檢驗，方差不齊采用Dunnett T3 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Morris 水迷宮檢測各組大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力

結(jié)果顯示，第 1、2 天各組大鼠的平均逃避潛伏期較接近，并無顯著差異（P＞0.05）。在第3、4和5天的實驗中，麥芽酚鋁暴露的三個組的逃避潛伏期均顯著高于對照組（P＜0.05）。在第4、5 天的實驗中高劑量組大鼠的逃避潛伏期顯著高于低劑量組（P＜0.01）。組內(nèi)比較：各組大鼠逃避潛伏期與前一天比較，時間均顯著縮短（P＜0.05），見圖1A。數(shù)據(jù)顯示，在第6 天的空間探索實驗中，與對照組和低劑量組相比，高劑量組穿越平臺和平臺象限的次數(shù)顯著減少（P＜0.01），見圖1。

Figure 1. Morris water maze was used to detect learning and memory function in rats. A： the escape latency of rats in all four groups gradually decreased over time； B： as the exposure dose of maltol aluminum increased，the number of crossing the platform gradually decreased； C： with the increase of maltol aluminum exposure dose，the number of crossing the platform quadrant gradually decreased. Mean±SD. n=8. aP＜0.05 vs the same group on day 1； bP＜0.05 vs the same group on day 2； cP＜0.05 vs the same group on day 3； dP＜0.05 vs the same group on day 4； *P＜0.05，**P＜0.01 vs CG group； ++P＜0.01 vs LG group.圖1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果

2 ROS表達升高和GSH-Px表達下降

隨著染毒劑量的增加，大鼠海馬組織中GSH-Px的含量逐漸減少，其中與對照組和低劑量組相比，高劑量組大鼠海馬中的GSH-Px 含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）；ROS檢測結(jié)果顯示，隨著染毒劑量的增加，大鼠大腦皮層組織中紅色熒光強度顯著增強，表明ROS水平逐漸升高，對照組相比，中劑量組和高劑量組大鼠海馬中的ROS 顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

Figure 2. Relative expression levels of ROS and GSH-Px. A： ROS immunofluorescence staining was performed using DAPI （diamine phenylindole）. The comparison of ROS expression characteristics in the cerebral cortex of rats was observed. After DAPI staining，the nuclei of neurons in the cerebral cortex appeared blue，and there was no statistically significant difference.However，after ROS staining，the cells exhibited a uniform red color，and the intensity of red fluorescence increased with the increasing dose of maltol aluminum exposure. B： as the maltol aluminum exposure dose gradually increased，there was a gradual increase in the relative expression of ROS. C： conversely，as the maltol aluminum exposure dose gradually increased，the relative expression of GSH-Px showed a gradual decrease. The scale bar=200 μm. Mean±SD. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs CG group； +P＜0.05 vs LG group.圖2 各組大鼠ROS和GSH-Px結(jié)果

3 miR-128-3p表達升高

RT-qPCR 結(jié)果顯示各組大鼠海馬組織中miR-128-3p 的相對表達水平隨著麥芽酚鋁暴露劑量的增加逐漸上升，高劑量組中miR-128-3p 相對表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. The expression of miR-128-3p. The expression of miR-128-3p gradually increased with the increase of maltol aluminum exposure dose. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs CG group.圖3 各組大鼠海馬組織中miR-128-3p表達水平

4 各組大鼠海馬組織中Sirt1、Nrf2和Keap1表達

結(jié)果顯示各組大鼠海馬組織中Sirt1和Nrf2的相對表達水平隨著麥芽酚鋁暴露劑量的增加逐漸降低，Sirt1 和Nrf2 蛋白相對表達量在3 個麥芽酚鋁暴露劑量組均低于對照組，高劑量組顯著低于對照組和低劑量組（P＜0.05，P＜0.01）；Keap1 的相對表達水平隨著麥芽酚鋁暴露劑量的增加逐漸上升，Keap1蛋白相對表達量在3 個麥芽酚鋁暴露劑量組均高于對照組，高劑量組顯著高于對照組和低劑量組（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The expression of Sirt1，Nrf2 and Keap1. A： as the exposure dose of maltol aluminum increased，there was a gradual decrease in the relative expression of Sirt1 protein； B： the relative expression of Nrf2 protein gradually decreased with the increase of maltol aluminum exposure dose； C： with the increase of maltol aluminum exposure dose，the relative expression of Keap1 protein showed a gradual increase. Mean±SD. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs CG group； +P＜0.05，++P＜0.01 vs LG group.圖4 各組大鼠海馬組織中Sirt1、Nrf2和Keap1的蛋白表達

討 論

鋁是一種神經(jīng)毒物，當(dāng)機體長期處于鋁暴露的環(huán)境中，可導(dǎo)致神經(jīng)毒性［17］。近年來，鋁的神經(jīng)毒性在不同的動物身上得到證實［18］。在本實驗中，Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示：在定位巡航實驗的第3、4 和5天中，麥芽酚鋁暴露的高劑量組與對照組相比逃避潛伏期顯著增長，說明亞慢性鋁暴露可以損傷大鼠的學(xué)習(xí)能力；在第6 天的空間探索實驗中高劑量組的大鼠穿過平臺及平臺象限的次數(shù)比對照組顯著減少，說明亞慢性鋁暴露也可以減弱大鼠的記憶能力。麥芽酚鋁暴露損害了大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，與之前研究結(jié)果相似［19-20］。

氧化應(yīng)激是指機體受到刺激后，體內(nèi)產(chǎn)生過多的ROS，超過了自身的清除能力，使機體的氧化還原系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致細胞和組織損傷凋亡的過程［21］，在腦組織中引起神經(jīng)元功能障礙或死亡，是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制之一［22］。機體內(nèi)有著抗氧化系統(tǒng)，當(dāng)組織發(fā)生氧化應(yīng)激時可以激活抗氧化系統(tǒng)，減輕氧化應(yīng)激損傷［23］。Keap1-Nrf2 是常見的抗氧化通路［24］，Nrf2 是機體抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是Sirt1 的關(guān)鍵下游靶點［25］，當(dāng)Sirt1 表達下降時，Nrf2 的表達水平也會下降，負調(diào)控氧化應(yīng)激［26］。

Sirt1-Keap1/Nrf2 信號通路的調(diào)控作用在各種疾病中被廣泛研究［27］，本實驗中亞慢性鋁暴露后，大鼠海馬組織Sirt1 表達水平下降，刺激神經(jīng)細胞產(chǎn)生ROS，引起神經(jīng)系統(tǒng)氧化損傷［28］。Keap1 表達水平上調(diào)，而Nrf2表達水平下調(diào)，提示氧化應(yīng)激抑制胞漿內(nèi)Nrf2 向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位，進而抑制下游抗氧化酶GSH-Px等的表達。GSH-Px 是機體抗氧化系統(tǒng)中的一種抗氧化酶，是機體抗氧化指標(biāo)之一［29］。GSH-Px 表達水平的降低說明抗氧化系統(tǒng)失衡，抵抗氧化應(yīng)激損傷的能力下降，使得ROS 對大鼠神經(jīng)元的攻擊作用提升［30］。因此，可以得出Sirt1-Keap1/Nrf2 信號通路在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，亞慢性鋁暴露后可以通過調(diào)節(jié)Sirt1-Keap1/Nrf2通路引起大鼠腦組織氧化應(yīng)激增強，抗氧化系統(tǒng)失衡，發(fā)生氧化損傷，進而可能導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病。

miR-128-3p 可以參與調(diào)控炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的過程［31］，本研究中miR-128-3p 的表達水平隨著麥芽酚鋁暴露劑量的增加而增加，說明麥芽酚鋁的亞慢性暴露可能通過引起大鼠海馬組織中miR-128-3p表達水平的升高來降低海馬組織的抗氧化能力，刺激大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激增強［32］，使大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生氧化損傷。

綜上，鋁暴露可以通過Sirt1-Keap1/Nrf2 信號通路來調(diào)節(jié)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激，也可以通過miR-128-3p 來調(diào)節(jié)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激，Sirt1 又是miR-128-3p 的重要靶標(biāo)［33］，所以推測鋁暴露可能通過調(diào)控miR-128-3p影響Sirt1-Keap1/Nrf2信號通路在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化系統(tǒng)中的作用。即推測鋁暴露可能通過激活大鼠神經(jīng)系統(tǒng)miR-128-3p 的表達，抑制Sirt1-Keap1/Nrf2 信號通路，使其不能被激活發(fā)揮抗氧化能力，導(dǎo)致大鼠神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化系統(tǒng)失衡，造成氧化損傷，誘導(dǎo)大鼠的認知能力減弱。