UPLC-MS/MS法檢測(cè)草魚中恩諾沙星殘留量的不確定度評(píng)估

李嬌 羅景陽(yáng) 李巧蓮 王巖松 陳嬌 宣彤

作者簡(jiǎn)介：李嬌（1989—），女，遼寧撫順人，碩士，工程師。研究方向：食品質(zhì)量安全檢測(cè)。

摘 要：目的：評(píng)估超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）法檢測(cè)草魚中恩諾沙星殘留量的不確定度。方法：依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示（含第1號(hào)修改單）》（JJF 1059.1—2012）、《測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南》（CNAS-GL05—2011）、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006：2019），對(duì)草肉中恩諾沙星的殘留量進(jìn)行不確定度評(píng)估分析。結(jié)果：當(dāng)草魚中恩諾沙星的殘留量為183 ?g·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為12 ?g·kg-1

（k=2），不確定度主要來源于體積不確定度、UPLC-MS/MS儀器的不確定度。結(jié)論：提高檢驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)操作能力，定期校準(zhǔn)UPLC-MS/MS儀，可提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：不確定度；恩諾沙星；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ UPLC-MS/MS）；草魚

Uncertainty Evaluation for the Determination of Enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS

LI Jiao1， LUO Jingyang1， LI Qiaolian1， WANG Yansong1， CHEN Jiao1， XUAN Tong2

（1.Shenyang Institute of Food and Drug Control， Shenyang 110122， China;

2.School of Public Health， Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China）

Abstract： Objective： The uncertainty of measurement in determination of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS is evaluated. Method： According to relevant standards such as JJF 1059.1—2012， CNAS-GL05—2011 and CNAS-GL006： 2019， the uncertainty for the determination of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS was established. Result： When the content of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella was 183 ?g·kg-1， the expanded uncertainty was 12 ?g·kg-1 （k=2）. The uncertainty mainly comes from volume uncertainty and UPLC-MS/MS instrument generated by the uncertainty. Conclusion： Improve the experimental operation ability of inspectors and regularly calibrate UPLC-MS/MS instrument to make it accurate.

Keywords： uncertainty; enrofloxacin; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

（ UPLC-MS/MS）; Ctenopharyngodon idella

測(cè)量不確定度在一定程度上反映了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，檢測(cè)結(jié)果的表述包括被測(cè)量的值及與該值相關(guān)的測(cè)量不確定度。恩諾沙星作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的喹諾酮類動(dòng)物專用藥物，具有廣譜殺菌的作用。長(zhǎng)期食用含有恩諾沙星殘留的魚類，可能導(dǎo)致恩諾沙星在人體內(nèi)蓄積，從而對(duì)人體機(jī)能造成危害，甚至使人體產(chǎn)生耐藥性，影響人體的軟骨發(fā)育，導(dǎo)致畸形等病變。本文以第三方復(fù)檢樣品草魚為例，對(duì)高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry， UPLC-MS/MS）測(cè)定恩諾沙星的測(cè)量不確定度進(jìn)行分析，建立了測(cè)量不確定度評(píng)定方案[1]，以期為食用農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測(cè)提供技術(shù)支持，從而進(jìn)一步保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

1.1.1 主要儀器設(shè)備

電子天平，賽多利斯儀器公司；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，QTRAP 4500串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；LC-20A型超高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理公司；H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；Milli-Q型超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；1 mL移液器、2 mL移液管（A級(jí)）；100 mL容量瓶（A級(jí)）。

1.1.2 主要試劑

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 mg，純度99.24%，天津阿爾塔公司）；草魚（第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)復(fù)檢樣品）；甲醇、乙腈（色譜純）；水（一級(jí)水）。

1.2 恩諾沙星的測(cè)定方法

稱取2 g（±0.02 g）試樣于50 mL具塞離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，渦旋混合30 s，避光放置

10 min，加入10 g無水硫酸鈉，渦旋混勻，加入20 mL

酸化乙腈，渦旋1 min，超聲10 min，4 000 r·min-1離心收集上清液于50 mL梨形瓶中，重復(fù)提取，將合并的上清液于40 ℃水浴蒸干，用1 mL甲醇復(fù)溶，用

2 mL正己烷脫脂后，取下層清液過0.22 μm膜待測(cè)定[2]。本方法中恩諾沙星殘留量的計(jì)算公式為

式中：X為恩諾沙星的殘留量，μg·kg-1；C為由標(biāo)曲擬合出的樣品溶液濃度，ng·mL-1；V為樣品定容體積，mL；m為樣品稱樣量，g；frec為回收率校正因子。

1.3 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

準(zhǔn)確稱取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 0 g于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，再用移液管精確吸取2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成濃度為2 μg·mL-1的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2 不確定度的主要來源

通過分析，本方法不確定度的主要來源如圖1所示[3-4]。

圖1 不確定度的主要來源

3 不確定度量化

3.1 重復(fù)性引入的不確定度

在2.00 g草魚樣品中，加入0.175 mL濃度為

2 μg·mL-1恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液制成加標(biāo)樣，加標(biāo)量為70 μg·kg-1，復(fù)檢樣品草魚中恩諾沙星的殘留量為183 μg·kg-1，加標(biāo)后恩諾沙星的含量為253 μg·kg-1。加標(biāo)樣6次重復(fù)測(cè)定的結(jié)果分別為

260 μg·kg-1、251 μg·kg-1、256 μg·kg-1、255 μg·kg-1、252 μg·kg-1和258 μg·kg-1，平均值為255 μg·kg-1，平均回收率為103.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.593 4 μg·kg-1，實(shí)驗(yàn)合成重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.2 UPLC-MS/MS定量校準(zhǔn)引入的不確定度

UPLC-MS/MS定量的允差為3.2%，在均勻分布下，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稱量引入的不確定度

使用賽多利斯BSA224S-CW天平，精度0.1 mg，最大允差為±0.1 mg，取均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（sd） mg。

電子天平稱量不確定度主要為稱量變動(dòng)性，根據(jù)電子天平技術(shù)參數(shù)，其變動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為

0.01 g，實(shí)際操作過程中控制在0.02 g，按照均勻分布，則樣品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

u（w） g

因此，由標(biāo)準(zhǔn)品稱量10 mg及樣品稱量2 g引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.4 移液定容體積引入的不確定度

①100 mL容量瓶校準(zhǔn)。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[5]，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為20 ℃時(shí)，100 mL容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.10 mL，服從均勻分布，則不確定度為。②重復(fù)性試驗(yàn)。對(duì)100 mL

容量瓶定容10次并用天平稱量，標(biāo)準(zhǔn)偏差為

0.067 9 mL，其不確定度為0.0679/=0.021 5 mL。③溫度試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為（20±5）℃時(shí)，甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.1×10-3/℃，在均勻分布下，不確定度為。因此，100 mL容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

urel（V1）

①1 mL移液器校準(zhǔn)。根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）規(guī)定[6]，1 mL移液器的容量允差為±1.0%，在均勻分布下，不確定度為1.0%/=0.005 80 mL。②重復(fù)性試驗(yàn)。JJG 646-2006中重復(fù)6次測(cè)定的RSD≤0.5%，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.00×0.5%=0.005 mL，即其不確定度。③溫度試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境溫度為（20±5）℃，其不確定度為。因此，合成得

1 mL移液器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

urel（V2）

在實(shí)驗(yàn)過程中，2次用到了100 mL容量瓶，6次用到了1 mL移液器，因此，由移液定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)引入的不確定度

加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)引入的不確定度包括樣品在提取凈化過程中及由于儀器波動(dòng)、重現(xiàn)性等因素引入的不確定度，本文采用3水平3平行共9次加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為25 μg·kg-1、70 μg·kg-1、

220 μg·kg-1，復(fù)檢樣品草魚中恩諾沙星的殘留量為183 μg·kg-1，加標(biāo)后恩諾沙星的含量分別為208 μg·kg-1、253 μg·kg-1、403 μg·kg-1?；厥章蕿?2.0%～105.0%，平均回收率為99.8%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.017 4 μg·kg-1，因此，加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4 不確定度結(jié)果分析

將上述各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成，得到合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此，當(dāng)復(fù)檢樣品中恩諾沙星含量為183 μg·kg-1時(shí)，合成不確定度為uc=183 ×0.030 1=6 μg·kg-1。當(dāng)包含因子k為2，置信概率p為95%，擴(kuò)展不確定度U=2×6=12 μg·kg-1。

5 結(jié)論

草魚中恩諾沙星的含量為（183±12） μg·kg-1。通過對(duì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總分析，計(jì)算各個(gè)不確定度的貢獻(xiàn)率。由表1可知，在UPLC-MS/MS法測(cè)定草魚中恩諾沙星殘留量時(shí)，移液定容體積引入的不確定度對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響最大，其次是UPLC-MS/MS定量校準(zhǔn)引入的不確定度。因此，在日常檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員應(yīng)注意提高實(shí)驗(yàn)操作能力，同時(shí)定期對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，嚴(yán)格控制前處理過程，減少因移液定容體積引入的不確定度，有助于提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和檢測(cè)結(jié)果可靠性[7-8]。

參考文獻(xiàn)

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