小檗堿衍生物的合成及抗菌活性研究*

葛 蓮, 程 珊, 呂 欽, 萬(wàn)升標(biāo)**

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003;2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237)

耐藥性細(xì)菌嚴(yán)重威脅著全球人民的生命健康,在眾多耐藥菌株中,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus,MRSA)和耐萬(wàn)古霉素腸球菌(Vancomycin-Resistant Enterococci,VRE)危害程度尤為突出[1]。僅在2014年,因MRSA引起的肺部感染奪走了全球150萬(wàn)人的生命,其中大多數(shù)死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[2]。所以,基于新的抗菌藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)出新型抗菌藥物是科學(xué)界亟待解決的問(wèn)題之一。

細(xì)胞分裂溫度敏感體Z(Filamenting temperature-sensitive mutant Z,FtsZ)是近年來(lái)研究的一個(gè)熱門(mén)抗菌靶點(diǎn),具有三磷酸鳥(niǎo)苷(Guanosine triphosphate,GTP)酶活性,與原核細(xì)胞的分裂過(guò)程密切相關(guān)[3]。FtsZ是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的保守結(jié)構(gòu),其一是N端GTP酶區(qū)域,另一個(gè)是C端GTP酶激活區(qū)域。N端GTP酶區(qū)域的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)與C端GTP酶激活區(qū)域的T7環(huán)在連接處結(jié)合形成GTP酶活性位點(diǎn),通過(guò)中心的長(zhǎng)螺旋H7相鏈接形成小分子結(jié)合口袋[4]。FtsZ蛋白幾乎對(duì)所有細(xì)菌的生長(zhǎng)都十分關(guān)鍵并且其形態(tài)上高度保守不易變異,這就為開(kāi)發(fā)FtsZ抑制劑以抵抗多藥耐藥創(chuàng)造了可能[5-6]。當(dāng)FtsZ活性受到抑制時(shí),細(xì)菌無(wú)法完成增殖分裂形成狹長(zhǎng)絲狀或腫大球狀結(jié)構(gòu),進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[7-8]。

已有不少研究者致力于開(kāi)發(fā)FtsZ抑制劑,現(xiàn)有的FtsZ抑制劑大體上可以分為兩類:天然產(chǎn)物類和合成類[9]。小檗堿是從中藥黃連中提取出來(lái)的異喹啉生物堿,能夠以大腸桿菌FtsZ蛋白為靶點(diǎn),破壞FtsZ原絲的穩(wěn)定性,并抑制FtsZ蛋白的GTP酶活性,是天然產(chǎn)物類FtsZ抑制劑(見(jiàn)圖1)。小檗堿在醫(yī)學(xué)界被用作抗菌劑,具有廣譜抗菌活性,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有抑制作用,但抗菌活性不強(qiáng),最低抑菌濃度在64 μg·mL-1以上[10]。3-甲氧基苯甲酰胺是一種合成類的FtsZ抑制劑,雖然抑菌活性不佳(對(duì)枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為4 000 μg·mL-1),但具有優(yōu)異的靶向活性,能靶向枯草芽孢桿菌中的FtsZ蛋白,誘導(dǎo)細(xì)胞絲狀化并最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡,為新型FtsZ抑制劑的開(kāi)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。Haydon等[11]在3-甲氧基苯甲酰胺的基礎(chǔ)上對(duì)甲氧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,最后從500個(gè)3-甲氧基苯甲酰胺衍生物中篩選出了化合物PC190723,經(jīng)過(guò)抗菌活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)其最小抑菌濃度為0.5～1 μg·mL-1,抗菌效果要比3-甲氧基苯甲酰胺高出數(shù)千倍。之后又將PC190723的噻唑并吡啶改成苯并噻唑,發(fā)現(xiàn)MIC值由1.0 μg·mL-1降為0.25 μg·mL-1,抗菌活性有所提高[12]?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)對(duì)小檗堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,將苯并噻唑類活性片段與小檗堿雜合,以期望提高小檗堿的抗菌活性(見(jiàn)圖2)。

圖1 部分FtsZ 抑制劑及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 小檗堿衍生物的設(shè)計(jì)

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

JEOLJNM-EPC 400 NMR核磁共振儀( 捷歐路科貿(mào)有限公司);Agilent DD2 500 MHz 核磁共振儀(安捷倫科技有限公司);Q-TOF Ultima GLOBAL 質(zhì)譜儀(英國(guó)Micromass公司);Merck 25 TLC 硅膠板(硅膠 60 GF254,0.25 mm,德國(guó) Merck 公司);柱層析硅膠(200～300 目,青島美高集團(tuán)有限公司)。

1.2 化學(xué)試劑

鹽酸小檗堿水合物(批號(hào) E2211028,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),2-氨基-4-氯-苯硫酚(批號(hào) G2108067,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),2-氨基苯硫酚(批號(hào) L2103389,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),碘化鈉(批號(hào) L2116064,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),六亞甲基四胺(批號(hào) X210628A,上海麥克林生化科技有限公司)。反應(yīng)溶劑均為煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司分析純?cè)噭?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC 6538)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA ATCC 43300)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosaATCC 10145)和大腸桿菌(E.coliATCC 11775)四種菌株均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

2 化合物的合成

2.1 9-(5-氯苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿(5a)和9-(苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿(5b)的合成

2.1.1 小檗紅堿(2) 將小檗堿鹽酸水合物1(5 000 mg, 13.47 mmol)于190 ℃下加熱攪拌1 h,得到紫紅色固體粗產(chǎn)物,產(chǎn)率90%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.86 (s, 1H), 7.96 (d,J=10.7 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.59 (s, 2H), 7.04 (s, 1H), 6.14 (s, 2H), 4.68 (t, 2H), 4.02 (s, 3H), 3.08 (t, 2H)。

2.1.2 5-氯-2-(氯甲基)苯并噻唑(4a)和2-(氯甲基)苯并噻唑(4b) 將2-氨基-4-氯苯硫酚(3 200 mg, 20 mmol)或2-氨基苯硫酚(2 500 mg, 20 mmol)溶解于甲苯(50 mL)中,再向反應(yīng)體系中逐滴加入氯乙酰氯(4 520 mg, 40 mmol)和三乙胺(2 020 mg, 20 mmol),于室溫下反應(yīng)20 min,之后加熱到105 ℃反應(yīng)3 h。用薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全,用飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng),鹽水洗滌,乙酸乙酯萃取三次。將三次萃取得到的有機(jī)相收集起來(lái)并用無(wú)水硫酸鈉干燥,之后將溶劑旋干。用石油醚/乙酸乙酯(v/v=20∶1)進(jìn)行柱層析得到白色固體,產(chǎn)率56%。(4a) MS(ESI):m/z[M+H]+218.10; (4b) MS(ESI):m/z[M+H]+184.65。

2.1.3 9-(5-氯苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿(5a)和9-(苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿(5b) 將小檗紅堿2(322 mg, 1 mmol)和化合物4a(1 085 mg, 5 mmol)或者化合物4b(915 mg, 5 mmol)溶解于乙腈(15 mL)中,再向反應(yīng)體系中加入碘化鈉(750 mg, 5 mmol)和碳酸鉀(690 mg, 5 mmol),加熱回流反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后,過(guò)濾除去固體殘?jiān)?再將濾液旋干。用二氯甲烷/甲醇(v/v=100∶1)進(jìn)行柱層析得到黃色固體,產(chǎn)率30%。(5a)1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.97 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.25 (dd,J=11.5, 8.9 Hz, 2H), 8.15 (d,J=2.1 Hz, 1H), 8.08 (d,J=9.1 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.57 (dd,J=8.6, 2.1 Hz, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.19 (s, 2H), 5.78 (s, 2H), 4.94 (t,J=6.3 Hz, 2H), 4.08 (s, 3H), 3.22 (t,J=6.3 Hz, 2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 171.74, 149.85, 146.05, 128.52, 127.93, 127.87, 125.71, 124.81, 122.97, 122.62, 110.98, 108.53, 105.61, 100.90, 71.62, 59.63, 55.94, 54.21, 51.48, 36.47, 29.81, 29.63; MS(ESI):m/z[M+H]+504.09. (5b)1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.96 (s, 1H), 8.97 (s, 1H), 8.26 (d,J=9.2 Hz, 1H), 8.22～8.16 (m, 1H), 8.10～8.03 (m, 2H), 7.80 (s, 1H), 7.62～7.44 (m, 2H), 7.10 (s, 1H), 6.18 (s, 2H), 5.80 (s, 2H), 4.94 (t,J=6.3 Hz, 2H), 4.09 (s, 3H), 3.21 (t,J=6.3 Hz, 2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 169.51, 153.02, 149.93, 146.24, 146.03, 143.38, 135.24, 130.79, 128.59, 127.90, 126.17, 125.19, 124.72, 123.15, 121.90, 111.01, 108.53, 105.62, 100.89, 71.73, 59.63, 55.97, 54.23, 51.46, 36.48, 29.81, 29.64; MS(ESI):m/z[M+H]+470.13。

2.2 9-(5-氯苯并噻唑-2-甲氧基) 四氫小檗堿(6a)和9-(苯并噻唑-2-甲氧基) 四氫小檗堿(6b)的合成

將9-(5-氯苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿5a(503 mg, 1 mmol)或9-(苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿5b(469 mg, 1 mmol)溶解于甲醇(10 mL)中,再向反應(yīng)體系中加入硼氫化鈉(540 mg, 10 mmol)于室溫下反應(yīng)2 h。用薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全,將反應(yīng)液過(guò)濾并將濾液旋干。用石油醚/乙酸乙酯(v/v=10∶1)進(jìn)行柱層析得到淡黃色固體,產(chǎn)率76%。(6a)1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.99 (t,J=1.6 Hz, 1H), 7.84 (dd,J=8.5, 1.2 Hz, 1H), 7.38 (dt,J=8.6, 1.6 Hz, 1H), 6.92 (d,J=8.4 Hz, 1H), 6.82 (d,J=8.4 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.58 (s, 1H), 5.91 (s, 2H), 5.51～5.38 (m, 2H), 4.32 (d,J=15.8 Hz,1H),3.85 (s, 3H),3.63～3.48 (m, 2H),3.28～2.76 (m, 4H), 2.69～2.55 (m, 2H);13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 171.74, 149.85, 146.05, 128.52, 127.93, 127.87, 125.71, 124.81, 122.97, 122.62, 110.98, 108.53, 105.61, 100.90, 71.62, 59.63, 55.94, 54.21, 51.48, 36.47, 29.81, 29.63; MS(ESI):m/z[M+H]+507.11。 (6b)1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.02 (dt,J=8.2, 1.0 Hz, 1H), 7.93 (dt,J=7.9, 0.9 Hz, 1H), 7.49 (ddd,J=8.3, 7.2, 1.3 Hz, 1H), 7.40 (ddd,J=8.3, 7.2, 1.2 Hz, 1H), 6.92 (d,J=8.3 Hz, 1H), 6.82 (d,J=8.4 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.58 (s, 1H), 5.91 (s, 2H), 5.54～5.40 (m, 2H), 4.34 (d,J=15.8 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.64～3.49 (m, 2H), 3.29～3.03 (m, 3H), 2.82 (dd,J=15.9, 11.3 Hz, 1H), 2.69～2.53 (m, 2H);13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 169.51, 153.02, 149.93, 146.24, 146.03, 143.38, 135.24, 130.79, 128.59, 127.90, 126.17, 125.19, 124.72, 123.15, 121.90, 111.01, 108.53, 105.62, 100.89, 71.73, 59.63, 55.97, 54.23, 51.46, 36.48, 29.81, 29.64; MS(ESI):m/z[M+H]+473.15。

2.3 12-(5-氯苯并噻唑) 四氫小檗紅堿(9a)和12-(苯并噻唑) 四氫小檗紅堿(9b)的合成

2.3.1 四氫小檗紅堿(7) 將小檗紅堿2(966 mg, 3 mmol)溶解于甲醇(20 mL)中,再向反應(yīng)體系中加入硼氫化鈉(1 620 mg, 30 mmol)于室溫下反應(yīng)2 h。用薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全,將反應(yīng)液過(guò)濾并將濾液旋干。用石油醚/乙酸乙酯(v/v=10∶1)進(jìn)行柱層析得到淡粉色固體,產(chǎn)率80%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 6.74 (t,J=4.2 Hz, 2H), 6.67 (d,J=8.3 Hz, 1H), 6.59 (s, 1H), 5.92 (s, 2H), 4.23 (d,J=15.6 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.61～3.47 (m, 2H), 3.29～3.06 (m, 3H), 2.82 (dd,J=15.9, 11.3 Hz, 1H), 2.72～2.56 (m, 2H)。

2.3.2 12-(甲?；?四氫小檗紅堿(8) 將四氫小檗紅堿7(650 mg, 2 mmol)溶解于三氟乙酸(20 mL)中,向反應(yīng)體系中加入六亞甲基四胺(336 mg, 2.4 mmol)于120 ℃下反應(yīng)5 h之后,再向其中逐滴加入10%硫酸水溶液(13 mL),并將溫度降至90～100 ℃繼續(xù)反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。用大量飽和碳酸氫鈉溶液洗滌,再用乙酸乙酯萃取3次。將萃取得到的有機(jī)相收集起來(lái)并用無(wú)水硫酸鎂干燥,之后過(guò)濾并將濾液旋干。用二氯甲烷/甲醇(v/v=100∶1)進(jìn)行柱層析得到紅棕色固體,產(chǎn)率21%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.82 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 6.18 (s, 2H), 4.23 (d,J=15.6 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.61～3.47 (m, 2H), 3.29～3.06 (m, 3H),2.82 (dd,J=15.9,11.3 Hz, 1H), 2.72～2.56 (m, 2H)。

2.3.3 12-(5-氯苯并噻唑) 四氫小檗紅堿(9a)和12-(苯并噻唑) 四氫小檗紅堿(9b) 將12-(甲?；?四氫小檗紅堿8(353 mg, 1 mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10 mL)中,向反應(yīng)體系中加入2-氨基-4-氯苯硫酚(800 mg, 5 mmol)或者2-氨基苯硫酚(625 mg, 5 mmol),之后再向其中加入水(2 mL)于80 ℃下反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后將溶劑旋干,用二氯甲烷/甲醇(v/v=100∶1)進(jìn)行柱層析得到紅棕色固體,產(chǎn)率10%。(9a)1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.72 (s, 1H), 9.25 (s, 1H), 8.02 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.91 (d,J=2.0 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.39～7.33 (m, 2H), 6.18 (s, 2H), 5.22 (d,J=5.6 Hz, 1H), 4.55 (t,J=6.8 Hz, 4H), 3.81 (s, 3H), 3.18 (d,J=6.3 Hz, 4H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 171.92, 146.32, 125.71, 121.92, 116.03, 102.32, 56.06, 54.53; MS(ESI):m/z[M+H]+493.09。(9b)1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.71 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 7.96 (dd,J=8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.83 (dt,J=8.1, 0.9 Hz, 1H), 7.47～7.39 (m,2H),7.31～7.24 (m,2H),6.12(s, 2H), 5.23～5.13 (m, 1H), 4.57～4.42 (m, 4H), 3.77 (s, 3H), 3.39～3.45 (m, 2H), 3.12 (t,J=6.1 Hz, 2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167.92, 147.32, 126.77, 121.92, 121.13, 116.03, 102.32, 56.06, 54.53; MS(ESI):m/z[M+H]+459.13。

2.4 13-(5-氯苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿(11a)和13-(苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿(11b)的合成

2.4.1 8-乙酰甲基二氫小檗堿(10) 將小檗堿鹽酸水合物1(500 mg, 1.4 mmol)溶解于丙酮(10 mL)中,向反應(yīng)體系中滴加2.3 mL氫氧化鈉溶液(5 mol·L-1)于室溫下反應(yīng)1 h。反應(yīng)完全后,將反應(yīng)液進(jìn)行抽濾,并用80%的甲醇水溶液洗滌濾渣2～3次,即得淡黃色固體粗產(chǎn)物,產(chǎn)率85%。MS(ESI):m/z[M+H]+394.16。

2.4.2 13-(5-氯苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿(11a)和13-(苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿(11b) 將8-乙酰甲基二氫小檗堿10(393 mg, 1 mmol)和化合物4a(1 085 mg, 5 mmol)或者化合物4b(915 mg, 5 mmol)溶解于乙腈(10 mL)中,再向反應(yīng)體系中加入碘化鈉(750 mg, 5 mmol)和碳酸鉀(690 mg, 5 mmol),加熱回流反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后,過(guò)濾除去固體殘?jiān)?再將濾液旋干。用二氯甲烷/甲醇(v/v=50∶1)進(jìn)行柱層析得到黃色固體,產(chǎn)率35%。(11a)1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.01 (s, 1H), 8.18 (dd,J=8.7, 0.5 Hz, 1H), 8.09 (d,J=9.5 Hz, 1H), 7.93～7.87 (m, 2H), 7.49 (dd,J=8.7, 2.1 Hz, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.05 (s, 2H), 5.21 (s, 2H), 4.86 (s, 2H), 4.08 (s, 3H), 3.98 (s, 3H), 3.12 (t,J=5.1 Hz, 2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 172.76, 150.92, 150.03, 147.23, 137.55, 134.79, 134.38, 131.84, 126.92, 126.27, 124.54, 122.55, 122.06, 121.60, 120.31, 109.14, 108.69, 102.67, 62.63, 57.45, 49.13, 27.74; MS(ESI):m/z[M+H]+518.10。 (11b)1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.02 (s, 1H), 8.15 (dt,J=5.3, 3.8 Hz, 1H), 8.09 (d,J=9.4 Hz, 1H), 7.92 (d,J=9.4 Hz, 1H), 7.85～7.77 (m, 1H), 7.45 (dt,J=6.2, 3.6 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.05 (s, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.88 (s, 2H), 4.09 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 3.13 (t,J=6.0 Hz, 2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170.12, 152.92, 150.90, 150.00, 147.20, 146.62, 144.77, 137.50, 135.56, 134.75, 133.01, 128.96, 126.98, 126.88, 126.13, 123.06, 123.00, 122.08, 121.63, 120.38, 109.12, 108.68, 102.65, 62.63, 57.43, 35.83, 27.75; MS(ESI):m/z[M+H]+484.14。

2.5 13-(5-氯苯并噻唑-2-甲氧基)四氫小檗堿(12a)和13-(苯并噻唑-2-甲氧基) 四氫小檗堿(12b)的合成

將13-(5-氯苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿11a(517 mg, 1 mmol)或13-(苯并噻唑-2-甲氧基) 小檗堿11b(483 mg, 1 mmol)溶解于甲醇(10 mL)中,再向反應(yīng)體系中加入硼氫化鈉(540 mg, 10 mmol)于室溫下反應(yīng)2 h。用薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全,將反應(yīng)液過(guò)濾并將濾液旋干。用石油醚/乙酸乙酯(v/v=10∶1)進(jìn)行柱層析得到淡黃色固體,產(chǎn)率50%。(12a)1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.93 (d,J=2.1 Hz, 1H), 7.63 (d,J=8.5 Hz, 1H), 7.27 (dd,J=8.5, 2.0 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.61～6.54 (m, 2H), 6.52 (s, 1H), 5.83 (d,J=1.5 Hz, 1H), 5.64 (d,J=1.5 Hz, 1H), 4.23 (d,J=16.1 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.84～3.80 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.55 (d,J=16.0 Hz,1H),3.23～3.01 (m,4H),2.68～2.53 (m, 2H);13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 174.03, 154.31, 150.76, 146.38, 146.09, 144.96, 133.85, 131.63, 131.40, 129.84, 128.67, 128.38, 124.85, 124.49, 122.42, 122.02, 110.42, 108.35, 106.18, 100.85, 63.26, 60.18, 55.76, 54.39, 51.15, 44.97, 37.51, 30.27; MS(ESI):m/z[M+H]+521.13. (12b)1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.95 (dt,J=8.0, 0.9 Hz, 1H), 7.80～7.66 (m, 1H), 7.41 (ddd,J=8.3, 7.2, 1.3 Hz, 1H), 7.29 (ddd,J=8.2, 7.2, 1.2 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.58 (d,J=1.5 Hz, 2H), 6.53 (s, 1H), 5.81 (d,J=1.5 Hz, 1H), 5.58 (d,J=1.5 Hz, 1H), 4.24 (d,J=16.0 Hz, 1H), 3.87 (dd,J=6.4, 2.8 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.82 (d,J=2.9 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.56 (d,J=16.0 Hz, 1H), 3.24～3.04 (m, 4H), 2.66～2.53 (m, 2H);13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 171.98, 153.46, 150.70, 146.38, 146.06, 144.93, 135.59, 131.58, 129.83, 128.63, 128.46, 125.65, 124.62, 124.40, 122.54, 121.34, 110.42, 108.33, 106.24, 100.79, 63.34, 60.18, 55.76, 54.44, 51.20, 45.04, 37.41, 29.91; MS(ESI):m/z[M+H]+487.16。

3 體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)

使用液體稀釋法測(cè)定小檗堿及其衍生物的最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC),具體操作如下:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,用液體培養(yǎng)基等倍稀釋小檗堿及其衍生物的藥液(濃度為32、16、8和4 μg·mL-1),每孔加100 μL稀釋藥液和10 μL供試菌液,于37 ℃培養(yǎng)24 h后用MTT法檢測(cè)在600 nm下各孔的吸光度值。同步設(shè)定培養(yǎng)基對(duì)照孔、藥液對(duì)照孔、菌液對(duì)照孔,在培養(yǎng)基對(duì)照孔無(wú)菌生長(zhǎng)和菌液對(duì)照孔有菌生長(zhǎng)的情況下,分析判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以O(shè)D值突然升高前的臨界值為藥物最低抑菌濃度。

4 分子對(duì)接

以FtsZ蛋白(PDB: 4DXD)為模板,采用Ledock軟件分析化合物與FtsZ蛋白的結(jié)合模式,使用ChemBio3D Ultra 14.0軟件處理小檗堿及其衍生物的3D結(jié)構(gòu),使其MM2能量最小化。采用LePro處理FtsZ蛋白結(jié)構(gòu)使其適用于分子對(duì)接。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)可能性最大的結(jié)合位點(diǎn),使用LeDock軟件將化合物與FtsZ蛋白進(jìn)行柔性對(duì)接,打分最高的結(jié)合構(gòu)象以PyMOL軟件和薛定諤軟件處理后展示。

5 討論

依據(jù)上述研究方向共合成出10個(gè)小檗堿衍生物,大體上可分為3條路線(見(jiàn)圖3)。目標(biāo)化合物5a、5b、6a、6b的合成方法可歸納為一條路線:首先將小檗堿(1)在真空高溫條件下脫去9位的甲基生成小檗紅堿(2)[13-14]?；衔?與氯乙酰氯成環(huán)得到化合物4,4再與小檗紅堿(2)發(fā)生親核取代反應(yīng)即得目標(biāo)化合物5[15-16]。將化合物5用硼氫化鈉進(jìn)行還原,即得目標(biāo)化合物6[17-19]。目標(biāo)產(chǎn)物9a和9b的合成:首先也是將小檗堿(1)在真空高溫條件下轉(zhuǎn)化成小檗紅堿(2),再利用硼氫化鈉對(duì)其還原得到四氫小檗紅堿(7)。之后將化合物7與六亞甲基四胺進(jìn)行一步甲?；磻?yīng)生成12-(甲酰基)四氫小檗紅堿(8)[20-21],化合物8再與2-氨基-4-氯苯硫酚或2-氨基苯硫酚反應(yīng)即可得到目標(biāo)化合物9a或9b[22]。目標(biāo)化合物11a、11b、12a、12b的合成:將小檗堿與丙酮反應(yīng)生成中間體10,再將其與化合物4a或4b反應(yīng)即可得到目標(biāo)化合物11a或11b[23]。將化合物11用硼氫化鈉進(jìn)行還原,即得目標(biāo)化合物12。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這3條路線都是切實(shí)可行的,優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,原料易得;缺點(diǎn)是產(chǎn)率較低。尤其是目標(biāo)化合物9的產(chǎn)率只有10%,后期還需要進(jìn)一步優(yōu)化合成方法。

(反應(yīng)試劑和條件:(i)190 ℃,真空,1 h;(ii)氯乙酰氯,三乙胺,甲苯;(iii)碘化鈉,碳酸鉀,乙腈,加熱回流;(iv)硼氫化鈉,甲醇,室溫,21 h;(v)硼氫化鈉,甲醇,室溫,21 h;(vi)Ι.六亞甲基四胺/三氟醋酸,120 ℃;Ⅱ.百分之十的硫酸水溶液,90～100 ℃;(vii)3a/3b,N, N-二甲基甲酰胺/水,80 ℃;(viii)氫氧化鈉水溶液(5 mol·L-1),丙酮,室溫,11 h;(ix)4a/4b,碘化鈉,碳酸鉀,乙腈,加熱回流;(x)硼氫化鈉,甲醇,室溫,21 h。Reagents and conditions: (i) 190 ℃, in vacuo, 1 h; (ii) ClCOCH2Cl, Et3N, toluene; (iii) NaI, K2CO3, CH3CN, reflux; (iv) NaBH4, MeOH, r.t., 2 h; (v) NaBH4, MeOH, r.t., 2 h; (vi) Ι. HMTA/TFA, 120 ℃; Ⅱ. 10% H2SO4, 90～100 ℃; (vii) 3a/3b, DMF/H2O, 80 ℃; (viii) 5 N NaOH, acetone, r.t., 1 h; (ix) 4a/4b, NaI, K2CO3, CH3CN, reflux; (x) NaBH4, MeOH, r.t., 2 h.)

對(duì)合成出的10個(gè)小檗堿衍生物進(jìn)行體外抗菌活性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明化合物5a、5b、9a、11a、11b對(duì)兩種革蘭氏陽(yáng)性菌(S.aureusATCC 6358和MRSA ATCC 43300)的抗菌效果均優(yōu)于小檗堿(見(jiàn)表1),其中化合物11a抑菌效果最佳(抗菌活性相較于小檗堿提高了16倍),可能是因?yàn)樾￠迚A13-位引入5-氯苯并噻唑片段后更有利于其和FtsZ蛋白相結(jié)合。為了進(jìn)一步探究化合物11a抗菌活性提高的原因,用Ledock軟件對(duì)其進(jìn)行分子對(duì)接(見(jiàn)圖4A、4B),對(duì)接結(jié)果表明小檗堿衍生物結(jié)合于FtsZ蛋白N端GTP酶區(qū)域的疏水口袋中。相較于小檗堿而言,化合物11a不僅能與Thr133、Asn166氨基酸殘基形成氫鍵相互作用,而且其分子構(gòu)型更適合FtsZ蛋白N端結(jié)合域的疏水空腔,這可能是其抗菌活性提高的原因。

表1 小檗堿衍生物體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)(最小抑菌濃度:微克/毫升)

圖4 分子對(duì)接(PDB: 4DXD)

6 結(jié)語(yǔ)

本文旨在將FtsZ抑制劑PC190723衍生物的苯并噻唑類活性片段與小檗堿相結(jié)合以提高小檗堿的抗菌活性。依據(jù)此研究方向共合成出9-位、12-位、13-位不同位置取代的10個(gè)小檗堿衍生物并對(duì)其進(jìn)行了體外抗菌活性測(cè)試?？咕钚詳?shù)據(jù)顯示化合物5a、5b、9a、11a、11b對(duì)兩種革蘭氏陽(yáng)性菌(S.aureusATCC 6358和MRSA ATCC 43300)的抗菌效果均優(yōu)于小檗堿(抗菌活性分別提高了8、8、8、16和4倍),初步說(shuō)明小檗堿衍生物具有成為靶向FtsZ抗多藥耐藥的新型抗菌藥物的潛力。