低聚半乳糖植物乳桿菌發(fā)酵乳的代謝組學(xué)分析及其腸道菌群調(diào)節(jié)活性研究

戶行宇，賴田甜，劉同吉，薛瑞，陳雅璐，楊貞耐

（北京工商大學(xué)北京老年?duì)I養(yǎng)與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

0 引 言

低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharide，GOS）是一類通過(guò)β-半乳糖苷酶的水解和轉(zhuǎn)半乳糖基活性，將水解乳糖得到的多個(gè)半乳糖單元以β-（1-4）、β-（1-6）或β-（1-3）等糖苷鍵連接在半乳糖或葡萄糖單元，得到聚合度(DP)在2～8 之間的寡糖混合物[1-2]。GOS 通常被稱為“雙歧桿菌生長(zhǎng)因子”，其不但可以促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌的增殖，還可以抑制大腸桿菌、致病性梭狀芽胞桿菌等有害菌的繁殖，起到平衡腸道菌群的作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，食用GOS 會(huì)在結(jié)腸中產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)，包括丙酸、乙酸和丁酸等酸性物質(zhì)。這些代謝物，尤其是丁酸，在結(jié)直腸癌的治療中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用[5]。

傳統(tǒng)發(fā)酵乳一般由嗜熱鏈球菌（Thermophilus）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus）或雙歧桿菌（Bifidobacterium）發(fā)酵生成，相比于鮮牛乳因其含有大量的益生菌，可以改善腸道健康，備受消費(fèi)者青睞[6]，植物乳桿菌能夠產(chǎn)生乳酸菌素、過(guò)氧化氫、雙乙酰等多種天然活性物質(zhì)，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡的作用[7]。但是，目前關(guān)于GOS 對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵牛乳的代謝產(chǎn)物的影響以及GOS 發(fā)酵乳調(diào)節(jié)腸道菌群活性研究較少[8]。因此，本文利用課題組前期制備的GOS 以及分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)奶酪的植物乳桿菌NMGL2 制備GOS 發(fā)酵乳[9-10]，采用代謝組學(xué)方法分析該發(fā)酵乳的差異代謝物，并采用體外人體糞便共培養(yǎng)模型，探究GOS 植物乳桿菌發(fā)酵乳的腸道菌群調(diào)節(jié)活性，為進(jìn)一步了解GOS 對(duì)發(fā)酵乳功能性的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

鮮牛乳，北京三元股份有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NMGL2（保藏編號(hào)為CGMCC No. 18495），-80 ℃甘油管保存；低聚半乳糖（GOS，90.17%），實(shí)驗(yàn)室制備；MRS 培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；甲醇、L-2-氯苯丙氨酸、乙腈、異丙醇、甲酸、丙醇，賽默飛公司；氯化鈉、酵母提取物、蛋白胨、膽鹽、磷酸緩沖液（PBS），索萊寶生物科技有限公司；血紅素、維生素K1、牛膽鹽、半胱氨酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UHPLC -Q Exactive HF-X 超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜，賽默飛公司；HSS T3 色譜柱，Waters 公司；JXDC-20 氮?dú)獯祾邇x，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；LNG-T88 臺(tái)式快速離心濃縮干燥器，太倉(cāng)市華美生化儀器廠；Wonbio-96c 高通量組織破碎儀，上海萬(wàn)柏生物科技有限公司；SBL-10TD 超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；厭氧培養(yǎng)盒，三菱化學(xué)公司；HZQ-Q 數(shù)顯pH 計(jì)，哈爾濱市東聯(lián)電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GOS 植物乳桿菌發(fā)酵乳的制備

將-80 ℃甘油管保存的植物乳桿菌NMGL2 以3%（V/V）的接菌量接種至冷卻后的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h；活化2 代后，獲得菌懸液(菌懸液的菌濃度為1010CFU/mL)。向鮮牛乳中分別添加0、2%、4%、6%（m/V）的GOS，90 ℃下巴氏消毒殺菌10 min，然后冷卻至37 ℃，將活化好的菌懸液接種至巴氏殺菌奶中，37 ℃靜置發(fā)酵24 h。發(fā)酵后的樣品于-80 ℃冷凍保存。

1.3.2 GOS 植物乳桿菌發(fā)酵乳非靶向代謝組學(xué)分析

將-80 ℃保存的4 組不同GOS 添加量的樣品取出，室溫解凍，分別命名為GOS_0、GOS_2、GOS_4、GOS_6。取100 μL 發(fā)酵乳樣品加入400 μL 提取液（V甲醇∶V水=4∶1）含0.02 g/L 的內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸）進(jìn)行代謝產(chǎn)物提取。冷凍組織研磨儀研磨，然后低溫超聲提取。將樣品靜置于-20 ℃，離心30 min 后取上清液，采用超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜UHPL-Q Exactive HF-X 系統(tǒng)進(jìn)行LC-MS 上機(jī)分析[11]。

色譜條件：HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm,1.8 μm），柱溫設(shè)為40 ℃。流動(dòng)相A 組成：95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B 組成：47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸）。分離梯度：流動(dòng)相B 從0 逐步升至100%，流速?gòu)?.4 mL/min 升至0.6 mL/min；再逐步將流動(dòng)相B 從100% 降至0，流速調(diào)整為0.4 mL/min。質(zhì)譜條件：選用正負(fù)離子的掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z：70～1 050。正離子電壓選用3 500 V，負(fù)離子電壓選用2 800 V，MS1 分辨率70 000，MS2 分辨率17 500[12]。

質(zhì)控樣本（Quality control，QC）是通過(guò)將所有樣品的等體積混合制成混合樣品。在整個(gè)分析過(guò)程中，間隔插入，以提供一組可評(píng)估重復(fù)性的數(shù)據(jù)[11]。完成上機(jī)之后，對(duì)LC-MS 原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。將MS 和MSMS的質(zhì)譜信息與代謝公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB 和Metlin 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配整理，從而得到代謝物的相關(guān)信息[12]。將整理后的數(shù)據(jù)上傳至美吉生物云平臺(tái)（https://cloud.majorbio.com）進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析。采用人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB)進(jìn)行代謝物分類，通過(guò)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路的注釋，從而篩選得到差異代謝物所參與的通路[14]。

1.3.3 GOS 植物乳桿菌發(fā)酵乳對(duì)腸道菌群的影響

（1）發(fā)酵乳體外模型消化處理。參照郝曉娜等[8]的方法稍作修改。將10 mL 發(fā)酵乳與10 mL 的NaCl（35 mmol/L）水溶液混合制成發(fā)酵乳溶液，模擬胃液環(huán)境水解1 h，然后模擬腸道環(huán)境消化1 h，最終得到體外模擬消化后的樣品。

（2）BCM 培養(yǎng)基的配制。參照郝曉娜等[8]的方法稍作修改。依次稱取酵母提取物、蛋白胨、膽鹽等培養(yǎng)基組成成分，用蒸餾水定容至2 L，用蒸餾水定容至2 L，用1 mol/L 乙酸調(diào)pH 至7.0，滅菌（121 ℃，15 min）后取出備用。

糞便共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天需要收集健康成人（2 男1女，年齡20～28 歲，BMI 值均在20.0～23.5 之間）的糞便，志愿者無(wú)飲酒和吃藥的情況，近期內(nèi)未服用過(guò)抗生素等藥類，且未患有慢性腸道類疾病。將中段糞便與PBS 緩沖液震蕩混勻，在厭氧培養(yǎng)箱中，利用PBS緩沖溶液將糞懸液濃度配制成20%（m/V），過(guò)濾收集濾液，2 h 內(nèi)完成糞懸液的處理。將體外模擬消化后的樣品與糞懸液以1∶2 的比例混合，加入BCM 培養(yǎng)基，將其置于厭氧工作站中培養(yǎng)，培養(yǎng)4、12 h 取樣，最終的樣品分組如表1 所示。將培養(yǎng)液于10 000g、4 ℃下離心20 min，從而去除上清液，獲得沉淀的菌體，利用16S rRNA 測(cè)定菌群組成的多樣性。將測(cè)序篩選獲得的有效序列進(jìn)行OUT 的劃分聚類，對(duì)糞便樣本中菌群組成的多樣性及樣本之間的差異進(jìn)行分析。

表1 實(shí)驗(yàn)分組

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品平行測(cè)試3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Excel、IBM SPSS Statistics 25 和origin 8.5 軟件進(jìn)行處理。P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝組學(xué)結(jié)果分析

2.1.1 代謝產(chǎn)物的主成分分析

PCA 分析（Principal Component Analysis），即主成分分析，是一種對(duì)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維簡(jiǎn)化分析的技術(shù)，得分圖中各點(diǎn)相距越近說(shuō)明樣本之間越相似，2樣本相距越遠(yuǎn)說(shuō)明樣本之間差異性越高[13]。本研究利用LC-MS 對(duì)GOS 不同添加量的益生性發(fā)酵乳中的代謝產(chǎn)物組成進(jìn)行分析。由圖1 可知，在正負(fù)離子掃描模式下全部QC 樣品聚集成一簇，且與受試樣品的區(qū)分明顯，說(shuō)明該數(shù)據(jù)采集過(guò)程中儀器穩(wěn)定性非常好，所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。在陽(yáng)離子、陰離子模式下，第1、2 主成分的累計(jì)解釋量分別為78.5%、83.8%。且不同樣品組間區(qū)分較明顯，距離較大，說(shuō)明隨著GOS 添加量的增加，發(fā)酵乳體系內(nèi)代謝物組成具有明顯的差異性[14]。

圖1 發(fā)酵乳代謝產(chǎn)物PCA 分析

2.1.2 代謝產(chǎn)物的OPLS-DA 分析

OPLS-DA 是一種在PCA 的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步計(jì)算分析的方法，該方法能夠盡可能地去除未控制變量對(duì)數(shù)據(jù)的影響，更好對(duì)組間差異進(jìn)行區(qū)分[15]。圖2、圖3、圖4 分別為GOS_0 與GOS_2、GOS_0 與GOS_4、GOS_0 與GOS_6 代謝產(chǎn)物的OPLS-DA 分析圖。由圖可知，添加GOS（2%、4%、6%）的益生性發(fā)酵乳與未添加GOS 的發(fā)酵乳在OPLS-DA 圖上的距離較大，都能夠?qū)崿F(xiàn)組間的完全區(qū)分，同時(shí)在陽(yáng)離子、陰離子模式下第一、二主成分的解釋度較高，說(shuō)明添加GOS的益生性發(fā)酵乳與未添加GOS 的發(fā)酵的代謝產(chǎn)物存在著明顯的差異。添加GOS 的益生性發(fā)酵乳與未添加GOS 的發(fā)酵乳OPLS-DA 判別分析的參數(shù)結(jié)果如表2 所示，R2X、R2Y和Q2分別表示模型的解釋率和預(yù)測(cè)率，數(shù)值越是接近于1，表示該模型越為理想，對(duì)樣本的解釋率和預(yù)測(cè)率越好[16]。由表2 可知GOS_0 與GOS_2、GOS_0 與GOS_4、GOS_0 與GOS_6 這3 個(gè)模型的解釋率和預(yù)測(cè)率均在0.8 以上，進(jìn)一步證實(shí)3種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膮^(qū)分程度較好。

圖3 GOS_0 與GOS_4 代謝產(chǎn)物的OPLS-DA 分析

圖4 GOS_0 與GOS_6 代謝產(chǎn)物的OPLS-DA 分析

表2 OPLS-DA 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.1.3 發(fā)酵乳的差異代謝物篩選

代謝組學(xué)是對(duì)生物樣本中存在的小分子的綜合研究，是一種更好地理解宿主-微生物相互作用的新方法，也是對(duì)樣本潛在益生性的一種探究[17]。為了明確不同GOS 添加量的益生性發(fā)酵乳之間的代謝物差異，以P<0.05、VIP值>1 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將GOS 添加量為2%、4%、6%的益生性發(fā)酵乳分別與未添加GOS（0%）的發(fā)酵乳進(jìn)行兩兩分組比較，并分析各差異組之間代謝物數(shù)目的異同。圖5 反映了GOS_0 與GOS_2、GOS_0 與GOS_4、GOS_0 與GOS_6 差異代謝產(chǎn)物的數(shù)目。從圖5 中可以看到，GOS_2 與GOS_0有139 種差異代謝物，GOS_4 與GOS_0 有147 種差異代謝物，GOS_6 與GOS_0 有149 種差異代謝物。

圖5 差異代謝物數(shù)目

結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些差異物質(zhì)中的功能性代謝產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步篩選，結(jié)果如表3 所示，篩選出24種功能性代謝產(chǎn)物影響代謝過(guò)程。圖6 為KEGG 化合物的分類，由圖6 可知，篩選出來(lái)的功能性差異代謝產(chǎn)物主要包括氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸及碳水化合物。其中，氨基酸是生命體的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命體正常生長(zhǎng)代謝至關(guān)重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也能增加機(jī)體抵抗力[18]，若攝入其不足會(huì)導(dǎo)致低血糖[19]。氨基酸不僅可以縮短發(fā)酵時(shí)間，其作為風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)，能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成醛類、酯類和醇類等物質(zhì)，從而影響發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味[13]。有機(jī)酸除了調(diào)味以外，還具備殺菌和抑菌等作用，可以調(diào)節(jié)宿主免疫功能[19]。核苷酸幾乎參與了生物體內(nèi)的所有反應(yīng)過(guò)程，可以為生物體核酸合成提供材料，并且在能量代謝上具有重要功能，缺乏核苷酸會(huì)損害腸道、肝臟和免疫系統(tǒng)[20]。碳水化合物是生命體的重要供能物質(zhì)，可以起到調(diào)節(jié)生命體日?；顒?dòng)的作用。其中異檸檬酸鹽、烏頭酸、肌醇、2-脫氧-D-核糖、β-羥基丁酸等含量顯著增加，1-磷酸葡萄糖、尿酸含量降低。

圖6 KEGG 化合物分類

2.1.4 代謝通路分析

GOS 植物乳桿菌發(fā)酵乳的差異代謝物的代謝途徑分析結(jié)果如圖7 所示。由圖7 可知，通路分析結(jié)果顯示共得到26 個(gè)途徑，以P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)關(guān)鍵代謝途徑進(jìn)行篩選，其中有4 條存在顯著性差異，分別為氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、半乳糖代謝途徑、TCA 循環(huán)、嘧啶代謝途徑。胞嘧啶核苷、異檸檬酸鹽、烏頭酸、肌醇、β-羥基丁酸等顯著增加，1-磷酸葡萄糖、尿酸含量降低。胞嘧啶核苷參與嘧啶代謝途徑，是抗病毒與抗腫瘤類藥物的生產(chǎn)過(guò)程中的重要中間體[21]。代謝途徑與功能性差異代謝產(chǎn)物聯(lián)合分析如圖8 所示，異檸檬酸鹽與烏頭酸作為有機(jī)酸，參與三羧酸（TCA）循環(huán)，TCA 循環(huán)是生物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化供能的共同途徑，異檸檬酸、烏頭酸含量增加，說(shuō)明能夠提高生物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的“逐步釋能”[22]。β-羥基丁酸在機(jī)體內(nèi)含量較低，但其以信號(hào)分子、能量底物等多種物質(zhì)形式廣泛參與到機(jī)體健康成長(zhǎng)過(guò)程中，β-羥基丁酸經(jīng)脫氫酶作用被氧化形成乙酰乙酸，乙酰乙酸經(jīng)酮體氧化，而后通過(guò)硫解酶催化得到乙酰CoA[23]，通過(guò)乙酰CoA 連接糖酵解途徑與TCA 循環(huán)，其作為具有生物活性的小分子物質(zhì)，具有保護(hù)神經(jīng)、心血管等組織器官的作用，對(duì)緩解骨質(zhì)減少有保護(hù)功能。尿酸是人體嘌呤代謝的終產(chǎn)物，磷酸戊糖途徑屬于嘌呤代謝的一種[19]，嘌呤代謝異常會(huì)引發(fā)多種疾病，尿酸主要由腎臟排泄，尿酸積聚可能會(huì)導(dǎo)致痛風(fēng)。肌醇參與半乳糖代謝途徑，其常作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑被應(yīng)用于功能性食品中，可以保護(hù)肝臟，對(duì)骨骼肌代謝和骨骼生長(zhǎng)具有積極作用，并且可以加快脂肪的消耗，有效預(yù)防脂肪堵塞心血管癥狀[24]。

圖8 代謝途徑與功能性差異代謝產(chǎn)物關(guān)聯(lián)分析

因此，GOS 的添加能夠促進(jìn)發(fā)酵乳次級(jí)代謝的合成與積累，使GOS 植物乳桿菌發(fā)酵乳具有保護(hù)心血管、增強(qiáng)骨骼密度、供給人體能量等潛在功效，是一種能潛在降低痛風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)酵乳產(chǎn)品。

2.2 GOS 植物乳桿菌發(fā)酵乳對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

2.2.1 物種α-多樣性分析

α-多樣性常用來(lái)指示某個(gè)特定的區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的物種或種群的多樣性，其中ace 指數(shù)常用來(lái)反映群落的豐富度，ace 指數(shù)越高，群落的豐富度越大，如圖9（a）所示，ace 指數(shù)無(wú)顯著變化（P>0.05），說(shuō)明群落中含有的物種總數(shù)無(wú)顯著變化；simpson 指數(shù)常用來(lái)反映群落物種多樣性，群落多樣性是對(duì)群落豐富度與均勻度的綜合分析，simpson 指數(shù)越大，物種多樣性越小，由圖9（b）可知，GOS 植物乳桿菌發(fā)酵乳降低了群落多樣性，可能是部分益生菌成為了優(yōu)勢(shì)菌群，因此使得群落的均勻度降低。Arnold 等用含益生元的食物喂食動(dòng)物2 周后，動(dòng)物微生物組成的α-多樣性顯著降低，有益微生物的相對(duì)豐度增加，包括Bifidobacterium和Bacteroides等[25]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)GOS 降低了整體菌群多樣性，增加了擬桿菌屬與乳酸桿菌屬的豐度。

圖9 物種多樣性分析

2.2.2 GOS 益生性發(fā)酵乳對(duì)腸道菌群群落的組成分析

益生菌通過(guò)多種途徑影響人體健康，微生物群落組成失衡(失調(diào))會(huì)導(dǎo)致冠心病、脂肪肝、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等多種疾病[1]。圖10 反映的是門水平上腸道菌群的物種組成。由圖10 可知，腸道菌群主要由放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)組成，添加GOS 的益生性發(fā)酵乳和糞便共培養(yǎng)4、12 h 后，在門水平上，Actinobacteria 和Bacteroidetes 的相對(duì)豐度有所提高，而Firmicutes 的相對(duì)豐度降低；圖11 反映的是屬水平上腸道菌群的物種組成。由圖11 可知，在屬水平上，GOS 益生性發(fā)酵乳增加了群落中Bifidobacterium, Bacteroides,Koalas等有益菌的豐度，抑制了Shigella等有害菌的繁殖。在人體腸道環(huán)境中，Bifidobacterium屬于Actinobacteria 的主要菌屬，Bifidobacterium的增殖可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸、丁酸等這類酸性物質(zhì)，這些酸性物質(zhì)可降低機(jī)體腸道環(huán)境的pH，對(duì)有害菌的生長(zhǎng)起到抑制作用[26]。Koalas可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，其屬于Firmicutes，Koalas相對(duì)豐度增加，而Firmicutes 整體豐度下降，說(shuō)明GOS益生性發(fā)酵乳對(duì)Firmicutes 起到一定的調(diào)節(jié)作用[8]。因此，GOS 益生性發(fā)酵乳雖然降低了菌群多樣性，但是提升了有益菌的相對(duì)豐度，降低了有害菌的相對(duì)豐度，有益于調(diào)節(jié)人體健康。

圖10 腸道菌群在門水平的物種組成及其豐度

圖11 腸道菌群在屬水平的物種組成及其豐度

2.2.3 物種β-多樣性分析

采用β-多樣性分析探究不同樣本間微生物群落物種組成的相似度及差異性。PCoA 分析（Principal co-ordinates analysis），即主坐標(biāo)分析，其與PCA 分析相類似。結(jié)果如圖12（a）所示，同種顏色的點(diǎn)代表來(lái)自同一分組的樣本，培養(yǎng)4 h 與12 h 后，添加GOS 的益生性發(fā)酵乳與空白對(duì)照組空間距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明菌群組成相似性低，表明添加GOS 的益生性發(fā)酵乳對(duì)腸道菌群組成的影響較大。

圖12 腸道菌群β-多樣性分析

非度量多維尺度分析（NMDS 分析）是可以在保留原始樣本的關(guān)系基礎(chǔ)之上，降維分析比較不同樣本組之間的差異。stress 值為0.042，低于0.05，表明NMDS結(jié)果具有很好的代表性，反映添加GOS 的益生性發(fā)酵乳所導(dǎo)致的群落結(jié)構(gòu)差異。如圖12（b）所示，圖中每一個(gè)樣本都用一個(gè)點(diǎn)來(lái)表示，同組樣本的顏色一樣，兩點(diǎn)之間相距越緊密表明兩者的菌群結(jié)構(gòu)組成越相近。由圖12（b）可見，培養(yǎng)4 h 后，在屬水平上，GOS 添加量為4%與6%的益生性發(fā)酵乳與未添加GOS 的發(fā)酵乳對(duì)腸道菌群的影響有較大差異，而GOS 添加量為2%的益生性發(fā)酵乳對(duì)腸道菌群的影響差異較小。培養(yǎng)12 h 后，在屬水平上，GOS 添加量為4%的發(fā)酵乳對(duì)腸道菌群的影響具有顯著差異。說(shuō)明GOS 添加量為4%時(shí)，該GOS 益生性發(fā)酵乳對(duì)腸道菌群物種組成影響最大。

3 結(jié) 論

代謝組學(xué)研究表明，植物乳桿菌發(fā)酵乳中添加GOS 后，其中氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸及碳水化合物等代謝物顯著增加（P＜0.05），同時(shí)發(fā)現(xiàn)了4 條具有顯著性差異的代謝產(chǎn)物代謝途徑，分別是氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、半乳糖代謝途徑、TCA 循環(huán)、嘧啶代謝途徑，正好同顯著增加的代謝產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)。說(shuō)明GOS的添加可以加快植物乳桿菌代謝蛋白質(zhì)、核酸和乳糖，其原理推測(cè)是因?yàn)镚OS 的添加首先激活植物乳桿菌體內(nèi)半乳糖代謝途徑，提高植物乳桿菌對(duì)GOS的利用，加快植物乳桿菌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步催化體內(nèi)的氨基酸和核苷酸糖代謝途徑、TCA 循環(huán)和嘧啶代謝途徑，促進(jìn)植物乳桿菌對(duì)蛋白質(zhì)、核酸和乳糖的代謝。人體腸道菌群在GOS 益生性發(fā)酵乳中培養(yǎng)后，增加了雙歧桿菌、擬桿菌屬、考拉菌屬等有益菌的豐度，抑制了大腸埃希氏菌等有害菌的繁殖。DA SILVA 等[27]在對(duì)低聚果糖（FOS）的體外糞菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)FOS 可以顯著促進(jìn)發(fā)酵液中擬桿菌和雙歧桿菌的增殖，并促進(jìn)了腸道細(xì)菌有益代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，ZHANG Y A 等[28]在對(duì)比果聚糖和FOS 對(duì)豬腸道菌群的影響中發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)腸道微生物組成和代謝存在不同動(dòng)態(tài)影響，果聚糖比FOS 具有更強(qiáng)的促進(jìn)回腸中微生物氨基酸發(fā)酵和糞便中碳水化合物發(fā)酵的能力。由此說(shuō)明腸道菌群的種類與氨基酸、碳水化合物、有機(jī)酸等代謝物含量息息相關(guān)，GOS 通過(guò)促進(jìn)植物乳桿菌代謝生成大量的氨基酸、碳水化合物和有機(jī)酸等代謝物從而改善腸道菌群中有益菌和有害菌的比例。