不同品種油茶殼皂素比較研究

王楊慧，丁丹寧，張鋒倫，陳殿松，朱莉偉，蔣建新*

（1.北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/國(guó)家林業(yè)和草原局木本香料（華東）工程研究中心，北京 100083；2.中華全國(guó)供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 211111；3.廣州德谷個(gè)人護(hù)理用品有限公司，廣東 廣州 510880）

油茶（Camellia oleiferaAbel）是我國(guó)特有的木本油料樹種，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)，是我國(guó)栽培面積最大、分布最廣的食用油料樹種之一。油茶殼是茶油加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，作為農(nóng)業(yè)廢棄物，每年有超過300萬噸被丟棄或焚燒［1-3］，不僅浪費(fèi)資源，還導(dǎo)致了環(huán)境污染問題。因此，要提升我國(guó)油茶綜合效益，就要對(duì)油茶殼進(jìn)行資源化利用［4-7］。

目前，我國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)存在產(chǎn)量低且品質(zhì)差異性大等諸多問題，因此選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的良種成為科研人員關(guān)注的重點(diǎn)，除油茶果實(shí)和油茶品質(zhì)外，油茶殼的利用也應(yīng)成為選育優(yōu)質(zhì)油茶的重要指標(biāo)之一［8］。油茶殼中富含茶皂素，茶皂素是一種五環(huán)三萜類的齊墩果烷型皂苷混合物，因其具有優(yōu)良的發(fā)泡、穩(wěn)泡、乳化、去污、分散等功能及殺蟲、抗菌、抗高血壓、抗氧化等生物活性，被廣泛用于天然抑菌洗手液［9］和香皂、保鮮包裝［10］、綠色農(nóng)藥［11］及新型紡織助劑和解酒飲料［12］等產(chǎn)品的開發(fā)，應(yīng)用涉及日化、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、建材和水產(chǎn)養(yǎng)殖等多個(gè)行業(yè)。從文獻(xiàn)報(bào)道的情況來看，由于皂素糖體和單體的多種組合，同一植株的不同部位、同一種植物在不同的生長(zhǎng)環(huán)境中茶皂素都會(huì)存在結(jié)構(gòu)與性能上的差異。Morikawa等［13］研究表明，茶花皂苷在不同品種和地區(qū)間存在差異；Fan等［14］發(fā)現(xiàn)茶葉皂苷含量受到茶樹基因型和生長(zhǎng)條件的影響；陳宏宇等［15］研究發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)多個(gè)品種茶葉的籽皂素總量、單體種類及含量根據(jù)它們外形的不同也具有顯著差異。目前我國(guó)油茶種類繁多，但關(guān)于不同品種茶樹的油茶殼中茶皂素的含量及性質(zhì)差異性相關(guān)的對(duì)比研究報(bào)道較少。本論文以我國(guó)廣泛種植的湘林210、華鑫、小果三種油茶品種為研究對(duì)象，探究其油茶殼皂素結(jié)構(gòu)與性能的差異，并對(duì)油茶皂素表面活性、發(fā)泡及乳化性能進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，旨在為油茶殼皂素高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

小果、湘林、華鑫三種品種油茶殼于2022年12月采集自湖南大三湘，干燥粉碎，過40目篩，于自封袋中備用。

無水乙醇、鹽酸、濃硫酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸鉀、硫酸銅、石油醚（60 ～ 90℃），均為分析純?cè)噭?，?gòu)自北京現(xiàn)代東方化學(xué)品有限公司；纖維二糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

R203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；ALPHA-T型紅外光譜儀（德國(guó)Bruker公司）；Agilent 1260型高效液相色譜（美國(guó)Agilent公司）；SCIWNTZ-18N型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BZY-101型自動(dòng)表面張力儀（上海方瑞有限公司）；SXT-06型六聯(lián)索氏提取器（上海本昂科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 皂素提取

采用無水乙醇為溶劑，在料液比1 ∶ 10（g/mL）、溫度60℃下浸提脫脂后的油茶殼原料三次，抽濾得到提取液，旋蒸濃縮干燥后得粗皂素。粗皂素得率（y）根據(jù)下式計(jì)算：

式中：m1為粗皂素質(zhì)量，g；m2為原料質(zhì)量，g；w為原料水分，%；

1.3 皂素純化

1.3.1 樹脂預(yù)處理

根據(jù)參考文獻(xiàn)［16］的方法，并稍有更改。選用弱極性、比表面積為480 ～ 520 m2/g的AB-8大孔樹脂純化皂素，采用濕法裝柱，浸泡24 h后，繼續(xù)用乙醇洗至流出液加水不呈白色渾濁為止，再用去離子水洗至無醇味。用5% HCl溶液浸泡3 h，去離子水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡3 h，去離子水洗至中性，備用。

1.3.2 柱層析

粗皂素樣品純化過程如簡(jiǎn)明流程圖（圖1）所示。

圖1 粗皂素梯度洗脫純化簡(jiǎn)明流程圖Fig.1 Simple flowchart for gradient elution purification of crude saponin

1.4 組成測(cè)定

1.4.1 脂肪

參照GB 5009.6-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》［17］中的索式抽提法，使用沸程為60 ～ 90℃的石油醚測(cè)定三種品種油茶殼脂肪含量。

1.4.2 游離糖

采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography， HPLC）測(cè)定粗皂素水溶液中游離糖的含量C游離糖，將粗皂素配置成2 mg/mL溶液于液相色譜中分析。分析條件為：HPX-87P柱（300 mm× 7.8 mm，9 μm），流動(dòng)相為水，流速為0.6 mL/min，柱溫為75℃，進(jìn)樣量為5 μL，檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。

1.4.3 皂素含量

采用HPLC法［18］對(duì)稀酸水解后皂素樣品中的單糖含量C單糖進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)固體殘?jiān)M(jìn)行干燥得皂苷元含量C皂苷元。

分析條件：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.03%硫酸溶液；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：75℃。

1.5 茶皂素性能表征

1.5.1 表面張力

根據(jù)文獻(xiàn)［19］的方法，略有調(diào)整。將皂素樣品用去離子水配制為12 g/L溶液并梯度稀釋至6、3、1.5、0.75、0.375 g/L，30℃水浴30 min。采用吊片法，使用表面張力儀測(cè)定各濃度溶液表面張力，重復(fù)3次取平均值，以溶液濃度的對(duì)數(shù)lgC為橫坐標(biāo)，表面張力為縱坐標(biāo)繪制曲線，從曲線上的拐點(diǎn)讀取臨界膠束濃度（Critical micelle concentration，CMC）。

1.5.2 起泡性及穩(wěn)泡性

采用量筒震蕩法［20］對(duì)純化前后皂素的泡沫高度進(jìn)行測(cè)量，取10 mL濃度分別為0.3% 、0.6%、1.2%的皂素水溶液加入50 mL具塞量筒，劇烈震蕩3 min，記錄開始時(shí)的泡沫高度和30 min后的泡沫高度，并分析起泡高度與皂素濃度相關(guān)性作為皂素穩(wěn)泡性的量度。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.5.3 乳化性及乳液穩(wěn)定性

石蠟是一種性質(zhì)極不活潑的碳?xì)浠衔铮Y(jié)構(gòu)上完全沒有親水基團(tuán)，能避免一些干擾［21］。因此實(shí)驗(yàn)以石蠟為油相，采用均質(zhì)機(jī)制備乳液，以10 000 rpm/min的速度均質(zhì)2 min，在CMC下的皂素與石蠟比例1 ∶ 1（W/O），取10 mL乳液，在室溫下放置0 h、12 h、24 h，觀察乳液層的變化。

1.5.4 紅外光譜分析

將3種品種油茶殼皂素粗提物和75%乙醇純化皂素在105℃烘干后，與溴化鉀（KBr）按照質(zhì)量比1∶ 100 混合均勻，研磨后進(jìn)行壓片。采用 Bruker-ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀在波數(shù)為400 ～ 4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，IBM SPSS 27.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD法多重比較，結(jié)果以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜ 0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 油茶殼成分分析

通過測(cè)定油茶殼原料中水分、灰分、脂肪含量以及粗皂素得率，比較三種品種油茶殼間成分差異。如表1所示，三種品種油茶殼中灰分含量最高為華鑫油茶殼4.19%，脂肪含量均小于1%，其中湘林油茶殼脂肪含量最低，為0.37%，與張文婷等［22］的研究結(jié)果相符合。三種品種粗皂素得率均為20%左右，其中湘林的得率最高，小果的最低，與呂復(fù)云等［23］采用60%乙醇浸提方法提取茶皂率得率（22.36 ± 0.15）%相當(dāng)，高于杜志欣等［24］人以80%乙醇超聲輔助提取得率。由表1中方差分析結(jié)果可知，湘林品種粗皂素得率顯著高于華鑫和小果（P＜0.05），且華鑫品種粗皂素得率也顯著高于小果（P＜ 0.05）。

表1 油茶殼基本成分分析Tab.1 Analysis of basic components of C.oleifera shell

2.2 粗皂素化學(xué)成分分析

皂素是一種五環(huán)三萜類皂苷，由糖基、皂苷元及有機(jī)酸組成，糖體和苷元通過醚鍵連接。表2為皂素中單糖和皂苷元含量分析，粗提物中的總糖主要有葡萄糖、木糖及阿拉伯糖，其中葡萄糖含量最高。且可以看出，三種樣品中湘林品種皂苷元含量最高，達(dá)到22.17%。三種品種油茶殼乙醇粗提物中皂苷含量相差較大，湘林品種含量最高達(dá)48.53%，而華鑫油茶殼粗提物中皂素含量?jī)H為39.73%，由表2中單因素方差分析結(jié)果可知，湘林品種油茶殼皂素含量與華鑫、小果有顯著性差異（P＜ 0.05）。

表2 不同品種油茶殼乙醇提取粗皂素化學(xué)組成Tab.2 Chemical composition of crude saponins extracted by ethanol from different varieties of C. oleifera shells

2.3 結(jié)構(gòu)及性能表征

2.3.1 紅外光譜

不同品種茶皂素的紅外光譜如圖2所示，三種茶皂素的特征吸收峰基本一致，說明提取物基本結(jié)構(gòu)相同。山茶屬植物皂苷為酯皂苷，具有兩個(gè)特征吸收帶1 720 cm-1和3 400 cm-1［25］。譜圖中湘林、華鑫和小果均在3 400 cm-1左右有一寬峰，即為皂苷元和糖鏈上羥基（-OH）伸縮振動(dòng)吸收峰，其中湘林在此處的吸收較強(qiáng)；2 927 cm-1是飽和的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰；-C=O伸縮振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在1 850 ～ 1 600 cm-1范圍內(nèi)，1 609 cm-1吸收峰表明存在不飽和羰基；1 071 cm-1處為C-O-C振動(dòng)吸收［26］。另外可根據(jù)1 350 cm-1左右的碳?xì)湮?，判定分子骨架為齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷。

圖2 三種品種油茶殼純化皂素紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of purified saponins from three varieties of C. oleifera shells

2.3.2 表面張力

粗皂素的表面張力隨樣品濃度變化如圖3所示，三個(gè)品種油茶殼粗皂素的CMC在0.4 ～ 0.6 g/L之間，達(dá)到CMC值時(shí)三種品種油茶殼皂素的表面張力大小為湘林 ＜ 華鑫 ＜ 小果，在42.6 mN/m左右，與文獻(xiàn)［27］報(bào)道結(jié)果相符。其中湘林粗皂素的表面張力隨著濃度的上升，由53.6 mN/m下降至42.6 mN/m，其CMC值為4.02 g/L。表面張力CMC值越小，說明皂素在溶液中形成膠束所需的濃度越低，表面活性越好［28］。通過比較發(fā)現(xiàn)，湘林、華鑫與小果三種品種中，湘林茶皂素CMC值最低，說明其表面活性最好。

圖3 不同品種粗皂素濃度對(duì)表面張力的影響Fig.3 Effect of crude saponin concentration on the surface tension in different varieties of C.oleifera

2.3.3 起泡性和穩(wěn)泡性

三個(gè)品種粗皂素泡沫高度如圖4所示。三個(gè)品種油茶殼粗提物溶液均具有較強(qiáng)的起泡能力，且均與樣品濃度有關(guān)，泡沫高度隨樣品濃度的增大而增高。說明皂素含量越高，起泡性能越顯著。由于油茶樹生長(zhǎng)條件與品種的不同，不同樣品的起泡能力有明顯差異，湘林品種茶皂素的起泡能力最優(yōu)，小果最差，在濃度為12 g/L時(shí)的泡沫高度分別為10.40 cm和4.08 cm。用30 s時(shí)的泡沫體積作為皂素起泡能力的指標(biāo)，V5min/V30s的泡沫體積作為皂素的穩(wěn)泡指標(biāo)，穩(wěn)泡性體現(xiàn)的是泡沫的存活能力［29］。

圖4 不同品種皂素泡沫高度與濃度關(guān)系Fig.4 Relationship between foam height and concentration of saponins in different varieties

由表3數(shù)據(jù)可知，所有樣品均具有很好的泡沫穩(wěn)定性，其中華鑫品種泡沫穩(wěn)定性最好，可穩(wěn)定30 min不消泡。泡沫的產(chǎn)生量、大小及穩(wěn)定性是消費(fèi)者評(píng)價(jià)日化產(chǎn)品的重要參考，因此華鑫品種十分適合應(yīng)用于清潔產(chǎn)品。

表3 不同品種油茶殼粗皂素溶液泡沫穩(wěn)定性比較Tab.3 Comparison of foam stability of crude saponin solution from different varieties of C.oleifera shells

2.3.4 乳化穩(wěn)定性

乳化性是評(píng)價(jià)皂素表面活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。水相與脂相本是不相容的，乳化劑通過吸附在油相/水相界面，降低界面張力和保護(hù)液滴不聚集來促進(jìn)乳化和增強(qiáng)物理穩(wěn)定性。皂素乳化作用的實(shí)質(zhì)便在于降低液-液體系中的界面張力，皂素作為乳化劑，起到使油、水兩種互不相溶的液體一方以極微小的液滴均勻地分散于另一方溶液中形成較穩(wěn)定的乳液狀態(tài)的作用。

根據(jù)乳液靜置24 h后下層分離出水層的高度作為乳化性的判定依據(jù)。下層水層高度越低，表示形成的乳液穩(wěn)定性越好，皂素乳化性越好。24 h后的水層分離情況如圖5所示，對(duì)比三個(gè)樣品可發(fā)現(xiàn)華鑫皂素乳液水層高度最低為2.3 cm，乳化穩(wěn)定性最佳。

圖5 三個(gè)品種粗皂素乳化分層圖Fig.5 Emulsification and stratification of three varieties of crude saponin

3 結(jié)論

由于油茶的種植環(huán)境、土壤類型、光照時(shí)間、降雨量、采摘時(shí)間等因素的不同，不同品種油茶殼中皂素的含量及性質(zhì)均有一定的差異，本文采用無水乙醇浸提法測(cè)定油茶殼中粗皂素，通過進(jìn)一步酸水解及高效液相色譜法進(jìn)行皂苷含量分析，通過比較粗提物得率與其皂苷含量可知湘林粗皂素得率為23.58%，其中皂苷含量48.53%，在差異顯著的三個(gè)品種油茶殼中含量最高，這有利于油茶殼高值化利用選種，為產(chǎn)業(yè)化發(fā)展增效。

通過綜合評(píng)價(jià)粗提物表面張力、起泡性、穩(wěn)泡性、乳化性與皂苷含量可知，湘林油茶殼皂素具有較高的皂苷含量和較低的CMC值，華鑫油茶殼皂素具有相對(duì)較好的起泡性及最好的穩(wěn)泡性，湘林油茶殼皂素適宜用作表面活性劑，華鑫油茶殼皂素適宜用作乳化劑進(jìn)行綜合利用。

本文僅從品種角度對(duì)殼中皂素進(jìn)行了部分性能比較，后續(xù)的研究中，在增大樣品量的同時(shí)可以對(duì)不同的影響因素展開系統(tǒng)的研究，為全面評(píng)價(jià)油茶果提供更加詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。