一種適宜高通量基因型鑒定的植物組織取樣法及其應(yīng)用

仲威宇,朱曉斌,夏正俊,李艷華,張麗輝

(1.長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130032;2.東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 中國(guó)科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院,黑龍江 哈爾濱 150081)

我國(guó)植物資源豐富,為基因功能研究與品種選育提供了重要的遺傳材料。在植物分子生物學(xué)研究中,從分子標(biāo)記如SSR等篩選、已知基因的基因型鑒定、變異位點(diǎn)檢測(cè)、重組體篩選等,都需要提取大量樣品的DNA[1-2]。DNA的制備質(zhì)量與速度均會(huì)對(duì)分子實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性造成影響[3]。然而,目前大多數(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主要通過(guò)單管取樣,進(jìn)而利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[4]來(lái)提取DNA,但研究樣品數(shù)量大的遺傳群體或育種材料時(shí),需要重復(fù)操作,效率低下。

目前,現(xiàn)有的快速提取方法有堿裂解法[5]、TE緩沖液研磨法[6],雖然這兩種方法都可將DNA提取時(shí)間縮短到1小時(shí)左右,但提取的DNA的質(zhì)量常滿足不了下游PCR等要求。另一種快速方法是使用一次性聚合物微針貼片刺穿葉片組織,提取細(xì)胞內(nèi)DNA。這適用于植物病害的快速分子診斷,尚難以應(yīng)用于常規(guī)的分子生物學(xué)研究中[7]。

雖然已有不少公司可提供商業(yè)化的DNA提取服務(wù),先利用常規(guī)的植物葉片取樣器,將葉片取至96孔深孔板中,再經(jīng)過(guò)自動(dòng)提取DNA儀器[8-9],但現(xiàn)在還只有96孔板模式,且成本極高。在普通的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室或育種單位,急需開(kāi)發(fā)一種成本低、效率高的植物葉片取樣方法,及配套的基因組DNA提取技術(shù)流程,可適用于種質(zhì)資源DNA、基因定位與克隆、分子育種等多種技術(shù)。本研究利用384微孔深孔板、吸管、牙簽等簡(jiǎn)單裝置,設(shè)計(jì)了一種可以標(biāo)準(zhǔn)化定量提取大批量植物葉片組織的技術(shù),同時(shí)適配開(kāi)發(fā)了改良的CTAB法基因組DNA提取流程,可應(yīng)用于高通量基因型鑒定等,有利于分子生物學(xué)研究人員與分子育種的育種家利用普通的實(shí)驗(yàn)室條件開(kāi)展高通量基因型鑒定工作。

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)技術(shù)取樣后提取植物基因組DNA, 可提高分子實(shí)驗(yàn)研究效率與基因型鑒定效率,通過(guò)對(duì)比普通單管CTAB法的提取操作時(shí)間、提取質(zhì)量、保存時(shí)間,并通過(guò)2% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)通過(guò)改良取樣方法及大規(guī)模提取DNA后,可以明顯縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,加快實(shí)驗(yàn)效率,且使用的試劑對(duì)操作人員危害相對(duì)較低。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料為:經(jīng)過(guò)60Co γ射線誘變后的合農(nóng)75大豆(GlycinemaxL.)大片段缺失突變體QS350與合豐55雜交F2代遺傳及衍生群體。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

聚丙烯384透明底深孔方型微孔板(每孔容積約為240 μL/孔)(Corning);透明吸管(直徑約3.0 mm);牙簽;PCR儀(GeneAmp PCR System 9700,Applied Biosystems);水浴鍋(HH600,茂祥儀器設(shè)備廠);自動(dòng)聯(lián)排移液器(E4 XLS,RAININ);離心機(jī)(DD-5M,湘儀);回旋式振蕩器(HY-5,榮華儀器制造有限公司);超微量分光光度計(jì)(Nano Drop 2000c,Thermo Scientific);真空泵(VPA-2,浙航機(jī)械有限公司)。

1.3 DNA提取試劑

CTAB(十六烷基三甲基溴化銨,上海生工)溶液;1.5% CTAB;1.4 mol/L NaCl;100 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0);20 mmol/L EDTA(4 mL of 0.5 mol Stock/100 mL);1% PVP-40;CIA溶液(氯仿與異戊醇比例為24∶1)。

2 取樣方法及提取流程

2.1 取樣技術(shù)流程

所需取樣提取器材如圖1所示。高通量基因型鑒定的植物組織取樣法大豆葉片取樣流程如圖2所示。高通量基因型鑒定的植物組織取樣法大豆葉片轉(zhuǎn)移及磨樣流程如圖3所示。

A-磨樣用96孔針;B-384深孔微孔板;C-取樣吸管;D-取樣牙簽。圖1 所需取樣提取器材

圖2 大豆葉片取樣流程

A-覆蓋錫紙的384微孔板;B-將樣品送入384板底部;C-將每排取樣孔封上;D-研磨樣品。圖3 大豆葉片轉(zhuǎn)移及磨樣流程

根據(jù)384深孔微孔板的孔徑與高度,選擇合適直徑的吸管。因本實(shí)驗(yàn)中選擇的384微孔板的孔直徑大小為3.0 mm,所以本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)直徑為2.5 mm,外直徑為3.0 mm的塑料管(吸管),并統(tǒng)一裁切成長(zhǎng)度約為20～30 mm左右,可根據(jù)實(shí)際情況自行增減長(zhǎng)度。

將待取樣葉片對(duì)折2～3次。左手持葉片樣品,右手使用吸管抵住葉片與左手手指,用力擠壓將葉片壓入吸管內(nèi)(圖2A～F),取樣后不影響葉片的后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育;為防止取樣時(shí)樣品被帶入其他孔內(nèi),取樣前先使用鋁/錫箔紙覆蓋384深孔微孔板,同時(shí)壓緊以便凸顯微孔位置(圖3A);使用金屬棒或牙簽將吸管內(nèi)葉片推入384深孔內(nèi)(圖3B);每取完一個(gè)樣品使用酒精棉擦拭手指,清除可能殘留的樣品;在取完一列樣品后,使用膠帶將孔貼上,以防取樣時(shí)對(duì)上一列樣品出現(xiàn)交叉污染(圖3C)。

重復(fù)上述操作,直至完成所有葉片的取樣。一個(gè) 384 樣品板完成后,低速離心,使植物樣品沉降于植物底部。取完樣品后使用真空泵進(jìn)行干燥并使用自制96孔針進(jìn)行充分破碎研磨(圖3D)。

2.2 DNA提取方法

改良CTAB法,參考武林琳的方法[10]并進(jìn)行改良。

步驟1(破碎樣本):使用上述大豆葉片取樣方法取樣后,將裝有植物葉片的384微孔板放入真空泵中進(jìn)行抽氣干燥,干燥后使用96孔針充分搗碎,破碎細(xì)胞壁。

步驟2(裂解細(xì)胞及滅酶):向干燥搗碎后的384微孔板每孔中加入75 μL 含有1%β巰基乙醇的2% CTAB溶液,在65 °C的恒溫水浴鍋中水浴60 min,期間間隔5～10 min緩慢搖晃均勻。

步驟3(提取核酸):冷卻至室溫后加入75 μL的CIA溶液, 輕輕混勻,4 000 r/min離心30 min。取20～30 μL左右上清液至新的384微孔板內(nèi),加入等體積預(yù)冷的異丙醇,-20 ℃保存30～60 min后4 000 r/min離心30 min,揭開(kāi)蓋板,鋪上吸水紙,反置384微孔板,50 r/min瞬離心上清液。

步驟4(洗滌核酸):向瞬離心后的384微孔板中加入20 μL的70%無(wú)水乙醇,室溫放置 10 min,4 000 r/min離心10 min,50 r/min倒置瞬離去上清,風(fēng)干管內(nèi)溶液。

步驟5(保存核酸):加入10 μL去離子水,完全溶解DNA,即可進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)及電泳

DNA模板準(zhǔn)備:利用自動(dòng)聯(lián)排移液器取2 μL基因組 DNA轉(zhuǎn)移至384孔PCR板中,每孔的PCR反應(yīng)液體系包括:2×SanTaq PCR Mix預(yù)混酶(Sangon Biotech,上海)5 μL, 第1對(duì)PCR引物(含10 μmol·L-1Del-11正向引物與10 μmol·L-1Del-11反向引物)各0.5 μL, 第2對(duì)PCR引物(含10 μmol·L-1Del-1021正向引物與10 μmol·L-1Del-1021反向引物)各0.5 μL, 加入滅菌超純水(ddH2O)至10 μL。

提取的大豆葉片DNA用設(shè)計(jì)的缺失區(qū)間內(nèi)的與突變表型緊密連鎖的引物del-11和del-1021進(jìn)行PCR擴(kuò)增。del-11上游引物:CCCATTCGTGTCACTGTCAC;del-11下游引物:AGGTGCACATAGGGGAAGTG;del-1021上游引物:TCCTAAGCAGCTTCCACGAT;del-1021下游引物:CTACGACGAGTTCCTCCGAG。

PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 預(yù)變性 5 min;95 ℃ 變性1 min,59 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸40 s,總計(jì)33個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸7 min;4 ℃ 保存。

電泳及其顯色:采用 2%瓊脂糖凝膠用SuperRed/GelRed(Biosharp)染色,在Gel Image System Tanon-1600(Tanon)上掃描成像。利用本實(shí)驗(yàn)的取樣方法進(jìn)行提取植物基因組DNA,與常規(guī)單管CTAB法對(duì)比,兩種方法結(jié)果對(duì)比如圖4所示。

M為2K DNA Marker;1～4:高通量384板CTAB法(黃化突變體植株);5～8:CTAB單管法(黃化突變體植株);9～12:高通量384板CTAB法(野生型植株);13～16:CTAB單管法(野生型植株)。圖4 使用del-11F/R與del-1021F/R兩對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定引物多態(tài)性

結(jié)果表明,使用本實(shí)驗(yàn)的取樣方法,利用改良后的CTAB法提取的植物基因組DNA效果較好,條帶亮度與常規(guī)單管CTAB法基本無(wú)異,可以鑒別基因型。

3 應(yīng)用實(shí)例及注意事項(xiàng)

本研究建立了一種高通量、高效率提取植物葉片組織DNA的方法,只需利用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常見(jiàn)的工具即可實(shí)現(xiàn)同時(shí)提取大量DNA的實(shí)驗(yàn)要求。所建立的技術(shù)方法,每人每日可提取384深孔板4～6板,相當(dāng)于1 500～2 300個(gè)大豆樣本,與常用的單管提取法相比,效率顯著提高。

在大豆突變體庫(kù)中[11]M3代中,篩選出一個(gè)苗期黃化致死突變分離株行,正常株與突變株的比例為3∶1,經(jīng)混池測(cè)序與BVF-IGV流程分析[12],初步確定候選基因?yàn)槲挥?0號(hào)染色體的32 338 071 bp～34 915 651 bp區(qū)間內(nèi)約2.6 Mb的大片段缺失。因突變?yōu)槊缙谥滤辣硇?推測(cè)分離株行中的正常株中有雜合型突變基因。在分離株行正常株與合豐55進(jìn)行雜交F2代中,出現(xiàn)了1∶3分離群體,并利用該群體來(lái)驗(yàn)證根據(jù)大片段缺失由來(lái)的分子標(biāo)記與黃化表型的關(guān)聯(lián)。

按照本研究設(shè)計(jì)的方法,采集了3個(gè)384孔板,共1 150個(gè)樣本,其中正常表型植株共1 011株,突變表型植株共139株,經(jīng)本研究所述方法進(jìn)行DNA提取,經(jīng)過(guò)鑒定,正常表型植株共960株P(guān)CR結(jié)果為雙條帶,引物與表型匹配率達(dá)94.96%。突變表型植株共138株無(wú)條帶,1株結(jié)果為雙條帶,鑒定結(jié)果引物與表型匹配率達(dá)99.28%。通過(guò)該方法,成功證明表型與所設(shè)計(jì)的Indel引物關(guān)聯(lián),可用于后續(xù)定位目的基因。由圖5可見(jiàn),使用兩對(duì)大片段缺失區(qū)間內(nèi)有200 bp左右差異的Indel引物進(jìn)行PCR,在高通量鑒定系統(tǒng)中,兩引物間不互相影響。

圖5 大片段缺失多態(tài)性連鎖引物鑒定結(jié)果

如圖5所示,在大片段缺失區(qū)間內(nèi)和缺失區(qū)間兩端,每隔2 000 bp設(shè)計(jì)一對(duì)引物,使用該方法,我們成功鑒定出多對(duì)可以用于后續(xù)研究的與表型連鎖的多態(tài)性引物,成功將Indel分子標(biāo)記與表型緊密關(guān)聯(lián)起來(lái)。

4 結(jié)語(yǔ)

如何快速標(biāo)準(zhǔn)取樣及如何高通量提取DNA一直是制約植物、作物分子鑒定的關(guān)鍵步驟[13]。本研究提出的高通量葉片標(biāo)準(zhǔn)取樣法及DNA提取鑒定技術(shù),適用多種植物及作物,使用384微孔深孔板及吸管即可完成標(biāo)準(zhǔn)化定量取樣工作,同時(shí)應(yīng)用改良的武林琳的CTAB法[10]進(jìn)行DNA提取,一至兩小時(shí)即可提取數(shù)個(gè)384深孔板,且片段完整,PCR擴(kuò)增效果較好,且結(jié)果準(zhǔn)確。與傳統(tǒng)單管式CTAB法相比,本方法操作簡(jiǎn)單,步驟少,耗時(shí)短,使用氯仿等有毒有害有機(jī)溶劑量少,所需樣本量低,對(duì)植物損傷較小,可大幅度節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本,對(duì)于植物分子標(biāo)記及快速DNA檢測(cè)研究具有重要應(yīng)用價(jià)值。