芍藥苷滴丸的制備工藝及抑菌活性研究*

汪 穎，佘守軍，程 正

(1 銅陵市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 銅陵 244000；2 銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽 銅陵 244000)

芍藥苷(Paeoniflorin，PAE)來(lái)源于白芍(PaeoniaeRadixAlba)、赤芍(PaeoniaeRadixRubra)的干燥根和牡丹(PaeoniasuffruticoseAndr)的干燥根皮，其中，赤芍和牡丹皮中含量較大[1-2]。芍藥苷是一種單萜類糖苷[3]，屬于生物活性單體成分，在體內(nèi)吸收快無(wú)明顯毒副作用，具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)靜止痛、降低血液黏度、抗血小板聚集、擴(kuò)張動(dòng)脈血管、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)[4-6]，臨床有很大的應(yīng)用前景。

滴丸劑是固體分散體制劑的一種，藥物以分子、微粉或膠體的狀態(tài)高度分散，起效迅速且作用可靠[7]。當(dāng)使用的滴丸基質(zhì)溶于水時(shí)，制備的滴丸劑具有溶出速度快，生物利用度高，用藥方便等特點(diǎn)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)芍藥苷提取純化工藝研究的基礎(chǔ)上，將芍藥苷提取物與適宜的水溶性基質(zhì)混勻制成滴丸[10]，通過(guò)單因素考察和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法相結(jié)合優(yōu)化該滴丸的制劑工藝，并考察其抑菌活性，為芍藥苷滴丸的進(jìn)一步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

AB135-S電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DWJ-IS滴丸機(jī)，煙臺(tái)博鑫制藥機(jī)械有限公司；ZBS-6E智能崩解儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司；BSC-1300IIA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GI100TW高壓滅菌鍋，致微(廈門(mén))儀器有限公司；DHP-9272B電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DensiCHEK Plus比濁儀，法國(guó)生物梅里埃公司。

1.2 試 藥

芍藥苷藥粉(實(shí)驗(yàn)室自制)；PEG4000(分析純)、PEG6000(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；泊洛沙姆(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；二甲基硅油(分析純)、液體石蠟(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，植物油(大豆油)，中糧福臨門(mén)；培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號(hào)：200315)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號(hào)：2102202)，北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司；實(shí)驗(yàn)菌株：大腸埃希氏菌[CMCC(B)44102]、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌[CMCC(B)50094]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]，中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 滴丸的制備

取適量基質(zhì)置于燒杯中，于水浴鍋中一定溫度加熱攪拌至融化，再加入相應(yīng)比例的芍藥苷藥粉，攪拌至混合均勻，保溫靜置15 min，倒進(jìn)已預(yù)熱至相應(yīng)溫度的滴丸機(jī)，滴入冷卻液中，收集滴丸，用濾紙吸去滴丸殘留液體，干燥，收丸。

2.2 基質(zhì)的選擇

常用的滴丸水溶性分散基質(zhì)有PEG4000、PEG6000、泊洛沙姆、硬脂酸鈉等[8]。本實(shí)驗(yàn)先選擇PEG4000、PEG6000、泊洛沙姆三種分散基質(zhì)作為滴丸基質(zhì)考察，預(yù)試驗(yàn)條件為藥物與基質(zhì)比1∶2，藥液(預(yù)熱及滴制)溫度80 ℃，滴速30滴/min，冷卻液溫度10 ℃，滴距10 cm，滴頭內(nèi)徑3.5 mm，結(jié)果見(jiàn)表1。以PEG4000為基質(zhì)滴制時(shí)滴丸成品略軟，圓整度佳；以PEG6000為基質(zhì)時(shí)滴丸硬度更好但滴制時(shí)比較粘稠流動(dòng)性成型較差，以泊洛沙姆為基質(zhì)時(shí)與PEG4000情況類似但成型略有黏連。最后決定以PEG4000與PEG 6000混合使用作為滴丸基質(zhì)，混合比例選取為3∶1、2∶1、1∶1，待后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。

表1 不同基質(zhì)對(duì)滴丸成型的影響Table 1 Influence of different substrates on the forming of dropping pills

2.3 考察制備工藝(單因素分析)

使用單因素實(shí)驗(yàn)從冷卻液、冷卻溫度、滴距、滴速幾方面篩選合適條件，判斷標(biāo)準(zhǔn)為滴丸的外觀指標(biāo)：硬度、圓整度、拖尾度、黏連度、光澤度，外觀指標(biāo)評(píng)價(jià)打分表如表2所示，綜合評(píng)分為每項(xiàng)得分相加?；緱l件為考察因素的居中條件：芍藥苷與基質(zhì)[PEG4000∶PEG6000(2∶1)]比1∶2 ，藥液溫度80 ℃，滴速30滴/min，冷卻液溫度10 ℃，滴距10 cm，滴頭內(nèi)徑3.5 mm，考察某一因素時(shí)，固定其余因素。

表2 外觀指標(biāo)評(píng)價(jià)表Table 2 Appearance index evaluation table

2.3.1 冷卻液的選擇

常用的水溶性基質(zhì)冷卻液有二甲基硅油、液體石蠟、植物油等[8]。本次以滴丸的圓整度、沉降速度及光澤度為考察指標(biāo)，比較二甲基硅油、液體石蠟、植物油三種冷卻液的效果。結(jié)果使用二甲基硅油為冷卻液時(shí)，滴丸沉降速度適中，最終得到的滴丸之間無(wú)黏連，圓整度良好，拖尾情況少，光澤度佳，綜合得分優(yōu)于使用液體石蠟及植物油，故后續(xù)選用二甲基硅油作為冷卻液。

表3 不同冷卻液對(duì)滴丸成型的影響Table 3 Influence of different coolant on the forming of dropping pills

2.3.2 冷卻溫度、滴距、滴速的選擇

比較不同的冷卻液溫度5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃時(shí)滴制情況：溫度過(guò)低時(shí)滴丸圓整度不佳，溫度高時(shí)滴丸易產(chǎn)生拖尾黏連，圓整度也欠佳，由表4綜合得分最終確定冷卻液溫度為10 ℃。

比較不同滴距5 cm、8 cm、10 cm、15 cm時(shí)滴制情況：滴距過(guò)小時(shí)滴丸來(lái)不及成型，滴距過(guò)大時(shí)滴丸圓整度較差，且進(jìn)入冷卻液時(shí)易產(chǎn)生細(xì)粒使得丸重差異變大，由表4綜合得分最終確定冷卻液滴距為8 cm。

比較不同滴速10 d/min、30 d/min、50 d/min、70 d/min時(shí)滴制情況：滴速較慢時(shí)滴丸整體質(zhì)量較好，滴速過(guò)快時(shí)滴丸之間易黏連，滴丸拖尾情況也加劇，按表4綜合得分可見(jiàn)10 d/min，30 d/min得分相同，考慮到滴制效率最終確定滴速為30 d/min。

表4 不同冷卻溫度、滴距、滴速對(duì)滴丸成型的影響Table 4 Influence of different cooling temperature，drop distance and drop speed on the forming of dropping pills

2.4 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化制備工藝

表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中各因素水平表Table 5 Table of factors in the orthogonal experiment

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考慮到滴丸制備工藝的影響因素，確定因素A為PEG4000：PEG6000比值、因素B為藥物：基質(zhì)比值、因素C為藥液溫度三個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)每個(gè)因素各設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以丸重差異系數(shù)和溶散時(shí)限兩種參數(shù)作為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì) L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表5，采用正交實(shí)驗(yàn)助手IIV3.1進(jìn)行正交設(shè)計(jì)分析[10]，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析見(jiàn)表7、表8。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental results

表7 丸重變異系數(shù)方差分析結(jié)果Table 7 Variance analysis results of pill weight variation coefficient

表8 溶散時(shí)限方差分析結(jié)果Table 8 Variance analysis results of dissolution time limit

在正交表中由直觀分析可得，以丸重變異系數(shù)為考察指標(biāo)，三個(gè)因素影響程度為B>A>C，A1>A2≈A3，B1>B2>B3，C1>C2>C3。以溶散時(shí)限為考察指標(biāo)，三個(gè)因素影響程度相差不大。從方差分析結(jié)果可知，因素B對(duì)丸重變異系數(shù)有較大影響，因素A、B、C對(duì)溶散時(shí)限無(wú)顯著影響。由于丸重變異系數(shù)越小越好，綜合評(píng)選出最佳工藝為A3B3C3，即以PEG4000與PEG6000比例為1∶1做復(fù)合基質(zhì)，藥物與基質(zhì)比例為1∶4，藥液溫度為90 ℃，冷卻液為二甲基硅油，冷卻液溫度10 ℃，滴距8 cm，滴速30 d/min時(shí)最優(yōu)。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取3份各4 g芍藥苷提取物，按優(yōu)選的工藝制備3批芍藥苷滴丸，分別抽取樣本n=20進(jìn)行考核，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷滴丸外觀為棕褐色小丸，色澤均一，丸型圓整，硬度適中，無(wú)拖尾或黏連現(xiàn)象。按《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0108丸劑項(xiàng)下重量差異檢查法及溶散時(shí)限檢查法檢測(cè)，丸重差異分別為：3.25%、3.01%、3.5%，均<10%；溶散時(shí)限分別為3.30 min、3.20 min、3.59 min，均<30 min，兩項(xiàng)檢查均符合相關(guān)規(guī)定，表明優(yōu)化的滴丸成型工藝穩(wěn)定可行。

3 芍藥苷滴丸抑菌性研究

使用牛津杯抑菌試驗(yàn)來(lái)測(cè)定芍藥苷滴丸抑菌活性[11]。將芍藥苷滴丸制成10 mg/mL藥液(芍藥苷含量2.5 mg/mL)，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后備用，臨用現(xiàn)制。TSA、TSB培養(yǎng)基滅菌備用。

3.1 菌種活化和菌懸液制備

復(fù)蘇活化5種供試菌種后，分別傳代接種于TSA上，35 ℃培養(yǎng)24 h，挑取平板上單個(gè)菌落，接種于TSB再培養(yǎng)12 h，用0.9%無(wú)菌生理鹽水作為稀釋劑，使用比濁儀將菌液調(diào)整至0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷釂挝?約為1.5×108CFU/mL)并繼續(xù)稀釋至106CFU/mL，臨用現(xiàn)制[11]。

3.2 牛津杯抑菌試驗(yàn)

取各待測(cè)菌液1 mL分別與20 mL 50 ℃保溫的TSA培養(yǎng)基混合制備平板，將已滅菌的牛津杯(內(nèi)徑6 mm)放置于平板上，每個(gè)平板上均勻間隔放置四個(gè)，其中三個(gè)以滅菌移液器加入100 μL制備好的無(wú)菌藥液加入藥液，另一個(gè)加入等量無(wú)菌水做為空白對(duì)照，35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后以十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑，每組平行三次取平均值。

結(jié)果如表9所示，5種供試菌株中，芍藥苷滴丸對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最佳，抑菌圈直徑有14.43 mm，對(duì)乙型副傷寒沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌抑菌效果次之，分別為12.80 mm、12.93 mm、11.67 mm，5種供試菌中對(duì)大腸埃希氏菌抑菌效果相對(duì)最差抑菌圈直徑僅為9.03 mm。

表9 芍藥苷滴丸對(duì)5種供試菌株的抑菌效果Table 9 Inhibitory effect of paeoniflorin dripping pills on 5 strains tested

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素考察結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)芍藥苷滴丸的成型工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并確定了芍藥苷滴丸的最佳成型工藝條件為：即以PEG4000與PEG6000比例為1∶1做復(fù)合基質(zhì)，藥物與基質(zhì)比例為1∶4，藥液溫度為90 ℃，冷卻液為二甲基硅油，冷卻液溫度10 ℃，滴距8 cm，滴速30 d/min。質(zhì)量初步評(píng)價(jià)結(jié)果表明，滴丸丸型圓整，硬度較好，丸重變異系數(shù)和溶散時(shí)限均符合相關(guān)規(guī)定，為芍藥苷滴丸的生產(chǎn)提供了科學(xué)的參考依據(jù)。對(duì)抑菌活性做了初步研究，表明芍藥苷制成滴丸后對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌仍有一定的抑菌作用，為后期對(duì)芍藥苷滴丸的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。