電化學(xué)方法檢測(cè)還原型谷胱甘肽的研究進(jìn)展*

魏世楠，趙靈芝，張小清，董旭陽(yáng)，張 碩，寇張文，黨嘉怡

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

谷胱甘肽存在于所有哺乳動(dòng)物的組織內(nèi)，濃度在1～10 mM范圍，是由半胱氨酸(Cysteine，Cys)、谷氨酸(Glutamate，Glu)和甘氨酸(Glycine，Gly)組成的一種含γ-酰胺鍵的三肽。谷胱甘肽通常在體內(nèi)存在形式有還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)及其氧化物氧化型谷胱甘肽(L-Glutathione oxidized，GSSG)(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，兩者在體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化并達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，從而維持體內(nèi)的氧化還原平衡[1-2]。GSH的濃度改變與生物體內(nèi)或組織內(nèi)某些疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)，其濃度水平可作為白血病，阿爾茨海默氏病，AIDS，細(xì)胞癌變，糖尿病以及動(dòng)脈粥樣硬化等各種疾病的指標(biāo)[3-5]。因此，研究者一直致力于發(fā)展靈敏度高、選擇性好的檢測(cè)方法去實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)GSH的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為從分子水平認(rèn)識(shí)和了解多種疾病發(fā)病的化學(xué)機(jī)制，向臨床診斷和靶向治療提供方法和手段。

到目前為止，用來(lái)檢測(cè)谷胱甘肽的方法主要有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、光學(xué)分析法、電化學(xué)方法等[6-9]。電化學(xué)法因其設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低，可通過(guò)電極微型化和集成化可進(jìn)一步發(fā)展為便攜設(shè)備用于現(xiàn)場(chǎng)分析和活體分析，已被報(bào)道多次應(yīng)用于GSH的分析檢測(cè)中。本文綜述了近幾十年報(bào)道的基于電化學(xué)技術(shù)發(fā)展的GSH檢測(cè)方法的新進(jìn)展，并對(duì)今后的研究趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

圖1 還原型谷胱甘肽GSH及其氧化物氧化型谷胱甘肽 GSSG的分子結(jié)構(gòu)和電化學(xué)相互化Fig.1 Molecular structure and electrochemical interconversion of GSH and GSSG

1 電化學(xué)檢測(cè)GSH的原理

電化學(xué)傳感是利用電化學(xué)反應(yīng)的基本原理，產(chǎn)生與目標(biāo)分析物濃度有關(guān)的電信號(hào)(如電阻、電導(dǎo)、電位、電流、電勢(shì)等)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的定性檢測(cè)和定量分析。最常見(jiàn)的電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括循環(huán)伏安法(CV)、電化學(xué)阻抗譜技術(shù)、安培法、計(jì)時(shí)安培法、差分脈沖法(DPV)和方波伏安法(SWV)等。GSH本身具有電化學(xué)活性，即可與電極表面發(fā)生電子傳遞，因而可基于電化學(xué)法檢測(cè)GSH。電化學(xué)法檢測(cè)GSH可分為直接法和間接法，直接法是基于GSH與電極之間直接發(fā)生電子轉(zhuǎn)移來(lái)定量檢測(cè)，其原理是：GSH是具有巰基的還原性物質(zhì)，在一定電位下在電極表面可失去兩個(gè)電子和兩個(gè)質(zhì)子氧化生成GSSG(如圖1所示)，從而產(chǎn)生氧化電流響應(yīng)，可基于產(chǎn)生的氧化電流定量檢測(cè)GSH。

間接法是基于其他化學(xué)物質(zhì)的電信號(hào)來(lái)間接定量GSH。電子介體具有良好的電化學(xué)活性，已報(bào)道基于電子介體間接檢測(cè)GSH方法原理如圖1所示[10]，電子介體M首先在電極表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移生成氧化型電子介體Mox，Mox與GSH發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將GSH氧化為GSSG，Mox被還原為還原型的電子介體Mred，最終基于Mred在電極表面產(chǎn)生的氧化峰來(lái)間接定量GSH。研究者可根據(jù)GSH化學(xué)性質(zhì)以及電化學(xué)性質(zhì)選擇不同的電子介體來(lái)提高檢測(cè)靈敏度和選擇性。

圖2 基于電子介體間接法檢測(cè)GSH的原理示意圖[10]Fig.2 Schematic diagram of GSH detection based on the mediator[10]

除了基于電子介體間接電化學(xué)檢測(cè)GSH，已報(bào)道許多電化學(xué)檢測(cè)GSH的方法是基于GSH對(duì)多種金屬離子或金屬納米材料有著強(qiáng)的親和力而發(fā)展的[11-13]。GSH具有巰基-SH，其對(duì)Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+、Co+和金，銀，銅納米材料等都具有較強(qiáng)的親和力，而這些金屬離子如Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+等都具有電化學(xué)活性，當(dāng)向反應(yīng)體系加入GSH后，GSH可與這些金屬離子或金屬納米材料結(jié)合促使它們的電化學(xué)信號(hào)有規(guī)律發(fā)生不同程度改變，從而基于發(fā)生改變的電化學(xué)信號(hào)間接定量GSH。

綜上，電化學(xué)直接法檢測(cè)GSH是基于GSH自身的電化學(xué)信號(hào)來(lái)定量GSH；而電化學(xué)間接法檢測(cè)GSH是基于其他物質(zhì)的電化學(xué)信號(hào)來(lái)定量GSH。

2 基底電極

可用于檢測(cè)GSH的基底電極有玻碳電極、金電極，汞電極，碳糊電極和鉑電極等。基于汞電極的電化學(xué)谷胱甘肽傳感器基于汞表面氧化形成汞-硫醇復(fù)合物來(lái)檢測(cè)GSH，這一電化學(xué)行為發(fā)生在電位+0.1 V，較低的氧化電位可促使GSH檢測(cè)免受其他生理活性物質(zhì)如其他氨基酸，葡萄糖，抗壞血酸以及尿酸的干擾。但是汞電極具有毒性，隨著檢測(cè)時(shí)間增長(zhǎng)，GSH電化學(xué)響應(yīng)減慢，電化學(xué)行為具有不穩(wěn)定性，重現(xiàn)性差。相似的情況也見(jiàn)于其他金屬電極如金電極和鉑電極，在鉑和金工作電極上形成的表面氧化物促進(jìn)了GSH的氧化，但是由于硫化物沉積在金屬電極表面，使電極鈍化，隨著檢測(cè)時(shí)間增長(zhǎng)，電子傳遞減慢，過(guò)電位不斷增大，使得分析應(yīng)用變得非常復(fù)雜。碳基電極也被多次使用在GSH檢測(cè)中，例如玻碳電極GC具有廣泛的工作電位范圍，其較高的化學(xué)惰性為檢測(cè)提供了高準(zhǔn)確性，在電化學(xué)分析中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在GC電極上，GSH在電位約+1.0 V時(shí)才會(huì)氧化為GSSG，如此高的氧化電位說(shuō)明GSH在GC電極上電子傳遞率低，過(guò)電位大，以及易受其他生理活性物質(zhì)的干擾，這些缺點(diǎn)使得直接利用裸GC電極檢測(cè)GSH受到了限制。為了加快GSH在電極表面的電子傳遞速率，減小過(guò)電位，防止檢測(cè)過(guò)程中電極的鈍化，在基底電極表面進(jìn)行納米材料和電子介體的修飾已被多次應(yīng)用于電化學(xué)GSH傳感器的設(shè)計(jì)。 通過(guò)在電極表面修飾納米材料和固定多種氧化還原活性物質(zhì)，可以加快電子在GSH和電極之間的傳遞，降低過(guò)電位，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性，也避免了基底電極在GSH檢測(cè)過(guò)程表面發(fā)生污染而鈍化。

3 納米材料在GSH電化學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

由于裸電極用于電化學(xué)檢測(cè)靈敏度低、重現(xiàn)性差、電子轉(zhuǎn)移慢以及高過(guò)電位，所以對(duì)電極的修飾變得十分必要。21世紀(jì)以來(lái)，納米技術(shù)的迅速發(fā)展為電分析化學(xué)帶來(lái)了新的輸入。納米材料是尺寸在1～100 nm之間的分子，這種尺寸賦予了納米材料獨(dú)特的性質(zhì)，如表面界面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)等。將各種納米材料修飾在工作電極表面，可以獲得穩(wěn)定性好、選擇性高、響應(yīng)靈敏的傳感界面，從而提升分析性能。由于納米材料的優(yōu)良性能，推動(dòng)了其在電化學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展，同時(shí)也拓寬了電活性差的物質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)，如金屬納米材料包括納米金，納米銀，金簇，銅簇，碳納米管和石墨烯等納米材料均被用于GSH的電化學(xué)檢測(cè)。

碳納米管包括單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)，良好的導(dǎo)電性質(zhì)和高的比表面積，已被多次應(yīng)用于GSH 的檢測(cè)中。在基底電極上修飾碳納米管可加快GSH與電極表面的電子轉(zhuǎn)移，大大降低過(guò)電位。比如GSH在SWCNTs/GC 電極的氧化峰電位位于+0.55 V，比起在裸GC電極+1.0 V降低了0.45 V，經(jīng)過(guò)SWCNTs修飾的GC電極可用于多次檢測(cè)GSH，檢測(cè)靈敏度不會(huì)出現(xiàn)因電極污染鈍化而下降。Gong等[14]采用在硅酸鹽凝膠中摻雜MWCNTs制備陶瓷-碳納米管復(fù)合電極(CCNNEs)測(cè)定GSH，這種溶膠-凝膠技術(shù)所制備的電極所表示出的電化學(xué)行為具有可調(diào)節(jié)性，這取決于分散在二氧化硅溶膠MWCNTs的數(shù)量，當(dāng)摻入高含量的MWNTs(高于1.5 mg/mL)，將該材料修飾于GC電極表面可使電極表現(xiàn)出常規(guī)尺寸電極的循環(huán)伏安圖；當(dāng)摻入低含量的MWCNTs(低于0.1 mg/mL)，該材料可使電極表現(xiàn)出微電極的循環(huán)伏安圖，且對(duì)GSH的氧化具有顯著的電催化效果。石墨烯(GR)包括還原型石墨烯(rGO)和氧化型石墨烯(GO)也是一種具有良好電化學(xué)催化性能的碳材料，被多次應(yīng)用于電化學(xué)檢測(cè)GSH。Yuan等[15]比較了在不同還原電位下還原后得到的GO/GC電極上GSH的電化學(xué)行為，結(jié)果表明，在電位-0.75 V還原的GO具有對(duì)GSH的氧化具有最好的電催化效果，可使GSH的氧化發(fā)生在+0.3 V，他們認(rèn)為是GO邊緣的羧基和羰基發(fā)揮的電催化作用。

綜上，經(jīng)納米材料修飾的基底電極可以減小過(guò)電位，提高靈敏度，和降低檢測(cè)限。隨著材料科學(xué)的發(fā)展，更多納米材料用于修飾基底電極，來(lái)達(dá)到提高檢測(cè)靈敏度的目的，但加入修飾材料可同時(shí)提高待測(cè)物和干擾物的靈敏度，對(duì)待測(cè)物選擇性仍較低。

4 電子介體在GSH電化學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

除了納米材料，電子介體也常被修飾于電極表面提高檢測(cè)的靈敏度和改善方法的選擇性。電子介體一般是分子量較小，在待測(cè)物和電極之間傳遞電子，促使待測(cè)物更易在電極表面發(fā)生氧化還原?；诖郎y(cè)物化學(xué)性質(zhì)以及電化學(xué)性質(zhì)的差異，可選擇不同的電子介體。一般來(lái)說(shuō)在選擇電子介體時(shí)，首先，所選物質(zhì)應(yīng)具有良好的電化學(xué)活性即與電極表面?zhèn)鬟f電子速度快；其次，該物質(zhì)對(duì)待測(cè)物具有良好的電催化作用。已報(bào)到的電化學(xué)檢測(cè)GSH的電子介體包括二茂鐵，金屬卟啉配合物，金屬聯(lián)吡啶衍生物，7,7,8,8-四氰基對(duì)苯二醌二甲烷，乙酰氨基酚，鄰苯二酚及其衍生物(包括鄰苯二酚，多巴胺，咖啡酸，去甲腎上腺素等)等[18-24]。

鄰苯二酚及其衍生物已被多次作為還原型硫醇包括GSH的電子介體，總結(jié)多個(gè)研究報(bào)道可得出以下兩種反應(yīng)機(jī)制：第一種電化學(xué)催化氧化反應(yīng)機(jī)制(如圖3A所示)。在這種機(jī)制中，鄰苯二酚及其衍生物僅作為電子介體，催化還原型小分子硫醇在電極表面電化學(xué)氧化，從而表現(xiàn)出催化氧化峰增大，還原峰減小的循環(huán)伏安圖。第二種為ECE反應(yīng)機(jī)制[22](如圖3B所示)，即電子介體鄰苯二酚及其衍生物A首先在電極表面發(fā)生電化學(xué)氧化產(chǎn)生鄰苯醌類物質(zhì)B，還原型小分子硫醇的巰基-SH具有較強(qiáng)的親核性，從而進(jìn)攻鄰苯醌類物質(zhì)B發(fā)生親核取代反應(yīng)，產(chǎn)生一巰基取代產(chǎn)物C；C在電極表面進(jìn)一步發(fā)生電化學(xué)氧化產(chǎn)生D，D可接受還原型小分子硫醇分子的-SH再一次進(jìn)攻產(chǎn)生二巰基取代產(chǎn)物E；E可在電極表面發(fā)生電化學(xué)氧化產(chǎn)生F。而一巰基取代產(chǎn)物C和二巰基取代產(chǎn)物E發(fā)生電化學(xué)氧化的電位與電子介體鄰苯二酚及其衍生物A不同，即在循環(huán)伏安圖可找到新峰的出現(xiàn)，從而可根據(jù)新峰的電流值定量還原型硫醇。McCarley等認(rèn)為GSH發(fā)生第二種ECE反應(yīng)機(jī)制，而與GSH結(jié)構(gòu)相似的半胱氨酸和同型半胱氨酸一般發(fā)生第一種反應(yīng)機(jī)制，所以很多報(bào)道均是基于GSH與鄰苯二酚及其衍生物反應(yīng)生成的新峰來(lái)定量GSH。我們組[23]正是基于鄰苯二酚-GSH取代產(chǎn)物的形成，并基于該產(chǎn)物的氧化峰間接定量GSH，新峰處于-0.16 V，比起GSH本身的氧化峰電位0.60 V和鄰苯二酚的氧化峰電位0.20 V更負(fù)，在該電位處其他硫醇和其他生理活性物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)幾乎對(duì)GSH檢測(cè)沒(méi)有干擾。這項(xiàng)工作提供了一種具有高選擇性的GSH檢測(cè)方法，可用于阿霉素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡后胞內(nèi)泄漏出的GSH含量的測(cè)定。

圖3 電化學(xué)催化氧化反應(yīng)機(jī)制(A)；生物硫醇與鄰苯二酚及其衍生物在電極表面發(fā)生ECE反應(yīng)機(jī)制(B)[22]Fig.3 Electrochemical catalytic oxidation reaction mechanism (A)；the ECE reaction mechanism of biothiols based on catechol and its derivatives as the mediators on the electrode surface (B)[22]

除了鄰苯二酚類及其衍生物外，還有別的電子介體應(yīng)用于GSH的檢測(cè)中。Yuan等[20]報(bào)道了一種基于7,7,8,8-四氰基喹啉二甲烷(TCNQ)和石墨烯rGO修飾的玻碳電極來(lái)檢測(cè)GSH，TCNQ為電子介體，rGO/GC為工作電極。經(jīng)TCNQ/rGO修飾后的玻碳電極電極在-50 mV就可以檢測(cè)GSH，降低了GSH的氧化過(guò)電位，且具有寬的線性范圍和低的檢測(cè)限，已成功應(yīng)用于眼藥水中GSH的檢測(cè)。

綜上，利用新型納米材料優(yōu)越的電導(dǎo)性，和電催化能力可增加檢測(cè)的靈敏度；而選擇合適的電子介體可改進(jìn)電化學(xué)檢測(cè)GSH選擇性，所以有多個(gè)將納米材料和電子介體相結(jié)合的報(bào)道用于GSH的檢測(cè)。

5 結(jié) 語(yǔ)

鑒于還原型谷胱甘肽GSH重要的生理和病理作用，準(zhǔn)確，快速檢測(cè)生物體內(nèi)GSH的含量至關(guān)重要。本文從基底電極，納米材料，電子介體方面深入分析了基于電化學(xué)技術(shù)發(fā)展的GSH測(cè)定方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)。通過(guò)篩選基底電極，結(jié)合納米材料和電子介體提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性。考慮到當(dāng)今分析化學(xué)的需求，仍需將所建立的電化學(xué)方法應(yīng)用于臨床檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)分析，所以電極微型化，發(fā)展一次性檢測(cè)電極是今后的發(fā)展趨勢(shì)。但是面臨的問(wèn)題是：對(duì)于發(fā)展低成本的微電極和一次性電極，電極表面太復(fù)雜的修飾方法必然不適用；太昂貴的修飾材料和修飾方法也會(huì)被遺棄；此外需要將所建立的電化學(xué)方法從常規(guī)電極轉(zhuǎn)移應(yīng)用于微型和一次性電極，電極的修飾變得復(fù)雜，甚至相同的方法和相同的修飾材料用于微電極，與常規(guī)電極相比，會(huì)出現(xiàn)靈敏度降低甚至不同的電化學(xué)行為。這需要研究者進(jìn)一步去探究解決，摸索出適合微型電化學(xué)檢測(cè)設(shè)備的電極修飾材料和修飾方法，在保證修飾材料的高催化活性和高選擇性，以及檢測(cè)準(zhǔn)確性的同時(shí)，使檢測(cè)更簡(jiǎn)易和更便宜。