基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討半夏治療糖尿病胃輕癱的作用機(jī)制※

黃嘉家,肖雅松,葉金鑫,林 青,張榮華

(1.暨南大學(xué),廣東 廣州510632;2.廣東省中醫(yī)藥信息化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632)

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis,DGP)是一組以胃排空延遲和上消化道癥狀為特征的綜合征,為糖尿病主要并發(fā)癥之一,臨床表現(xiàn)為腹脹、惡心、嘔吐等。目前糖尿病患者中DGP發(fā)病率已高達(dá)60%,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-3]。中醫(yī)認(rèn)為,DGP屬“消渴”“痞滿”“嘔吐”范疇,病機(jī)多為脾胃虛弱、氣機(jī)阻滯、痰濕水飲停聚,故多治以健脾和胃、行氣化痰[4]。理氣化痰類中藥具有理氣止嘔、化痰消痞等功效,為治療DGP的重要切入點(diǎn)。

半夏為天南星科植物半夏[PinelliaeRhizoma(Thunb.)Breit.]的干燥塊莖,具有燥濕化痰、散結(jié)消痞、降逆止嘔之效。半夏是半夏瀉心湯、小半夏湯與半夏厚樸湯等諸多治療DGP常用方劑的君藥,眾多學(xué)者采用系統(tǒng)聚類分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則、因子分析等方法研究古今臨床治療DGP的用藥規(guī)律,發(fā)現(xiàn)半夏為臨床治療DGP應(yīng)用較多的藥物之一[5-8]?？梢?半夏是中藥治療DGP的重要組成藥物?，F(xiàn)代研究顯示,半夏具有止嘔、抗?jié)?、抗炎、調(diào)節(jié)胃腸功能等作用,既可通過中樞性抑制和激活迷走神經(jīng)以止嘔,還可通過抑制胃酸分泌和胃蛋白酶活性以減緩胃腸道反應(yīng)[9-12]。然而,半夏治療DGP的具體作用機(jī)制尚未深入探討,有待進(jìn)一步研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是預(yù)測、評估藥物治療疾病作用機(jī)制的有效方法,分子對接技術(shù)可進(jìn)一步為藥物靶點(diǎn)研究提供技術(shù)支持。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討半夏治療DGP的物質(zhì)基礎(chǔ)及網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 半夏活性成分的篩選與靶點(diǎn)預(yù)測 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索半夏的化學(xué)成分,以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為參數(shù),篩選半夏的活性成分及其對應(yīng)的靶點(diǎn)基因;利用PubChem數(shù)據(jù)庫下載活性成分SDF格式文件,輸入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中預(yù)測其靶點(diǎn)基因。整合TCMSP與SwissTargetPrediction預(yù)測的靶點(diǎn)基因,去重,獲得半夏活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2 DGP相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在Genecards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)及NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中分別以“Diabetic gastroparesis”或“Delayed gastric emptying”為關(guān)鍵詞,篩選DPG相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 半夏活性成分-DGP交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Venny 2.1在線軟件獲取半夏活性成分靶點(diǎn)與DGP相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn);借助Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“半夏活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。計(jì)算各節(jié)點(diǎn)連接數(shù),評估網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的相互聯(lián)系程度。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?基于Cytoscape 3.8.0的BisoGenet 3.0插件中的DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、NINT、BIND數(shù)據(jù)庫,定義參數(shù)為“Homosapiens”,對1.3獲得的交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。借助Cytoscape 3.8.0的CytoNCA插件,對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?以節(jié)點(diǎn)的度中心性(DC)、介數(shù)中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、局部平均中心性(LAC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)6個(gè)參數(shù)作為參考標(biāo)準(zhǔn),篩選DC值排名前50的靶點(diǎn),再依據(jù)DC、BC、CC、EC、NC、LAC參數(shù)篩選PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG富集分析 將1.4得到的核心靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.8.0中的ClueGO插件中,進(jìn)行基因本體(GO)功能富集和京都基因組與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析(P<0.05,FDR<0.05),構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-KEGG信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接 選取高DC值的核心靶點(diǎn)和活性成分,分別作為對接蛋白和對接配體,同時(shí)以臨床上常用于治療DGP的藥物西沙必利作為陽性對照配體。其中,對接蛋白3D結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載,去除原配體;活性成分和陽性對照配體的mol2文件從ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc15.docking.org/)下載,利用Autodock 4.2軟件進(jìn)行分子對接,并用PyMOL 2.4軟件將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 半夏有效成分與DGP相關(guān)靶點(diǎn)篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得半夏的13個(gè)活性成分,見表1。整合TCMSP與SwissTargetPrediction獲得半夏活性成分靶點(diǎn)基因共461個(gè)。從Genecards、TTD、NCBI數(shù)據(jù)庫分別得到與DGP相關(guān)靶點(diǎn)429、5、19個(gè),合并與刪除重復(fù)項(xiàng)后得到388個(gè)。將半夏活性成分靶點(diǎn)與DGP相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集,獲得68個(gè)交集靶點(diǎn),見圖1。

圖1 半夏-糖尿病胃輕癱潛在靶點(diǎn)韋恩圖

表1 半夏活性成分

2.2 “半夏活性成分-交集靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 “半夏活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖如圖2所示,相互作用關(guān)系包括81個(gè)節(jié)點(diǎn)和165條邊。13個(gè)活性成分的DC值中位數(shù)為11,預(yù)示半夏多數(shù)活性成分可作用于多個(gè)DGP相關(guān)靶點(diǎn)。其中DC值較高的活性成分為MOL002714(黃芩素)、MOL006957[環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)]和MOL000358(β-谷甾醇)。

圖2 “半夏活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖如圖3A所示,PPI網(wǎng)絡(luò)包含4 711個(gè)節(jié)點(diǎn)和115 417條邊。利用Cytoscape 3.8.0的插件CytoNCA,對PPI網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)DC、BC、CC、EC、NC、LAC值進(jìn)行計(jì)算,篩選獲得327個(gè)節(jié)點(diǎn)構(gòu)成的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖3B、3C)(圖3見本期第125頁)。

注：A為交集靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖;B為經(jīng)度中心性(DC)>7初步篩選后的PPI網(wǎng)絡(luò)圖;C為核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,其中紅色部分為半夏與DGP的交集靶點(diǎn)。

2.4 GO和KEGG富集結(jié)果 對PPI核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析共得到2 324個(gè)條目,其中細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)、生物途徑(BP)分別有239、224、1 861個(gè)條目。如圖4所示,核心靶點(diǎn)的CC主要與黏著斑、細(xì)胞-基質(zhì)黏附連接、細(xì)胞-基質(zhì)連接等作用相關(guān),MF主要與泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素-類蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合等作用相關(guān),BP主要有mRNA分解代謝過程、RNA分解代謝過程、細(xì)胞周期調(diào)控等。核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析得到148條信號通路,包括細(xì)胞周期、甲狀腺激素信號通路和低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路等,見圖4。KEGG通路富集分析結(jié)果中排名前20條通路的核心靶點(diǎn)有157個(gè),其中12個(gè)是半夏活性成分靶點(diǎn)和DGP疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn),根據(jù)其在KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中的DC值排序?yàn)榻z裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、蛋白激酶1(AKT1)、JUN原癌基因(JUN)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT3)、絲裂原活化酶2(CDK2)、非受體酪氨酸激酶(SRC)、人表皮生長因子受體(EGFR)、缺氧誘導(dǎo)因子-1A(HIF1A)、雌激素受體(AR)、環(huán)狀素受體1(ESR1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶6(AURKA),見圖5。

注：圖A、B、C分別為基因本體(GO)功能富集分析的生物途徑(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)結(jié)果;圖D為京都基因組與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析結(jié)果。

注：三角形代表京都基因組與基因組百科全書(KEGG)通路富集信號通路;方形代表核心靶點(diǎn)。

2.5 分子對接結(jié)果 選擇MAPK1、AKT1為對接蛋白,黃芩素和環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)為對接配體,另外選擇西沙必利為陽性對照配體。對接蛋白與對接配體的結(jié)合能越低,代表形成的分子對接結(jié)構(gòu)結(jié)合活性越強(qiáng)。分子對接結(jié)果模式如圖6所示,兩個(gè)活性成分和陽性對照配體與核心蛋白MAPK1、AKT1均有良好的親和力,除環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與AKT1外,其他結(jié)合模式均能通過氫鍵結(jié)合。

注：圖A、B、C分別代表黃芩素、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)、西沙必利與絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的對接情況;圖D、E、F分別代表黃芩素、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)、西沙必利與蛋白激酶1(AKT1)的對接情況。

黃芩素和環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與MAPK1的結(jié)合能均低于陽性對照配體西沙必利,其中環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與MAPK1結(jié)合能更低,提示環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與MAPK1有更強(qiáng)的結(jié)合活性;黃芩素和環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與AKT1的結(jié)合能均低于陽性對照配體西沙必利,其中黃芩素和AKT1的結(jié)合能更低,提示黃芩素與AKT1有更強(qiáng)的結(jié)合活性。分子對接結(jié)合能見表2。

表2 半夏關(guān)鍵有效成分和核心靶點(diǎn)蛋白的分子對接結(jié)合能(kcal/mol)

3 討論

DGP癥見嘔吐、腹脹、噯氣、惡心等,屬中醫(yī)“消渴”“痞滿”“嘔吐”等范疇,病機(jī)為消渴日久,氣血虧虛,使脾胃運(yùn)化無力,氣機(jī)升降失調(diào),以致胃氣上逆,氣滯痰阻。臨床治療DGP多采用調(diào)和脾胃、消痞化痰、健脾益氣之和、消、補(bǔ)法[6]。半夏具有化痰止嘔、散結(jié)消痞之功,兼具和、消、補(bǔ)之效,為臨床治療DGP的常用中藥[5-6]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)從多成分、多靶點(diǎn)、多通路的網(wǎng)絡(luò)角度探究半夏治療DGP的作用機(jī)制。

本研究共篩選出與DGP相關(guān)的活性成分13個(gè),其中黃芩素、β-谷甾醇、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)的靶點(diǎn)連接度較高,在半夏治療DGP中發(fā)揮主要作用。研究發(fā)現(xiàn),黃芩素對糖尿病有一定治療作用。LI Y K等[13]應(yīng)用黃芩素干預(yù)鏈脲霉素誘導(dǎo)的胰島素缺乏糖尿病大鼠,發(fā)現(xiàn)黃芩素能降低糖尿病大鼠空腹血糖、隨機(jī)血糖和血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量;黃芩素還可通過降低皮質(zhì)中脂氧合酶的表達(dá),影響p38 MAPK及其磷酸化酶的合成,抑制p38 MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用,減少部分糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。黃芩素還具有類固醇激素作用,可通過介導(dǎo)α2-腎上腺素受體、前列腺素和三磷酸腺苷(ATP)敏感性鉀通道,減少Cajal間質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng),激活Cajal間質(zhì)細(xì)胞的抗氧化過程,增加黏液分泌,發(fā)揮胃保護(hù)作用[14-15]。環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)為半夏特有成分,是一種哌嗪二酮類化合物,是治療糖尿病胃輕癱的潛在化合物,然其相關(guān)研究甚少,值得進(jìn)一步探究。β-谷甾醇可通過提高血清中一氧化氮含量,提高受損胃黏膜的修復(fù)能力;通過降低內(nèi)皮素1水平,發(fā)揮抗胃潰瘍作用[16-17]。因此,半夏發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)與黃芩素、β-谷甾醇等有效成分密切相關(guān)。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,MAPK1、AKT1及JUN等是半夏治療DGP的重要靶點(diǎn)。MAPK1是一種線粒體活化蛋白激酶,是胰島素信號通路的關(guān)鍵因子之一,與葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝密切相關(guān),在胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用[18-19]。MAPK是成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)下游的關(guān)鍵激酶,可通過磷酸化靶蛋白抑制肝臟對糖的輸出,增加飽腹感并抑制糖分?jǐn)z入,起控制血糖的作用[20-21]。研究顯示,p38/MAPK的激活可促進(jìn)雌激素受體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,并與雌激素反應(yīng)元件結(jié)合,維持機(jī)體胃排空功能[22]。AKT參與細(xì)胞的凋亡、周期進(jìn)展及葡萄糖和脂質(zhì)代謝等過程,與DGP的發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示,AKT可通過抑制叉頭框蛋白O1(FoxO1)的表達(dá),刺激己糖激酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸鈉鹽,從而降低血糖水平[23]。AKT與p-AKT蛋白含量的高低影響胃排空率和小腸推進(jìn)率,與胃腸激素的調(diào)節(jié)、胃腸動(dòng)力密切相關(guān)[24-25]。研究顯示,AKT的磷酸化可降低鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞的丟失,抑制Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9的表達(dá)及胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞的凋亡[26-27]。因此,MAPK1、AKT1等靶點(diǎn)與DGP密切相關(guān),為半夏發(fā)揮抗DGP的重要靶點(diǎn)。

KEGG通路富集分析結(jié)果亦顯示,甲狀腺激素信號通路和HIF-1信號通路可能為半夏治療DGP的關(guān)鍵通路。研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺激素可激活胰島素信號通路的上游因子胰島素受體底物-1(IRS-1),降低2型糖尿病模型小鼠血糖水平,提高糖尿病小鼠胰島素敏感性和血漿胰島素水平[28]。此外,甲狀腺激素可通過直接作用于胃腸道平滑肌及兒茶酚胺刺激胃腸道運(yùn)動(dòng)[29]。鐘鳳等[30]研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺內(nèi)有胃動(dòng)素免疫陽性細(xì)胞,胃動(dòng)素與降鈣素共存并表達(dá)于甲狀腺C細(xì)胞。HIF可通過控制糖酵解限速步驟誘導(dǎo)細(xì)胞糖酵解[31]。研究顯示,HIF-1α在DGP大鼠胃黏膜中表達(dá)增加,可提高1型糖尿病大鼠胃黏膜血管的通透性,是調(diào)控DGP胃排空延遲的關(guān)鍵因子[32]。因此,半夏可能通過甲狀腺激素和HIF-1等信號通路,調(diào)控血糖、促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)、逆轉(zhuǎn)胃排空延遲、增加胃黏膜血管的通透性等發(fā)揮抗DGP的作用。

本研究初步推測半夏主要通過黃芩素、β-谷甾醇、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)等活性成分發(fā)揮調(diào)控血糖、促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)、逆轉(zhuǎn)胃排空延遲等作用,從而達(dá)到治療DGP的目的。分子對接結(jié)果提示,黃芩素、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)可與MAPK1和AKT1結(jié)合,調(diào)控HIF-1信號通路和甲狀腺激素信號通路,這可能為半夏防治DGP的重要機(jī)制,值得進(jìn)一步探索。

中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是一個(gè)由多種成分構(gòu)成的藥效組分群,可通過網(wǎng)絡(luò)交叉產(chǎn)生整體的藥效作用,與以整體性、系統(tǒng)性為研究特色的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不謀而合。在廣泛的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中,中藥活性成分主要按OB≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,并驗(yàn)證了許多具有藥效作用的成分及其相關(guān)作用機(jī)制。然而,該篩選方法也存在弊端,如不同性狀的中藥在機(jī)體不同的生理病理狀態(tài)下,吸收、分布、代謝及排泄的過程是不完全相同的。因此,基于血清代謝組學(xué)等方法研究中藥在患者或疾病模型動(dòng)物中的有效成分及代謝產(chǎn)物,并基于這些吸收、代謝成分開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究更符合藥理學(xué)研究。半夏的主要成分包括生物堿類、有機(jī)酸類、蛋白質(zhì)類、核苷類、氨基酸類、揮發(fā)油類、甾醇類及蛋白質(zhì)類等,但其相關(guān)特異性藥效成分在體內(nèi)的代謝過程,以及相關(guān)作用機(jī)制研究甚少,以單味中藥治療DGP的研究尚未見報(bào)道[33]。半夏是臨床防治DGP的重要中藥,但其作用機(jī)制仍未具體研究。因此,本研究仍基于廣泛應(yīng)用的活性成分篩選方法,基于現(xiàn)有的半夏化學(xué)成分進(jìn)行初步篩選,以期初步探索半夏治療DGP的潛在作用機(jī)制,為進(jìn)一步的研究提供參考。