響應(yīng)面法優(yōu)化蛋殼膜中硫酸軟骨素提取工藝

劉恒洋，尹玉鑫，郭曉徐，宋紹奇，劉美玉

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2.邯鄲市天然產(chǎn)物與功能性食品開(kāi)發(fā)重點(diǎn)室驗(yàn)室，河北邯鄲 056038）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，禽蛋產(chǎn)品在世界范圍內(nèi)的消費(fèi)量也不斷增多，大量廢棄蛋殼隨之產(chǎn)出，從而造成了極大的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[1]，事實(shí)上，蛋殼中含有大量可利用資源，其中含有的鈣類物質(zhì)、活性肽、蛋白質(zhì)等成分，具有很高的利用價(jià)值[2]。近年來(lái)，對(duì)于廢棄雞蛋殼的研究逐漸加深，人們逐漸重視對(duì)此資源的開(kāi)發(fā)與利用[3]，此項(xiàng)研究的開(kāi)展不但能改善日益嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，而且變廢為寶，提高了雞蛋的附加值，推動(dòng)了雞蛋殼深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，可謂一舉兩得。

硫酸軟骨素呈白色粉末，無(wú)臭、有引濕性、遇水有粘黏性，廣泛存在于動(dòng)物組織、細(xì)胞表面與細(xì)胞基質(zhì)之間[4]。硫酸軟骨素的用途廣泛，可作為膳食保護(hù)劑，起到保護(hù)關(guān)節(jié)等軟骨組織的效果，可以很好地緩解關(guān)節(jié)不適等癥狀，治療骨關(guān)節(jié)炎等疾病。同時(shí)，硫酸軟骨素具有抗凝血、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等功能，因此硫酸軟骨素被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品等行業(yè)中。近年來(lái)，對(duì)于硫酸軟骨素的需求量不斷增加[5-7]，以硫酸軟骨素作為研究對(duì)象的產(chǎn)品市場(chǎng)前景廣闊。

目前，我國(guó)硫酸軟骨素主要提取工藝為從動(dòng)物軟骨組織中進(jìn)行提取，通過(guò)高溫蒸煮的辦法，使動(dòng)物結(jié)締組織破壞，通過(guò)堿解法或酶解法從中進(jìn)行硫酸軟骨素的提取，也可以通過(guò)微生物發(fā)酵進(jìn)行硫酸軟骨素的提取。除此之外，硫酸軟骨素也可以從蛋殼膜中進(jìn)行提取，相比與從動(dòng)物軟骨組織中提取，蛋殼膜中提取硫酸軟骨素不僅可以有效地利用我國(guó)的蛋殼資源，達(dá)到真正意義上的廢物利用，蛋殼膜獲取方式簡(jiǎn)單，且原材料產(chǎn)量極大，也能直接增加硫酸軟骨素的產(chǎn)量。目前，從蛋殼中提取硫酸軟骨素的方法很多，常見(jiàn)的方法有堿提取法、堿酶法、堿鹽法。這些工藝提取的硫酸軟骨素，在提取率上相差不大。劉濤等人[8]通過(guò)堿鹽法從蛋殼膜中提取硫酸軟骨素，提取率為74%。劉寧等人[9]通過(guò)酶提取法硫酸軟骨素，利用木瓜蛋白酶水解蛋殼質(zhì)的性質(zhì)，將硫酸軟骨素從糖蛋白中分離出來(lái)，從而進(jìn)行硫酸軟骨素的提取，該工藝的提取率為75.31%，略高于堿鹽法提取率。劉國(guó)慶等人[10]利用稀堿法處理蛋殼膜，并通過(guò)雙酶法進(jìn)行提取，采用胰蛋白酶和胃蛋白酶相結(jié)合的提取工藝，該工藝下硫酸軟骨素的提取率為76%。對(duì)比其他提取工藝，堿鹽法提取硫酸軟骨素工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，且提取率并不低，與酶法提取硫酸軟骨素相比，在提取成本上要大大減少，較適合批量生產(chǎn)使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋殼，收集于河北省邯鄲市美食林工業(yè)園；氯化鈉、氯化鈣、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖標(biāo)品、碳酸鈣、無(wú)水碳酸鈉等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；80 目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩，浙江上虞市道墟張興紗篩廠產(chǎn)品；搖擺式中藥粉碎機(jī)，新昌縣德科機(jī)械有限公司產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博珍儀器設(shè)備制造廠產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，廣東佛衡儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 硫酸軟骨素提取率測(cè)定方法

（1） 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。用電子天平準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg，將稱取好的葡萄糖加入到的蒸餾水中，裝入到500 mL 的容量瓶中，用膠頭滴管滴至刻度線，定容搖勻好備用。采用移液槍分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液至試管中，并用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL。依次加入苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL。另做一個(gè)2 mL 的蒸餾水重復(fù)上述顯色操作做空白對(duì)照試驗(yàn)；將上述制得結(jié)束試管進(jìn)行搖勻，靜置30 min后，放入紫外分光光度儀中，于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)得吸光度。以多糖質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2） 硫酸軟骨素含量測(cè)定。采用移液槍定量吸取250 μL 待測(cè)液體，用蒸餾水補(bǔ)至2 mL，加入1 mL 的苯酚及5 mL 的濃硫酸，并進(jìn)行充分搖勻，將其靜置30 min，移至紫外分光光度儀中，于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)其吸光度，將所測(cè)得的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，通過(guò)換算便可得到硫酸軟骨素的含量。

（3） 硫酸軟骨素提取率的計(jì)算。

式中：W——硫酸軟骨素的提取率，%；

C——將待測(cè)樣品代入吸光值中測(cè)得的多糖含量，g；

V1——定容液體的體積，mL；

V2——測(cè)量時(shí)所取液體的體積，mL；

M——蛋殼膜中總糖含量，g。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

定量稱取1 g 蛋殼膜（精確到0.01 g）。在多組預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取料液比、提取溫度、堿鹽比、提取時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。探究不同因素對(duì)蛋殼膜中硫酸軟骨素提取率的影響。先設(shè)置料液比為1∶13，反應(yīng)溫度為50 ℃，堿鹽比為3∶1，反應(yīng)時(shí)間為5 h 作為每個(gè)因素除自身外的固定值，再設(shè)計(jì)料液比、反應(yīng)溫度、堿鹽比和反應(yīng)時(shí)間。

單因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 單因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，將料液比、反應(yīng)溫度、堿液濃度、反應(yīng)時(shí)間4 個(gè)影響因素較大的因子，利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化從蛋殼膜中提取透明質(zhì)酸的最佳工藝參數(shù)，以透明質(zhì)酸的提取量作為參考指標(biāo)進(jìn)行分析。

響應(yīng)面分析因子水平編碼見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析因子水平編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同料液比對(duì)硫酸軟骨素脫鈣率的影響

暫定堿鹽比為3∶1，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為6 h，探究不同料液比對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響。

料液比對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響

由圖1 可知，在料液比為1∶13～1∶15 時(shí)，隨著料液比的上漲，硫酸軟骨素的提取率也在不斷升高；在料液比為1∶15 時(shí)，硫酸軟骨素的提取率達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)的提取率為46%，因?yàn)殡S著料液比的增加，蛋殼膜中的水分也不斷增多，堿試劑與鹽試劑對(duì)蛋殼膜的接觸面積增大，從而加速了硫酸軟骨素的提??；料液比為大于1∶15，硫酸軟骨素的提取率趨勢(shì)趨于平緩，并無(wú)顯著的提升，分析其原因，1∶15 的料液比基本可使蛋殼膜中的硫酸軟骨素的提取進(jìn)行反應(yīng)完全，因此料液比為1∶15 之后，再次提高料液比對(duì)硫酸軟骨素的提取率影響不大。綜合考慮，選擇最佳料液比為1∶15 即可滿足試驗(yàn)需要。

2.1.2 不同提取溫度對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響

固定料液為1∶15，暫定堿鹽比為3∶1，提取時(shí)間為6 h，探究不同提取溫度對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響。

提取溫度對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響

由圖2 可知，隨著提取溫度從30 ℃升高到60 ℃，硫酸軟骨素的提取率也隨著溫度的升高而增長(zhǎng)，在提取溫度為60 ℃時(shí)，此時(shí)硫酸軟骨素的提取率達(dá)到最高，為46.5%。因?yàn)殡S著溫度的提升，溶液中的反應(yīng)速率也在加快；提取溫度為60 ℃為最佳反應(yīng)溫度，此時(shí)硫酸軟骨素的提取率最高；提取溫度60 ℃之后，再次升高溫度，硫酸軟骨素的提取率趨于平緩，并略有降低態(tài)勢(shì)。這是由于過(guò)高的提取溫度可能會(huì)導(dǎo)致蛋殼膜的性質(zhì)發(fā)生變化，從而不利于硫酸軟骨素的提取。綜合考慮，選擇提取溫度為60 ℃作為蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的最佳溫度。

2.1.3 不同堿鹽比對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響

固定料液比為1∶15，提取溫度為60 ℃，暫定反應(yīng)時(shí)間為6 h，探究不同堿鹽比對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響。

堿鹽比對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 堿鹽比對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響

由圖3 可知，隨著堿鹽比的升高，硫酸軟骨素的提取率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。堿鹽比從4∶1增加到6：1，硫酸軟骨素的提取率逐漸升高，在堿鹽比為6∶1 時(shí)硫酸軟骨素提取率達(dá)到最高值為53.5%，因?yàn)檫m當(dāng)?shù)奶岣邏A濃度會(huì)促進(jìn)堿解的迅速進(jìn)行，加速硫酸軟骨素的提取；當(dāng)堿鹽比達(dá)到7∶1后，硫酸軟骨素的提取率升高不顯著，且有降低的趨勢(shì)，過(guò)高的堿鹽比的加入，會(huì)對(duì)蛋殼膜造成一定程度的破壞，導(dǎo)致蛋殼膜的性質(zhì)發(fā)生變化，從而影響硫酸軟骨素的提取。綜合考慮，選擇堿鹽比6∶1為最佳堿鹽比。

2.1.4 不同提取時(shí)間對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響

固定料液比為1∶15，提取溫度60 ℃，堿鹽比為6∶1，探究不同提取時(shí)間對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響。

提取時(shí)間對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響

由圖4 可知，隨著提取時(shí)間的增加，硫酸軟骨素的提取率呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)，提取時(shí)間從2 h 延長(zhǎng)到8 h 的階段，硫酸軟骨素的提取率顯著提高，在提取時(shí)間為8 h 時(shí)，此時(shí)的提取率基本達(dá)到最高，為56.5%。分析其原因，適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間會(huì)使蛋殼膜中的硫酸軟骨素堿解更為完全，因此硫酸軟骨素的含量也是顯著提升，8 h 基本上可以使其完全提取，此時(shí)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)硫酸軟骨素的提取率影響不大，且過(guò)長(zhǎng)的提取時(shí)間有可能會(huì)造成微生物的污染，且造成試驗(yàn)時(shí)間的浪費(fèi)。綜合考慮，確定提取時(shí)間為8 h 為硫酸軟骨素的最佳提取時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 10.0.8 響應(yīng)面軟件設(shè)計(jì)Box-behnken 試驗(yàn)，測(cè)定硫酸軟骨素提取率（Y）。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比（A），提取溫度（B），堿鹽比（C），提取時(shí)間（D） 作為響應(yīng)因素，篩選蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的最佳工藝條件，利用響應(yīng)面法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，采用Design Expert 10 設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果對(duì)蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，結(jié)果表明各因素與響應(yīng)面的二次多項(xiàng)回歸模型為：

根據(jù)p 值大小進(jìn)行判斷是否顯著，當(dāng)p＜0.05 為顯著，p＜0.01 為極顯著。

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表4 可知，蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的提取率為響應(yīng)值時(shí)，該模型p＜0.01，表示該二次項(xiàng)方程為極顯著；失擬項(xiàng)p=0.145 4＞0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，失擬項(xiàng)不顯著表示該二次項(xiàng)模型擬合較好，模型決定系數(shù)R2為0.984 3，表示該二次項(xiàng)模型可以解釋98.43%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)擬合較好，且誤差較小，R2Adj為0.968 6，兩者數(shù)值較高，且較為接近，表明模型有較好的使用性和通用性，該模型可以很好地反映響應(yīng)值硫酸軟骨素提取量的變化，可采用該模型對(duì)蛋殼膜膜中提取硫酸骨素進(jìn)行實(shí)際分析；通過(guò)變異（CV） 可以反映出模型的可信度，變異系數(shù)的值越低，表示模型的可信度越高，該試驗(yàn)的變異系數(shù)為1.58%，表示該模型較為可信。各因素對(duì)蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的影響由高到低分別是A＞D＞C＞B，即料液比＞提取時(shí)間＞堿鹽比＞提取溫度。

各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖見(jiàn)圖5。

由圖5 響應(yīng)面3D 圖可直觀描述回歸模型，等高線圖形越趨近與圓形表示2 個(gè)自變量的交互作用越弱，等高線越趨近與橢圓形表示2 個(gè)變量的交互作用越強(qiáng)。各個(gè)因素之間的交互作用對(duì)蛋殼膜中提取硫酸軟骨素影響強(qiáng)弱排序?yàn)锳C＞CD＞BC＞AB＞BD＞AD，即料液比與堿鹽比之間的交互作用＞堿鹽比與提取時(shí)間之間的交互作用＞提取溫度與堿鹽比之間的交互作用＞料液比與提取溫度之間的交互作用＞提取溫度與提取時(shí)間之間的交互作用＞料液比與提取時(shí)間之間的交互作用。相對(duì)而言，試驗(yàn)中料液比（A） 與堿鹽比（C） 交互作用曲面最為陡峭，表明在提取硫酸軟骨素試驗(yàn)中，料液比的增加對(duì)堿鹽比的影響顯著（p＜0.01）。AC 的交互作用達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），CD 的交互影響達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。

由回歸模型預(yù)測(cè)和分析得出蛋殼膜中提取硫酸軟骨素最佳工藝為料液比1∶15.408，提取溫度59.476 ℃，堿鹽比6.014∶1，提取時(shí)間8.146 h，此時(shí)的硫酸軟骨素的提取率可達(dá)76.67%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮到實(shí)際情況，粗蛋殼膜為1 g 時(shí)，選取料液比為1∶15.5，提取溫度為60 ℃，堿鹽比為6∶1，提取時(shí)間為8 h，在此條件下，硫酸軟骨素的提取率可達(dá)76.5%，理論值與實(shí)際值相差不大，擬合較好，相對(duì)誤差＜0.5%，該驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明采用此響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)真實(shí)可信。

3 結(jié)論

以蛋殼膜為原材料，采用堿鹽法進(jìn)行提取蛋殼膜中的硫酸軟骨素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化提取硫酸軟骨素的工藝參數(shù)，以硫酸軟骨素的提取量作為指標(biāo)，以苯酚硫酸法作為檢測(cè)方法，從而得到蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的最佳工藝為蛋殼膜1 g，料液比1∶15.5，提取溫度60 ℃，堿鹽比6∶1，提取時(shí)間8 h，在最佳工藝的條件下提取硫酸軟骨素，提取率可達(dá)76.5%。該試驗(yàn)為蛋殼膜的綜合利用提供了有效參考，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。