普魯蘭酶對(duì)糯性大黃米淀粉理化性質(zhì)及其品質(zhì)特性的影響

張素敏，喬嘉偉，馬 玲

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中 030801）

糜子脫殼后稱為黃米，主要生長(zhǎng)在我國(guó)干旱、半干旱、降雨量少、土壤肥力低的地區(qū)，具有良好的抗逆性，生長(zhǎng)周期短，品種繁多，是我國(guó)北方重要的糧食作物之一，且富含大量淀粉[1-2]。糜子淀粉也分為糯性與粳性2 種類型，糯性糜子淀粉直鏈淀粉含量低，透明度、凍融穩(wěn)定性、溶解度和膨脹度均優(yōu)于粳性糜子淀粉，但粳性糜子淀粉的熱糊穩(wěn)定性要優(yōu)于糯性糜子淀粉[3]。

黃米中含有豐富的食用纖維，可促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，縮短糞便通過(guò)腸道的時(shí)間，減少糞便中細(xì)菌所產(chǎn)生的酶及毒素對(duì)腸壁的刺激，預(yù)防疾病的發(fā)生[2]。黃米中各種營(yíng)養(yǎng)成分完整，總糖和粗蛋白含量較高，其中粗蛋白含量明顯高于大米等，且富含豐富的常量元素和微量元素，尤其鎂的含量較高。因此，長(zhǎng)期食用黃米有利于預(yù)防冠心病、膽結(jié)石等疾病的發(fā)生[4-8]。山西省北部盛產(chǎn)糯性大黃米，但是目前針對(duì)其研究主要集中在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)上[9-11]，對(duì)黃米淀粉的開(kāi)發(fā)及利用還未完全展開(kāi)，從而導(dǎo)致其應(yīng)用價(jià)值尚未被完全發(fā)現(xiàn)。

抗性淀粉是指在人體小腸中不能被消化，但可在結(jié)腸中被微生物菌群發(fā)酵分解產(chǎn)生斷鏈脂肪酸，利于益生菌生長(zhǎng)的淀粉，可以有效地穩(wěn)定人體的餐后血糖濃度、降低血液中膽固醇的含量，所以被廣大學(xué)者廣泛關(guān)注。目前，我國(guó)抗性淀粉的供給大部分來(lái)自國(guó)外，導(dǎo)致成本偏高，應(yīng)用受限[12-14]，尤其是山西省北部盛產(chǎn)糯性大黃米，對(duì)糯性大黃米抗性淀粉的研究，具有十分重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

試驗(yàn)以糯性大黃米為原料，利用堿法提取淀粉，利用酶解法制備糯性大黃米抗性淀粉，篩選出最佳的制備條件，并分析酶解對(duì)糯性大黃米淀粉的理化性質(zhì)的影響；在此基礎(chǔ)上，用酶法制備的抗性淀粉用于餅干加工中，分析加入抗性淀粉的餅干質(zhì)構(gòu)特性及功能特性，為糯性大黃米抗性淀粉的盛產(chǎn)及功能食品開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)，也為糯性大黃米的進(jìn)一步精深加工提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯性大黃米，東方亮公司提供；植物抗性淀粉（rs） 酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司提供；普魯蘭酶（2 000 U/mL），酷爾化學(xué)科技（北京） 有限公司提供；NaOH、HCl、Tris-HCl、無(wú)水乙醇、KBr、磷酸緩沖液、α- 淀粉酶（3 700 U/g），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；NaCl、胃蛋白酶（250 U/mg），合肥千盛生物科技有限公司提供；MgCl2-CaCl2溶液、胰酶（250 U/mg），廣州達(dá)暉生物技術(shù)股份有限公司提供；淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶（50 000 U/g），江蘇博立生物制品有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

WFM-10 型超微粉碎振蕩磨，江陰市祥達(dá)機(jī)器制造有限公司產(chǎn)品；DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；JJ-1 型大功率電動(dòng)攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；KDC-1044L 型大容量低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SCIENTZ-30YD/A 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司產(chǎn)品；Spectra Max i3x型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃米淀粉的制備

使用超微粉碎振蕩磨將黃米研磨成粉（1 250 mm），配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的NaOH 溶液備用。稱取200 g黃米粉于1 L 的大燒杯中，按照黃米粉與NaOH 溶液1∶4 的配比用璃棒將其混勻。將其放置于45 ℃的恒溫水浴鍋中，使用大功率電動(dòng)攪拌器攪拌3 h。3 h 后將其取出，倒入離心管中，配平，使用大容量低速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速3 500 r/min 離心10～15 min，棄去上清液，摳出淀粉并加入適量蒸餾水溶解，如此重復(fù)3～4 次。將黃米淀粉溶液pH 值調(diào)至中性，按照上述離心操作進(jìn)行離心，取出黃米淀粉后，放入45 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，取出，得到黃米淀粉。

1.3.2 糯性大黃米抗性淀粉的制備

稱取一定質(zhì)量的黃米淀粉于250 mL 燒杯中，將其配制成10%的黃米淀粉乳，置于沸水中水浴處理30 min，從而使淀粉乳充分糊化。待冷卻至60 ℃左右將其pH 值調(diào)至5 左右，向其加入一定量的普魯蘭酶后放入60 ℃電子恒溫水浴鍋中，反應(yīng)一段時(shí)間后取出，置于沸水中15 min，滅酶。待冷卻至室溫后，倒入離心管中，加入2 倍體積無(wú)水乙醇，使用大容量低速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心20 min。將得到的沉淀物進(jìn)行凍干處理，從而得到糯性大黃米抗性淀粉。

1.3.3 抗性淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品抗性淀粉含量的測(cè)定

配制濃度為0.05 mol/L 的Tris HCl 溶液，稱取一定質(zhì)量樣品，按照質(zhì)量∶體積= 1∶9（mg∶mL） 的比例加入9 倍體積的Tris HCl 溶液于離心管中，用離心機(jī)以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心10～15 min（取上清液測(cè)定）。使用植物抗性淀粉（RS） 酶聯(lián)免疫分析試劑盒，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同） 和待測(cè)樣品孔。首先，向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，再向待測(cè)樣品孔中加入40 μL 樣品稀釋液和10 μL待測(cè)樣品，輕微晃動(dòng)搖勻，向除空白孔外的各孔中加入100 μL 酶標(biāo)液；封板膜封板；置于37 ℃恒溫箱中溫育1 h。配制20 倍稀釋后的洗滌液；揭去封板膜，棄去液體，使用配置好的洗滌液洗滌5 次；每孔加入顯色劑A 50 μL和顯色劑B 50 μL，輕微晃動(dòng)搖勻，于37 ℃條件下避光反應(yīng)15 min。每孔加入終止劑50 μL；使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定各孔吸光度；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)量各樣品中抗性淀粉含量；確定最適加酶量與最佳酶解時(shí)間。

抗性淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

1.3.4 單因素對(duì)黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

（1） 普魯蘭酶添加量對(duì)黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響。稱取一定質(zhì)量的黃米淀粉于燒杯中，將其配制成10%的黃米淀粉乳，放于沸水中電子恒溫水浴30 min，從而使淀粉乳充分糊化。待冷卻至60 ℃后將其pH 值調(diào)至5 左右，放入60 ℃電子恒溫水浴鍋中加入1，3，5，7，9 U/g 的普魯蘭酶，反應(yīng)3 h后取出，置于沸水中15 min，滅酶。待冷卻至室溫后，倒入離心管中，并加入2 倍體積無(wú)水乙醇，使用大容量低速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心20 min。將得到的沉淀物進(jìn)行凍干處理，從而得到酶處理黃米淀粉。

（2） 普魯蘭酶酶解時(shí)間對(duì)黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響。稱取一定質(zhì)量的黃米淀粉于燒杯中，將其配制成10%的黃米淀粉乳，置于沸水中水浴30 min，從而使淀粉乳充分糊化。待冷卻至60 ℃后將其pH值調(diào)至5 左右，隨后放入60 ℃電子恒溫水浴鍋中加入5 U/g 的普魯蘭酶，反應(yīng)1，2，3，4，5 h 時(shí)間后取出，置于沸水中15 min，滅酶。待冷卻至室溫后，倒入離心管中，并加入2 倍體積無(wú)水乙醇，使用大容量低速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心20 min。最后將得到的沉淀物進(jìn)行凍干處理，從而得到酶處理黃米淀粉。

1.3.5 酶處理前后淀粉理化性質(zhì)的測(cè)定

（1） 酶處理前后淀粉溶解度的測(cè)定。稱取一定質(zhì)量（M） 酶處理前后淀粉樣品并分別配制成1%的淀粉溶液，于40，50，60，70，80 ℃的電子恒溫水浴鍋中水浴30 min 并不斷攪拌，隨后將其倒入離心管中，使用離心機(jī)以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心20 min。最后將上清液置于恒質(zhì)量鋁盒中，于105 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，比較酶處理前后淀粉的溶解度。被溶解的淀粉質(zhì)量為A，S（溶解度） =(A/M)×100%。

（2） 酶處理前后淀粉透光率的測(cè)定。稱取一定質(zhì)量酶處理前后淀粉樣品并分別配制成1%的淀粉溶液，將其置于沸水中水浴30 min，從而使淀粉充分糊化。待淀粉糊冷卻至室溫后，將其倒入比色皿中，以蒸餾水作為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)620 nm 處測(cè)定其透光率T。

1.3.6 酶解對(duì)糯性大黃米淀粉品質(zhì)特性的影響

（1） 酶處理后黃米淀粉餅干的制作?；A(chǔ)配方：低筋面粉100 g，黃油15 g，白砂糖8 g，水20 mL，全蛋液30 g，食鹽1 g，膨松劑1 g。在此配方的基礎(chǔ)上加入酶處理后的黃米淀粉各0，50，100 g，將黃油隔水融化后加入白砂糖、膨松劑、食鹽、全蛋液，攪拌均勻并加入低筋面粉中，分次加水?dāng)嚢栊纬擅鎴F(tuán)。隨后將面團(tuán)放置于容器中，使用保鮮膜密封，靜置30 min，搟平，使用模具按壓成型，表面扎孔，放置于烤箱中，設(shè)置為上火160 ℃，下火180 ℃，時(shí)間7～10 min。

（2） 添加酶處理后黃米淀粉對(duì)餅干的質(zhì)構(gòu)分析。采用三點(diǎn)彎曲測(cè)試黃米餅干質(zhì)構(gòu)。程序選擇三點(diǎn)彎曲（100 N 力量感應(yīng)元）；當(dāng)探頭移動(dòng)至2 個(gè)支撐點(diǎn)下2 cm 時(shí)給予探頭一個(gè)阻力，從而使探頭停止運(yùn)動(dòng)，完成位移零點(diǎn)設(shè)置；設(shè)置回程距離為30 mm；放置樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

（3） 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取6 支試管，按照斐林試劑法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制完成后，混勻，置于沸水中水浴10 min，冷卻至室溫，以轉(zhuǎn)速1 500 r/min離心5 min，取上清液，以蒸餾水作為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)590 nm 處測(cè)定吸光度。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（4） 酶處理后黃米淀粉餅干GI 值的測(cè)定。根據(jù)閆晨苗[15]的研究方法，稱取全面粉餅干，添加25%酶處理后黃米淀粉餅干和添加50%酶處理后黃米淀粉餅干各1 g，置于150 mL 錐形瓶中，加入磷酸緩沖液（0.1 mol/mL，pH 值6.9） 3 mL 和提前于37 ℃條件下水浴一段時(shí)間后的α - 淀粉酶溶液1 mL，搖勻，加入磷酸緩沖液（0.1 mol/mL，pH 值6.9） 10 mL、NaCl 溶液（0.4 g/L） 6 mL 和胃蛋白酶0.05 g，使用2 mol/mL 的HCl 溶液調(diào)至pH 值為1.5（記錄用量），于37 ℃下攪拌30 min，加入磷酸緩沖液（0.1 mol/mL，pH 值6.9） 10 mL，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的NaOH溶液調(diào)至pH 值為6.9（記錄用量），隨后加入MgCl2-CaCl2溶液0.2 mL、胰酶溶液0.2 mL、淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶溶液0.4 mL，補(bǔ)蒸餾水至50 mL，于37 ℃搖床中，以轉(zhuǎn)速170 r/min 搖床振蕩反應(yīng)，取水解樣液1 mL，置于沸水中5 min，滅酶，冷卻至室溫，取上清液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

取菲林試劑4 mL 和蒸餾水6 mL，混勻，作為空白試劑，測(cè)定溶液于波長(zhǎng)590 nm 處的吸光度。

取水解液1 mL 于試管中，加入淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶溶液0.1 mL 和蒸餾水3.9 mL，混勻。取2 mL 混合后的溶液，加入斐林試劑4 mL 和蒸餾水3 mL，混勻。測(cè)定溶液于波長(zhǎng)590 nm 處的吸光度。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得出葡萄糖的含量，得到淀粉水解率，并繪制水解率與時(shí)間的關(guān)系曲線。

以淀粉水解率為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制淀粉水解率曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC） 進(jìn)而計(jì)算得出HI：

試驗(yàn)以白面包（或葡萄糖） 作為對(duì)照，進(jìn)而計(jì)算得出GI：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 普魯蘭酶用量對(duì)黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

普魯蘭酶用量對(duì)黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 普魯蘭酶用量對(duì)黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

由圖3 可知，隨著普魯蘭酶用量的增加，黃米淀粉中抗性淀粉含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。由圖3 可知，當(dāng)普魯蘭酶用量為7 U/g 時(shí)，黃米淀粉中抗性淀粉的含量達(dá)到最高，為27.31%。出現(xiàn)此類情況的原因是由于隨著普魯蘭酶用量的增加，普魯蘭酶作用于α-1,6- 糖苷鍵，從而使黃米淀粉過(guò)度分解，產(chǎn)生過(guò)多短的淀粉鏈，不利于雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成，故抗性淀粉含量有所下降[16]。

2.1.2 普魯蘭酶酶解時(shí)間對(duì)黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

普魯蘭酶酶解時(shí)間對(duì)黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 普魯蘭酶酶解時(shí)間對(duì)黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

由圖4 可知，隨著普魯蘭酶酶解時(shí)間的增加，黃米淀粉中抗性淀粉含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。由圖4 可知，當(dāng)普魯蘭酶酶解時(shí)間為3 h 時(shí)，黃米淀粉中抗性淀粉的含量達(dá)到最高，為20.11%。出現(xiàn)此類情況的原因是由于普魯蘭酶專一性作用于α-1,6-糖苷鍵，經(jīng)過(guò)普魯蘭酶的脫支作用后，產(chǎn)生大量的線性淀粉鏈，而線性淀粉鏈具有良好的移動(dòng)性，易于形成有序的雙螺旋結(jié)構(gòu)，促進(jìn)抗性淀粉的產(chǎn)生，但隨著酶解時(shí)間的增加，黃米淀粉過(guò)度分解，產(chǎn)生過(guò)多短的淀粉鏈，不利于雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成，故抗性淀粉含量有所下降[16]。

綜合2 個(gè)因素可知，普魯蘭酶酶解黃米淀粉的最適酶用量為7 U/g，最佳酶解時(shí)間為3 h。

2.2 酶處理前后黃米淀粉理化性質(zhì)的分析

2.2.1 溶解度分析

黃米淀粉在不同溫度下的溶解度對(duì)比見(jiàn)圖5。

圖5 黃米淀粉在不同溫度下的溶解度對(duì)比

由圖5 可知，隨著溫度的增加，原黃米淀粉與酶處理后黃米淀粉的溶解度均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這是由于高溫破環(huán)了淀粉之間的相互作用，而使淀粉與水分子之間的相互作用增強(qiáng)，故隨著溫度的上升溶解度上升。在40～60 ℃時(shí)原黃米淀粉與酶處理后黃米淀粉的溶解度相差不大，酶處理后黃米淀粉的溶解度略低；在60～80 ℃時(shí)，酶處理后黃米淀粉相較于原黃米淀粉出現(xiàn)明顯下降，說(shuō)明酶處理后黃米淀粉的鍵結(jié)合力增強(qiáng)。

2.2.2 透光率分析

酶解前后黃米淀粉透光率的對(duì)比見(jiàn)表1。

表1 酶解前后黃米淀粉透光率的對(duì)比/%

經(jīng)過(guò)3 次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果由表1 可知，酶處理后黃米淀粉相較于原黃米淀粉透光率發(fā)生明顯下降。由于普魯蘭酶處理黃米淀粉后，酶處理后黃米淀粉中的直鏈淀粉含量相較于原黃米淀粉明顯升高，淀粉的凝沉性增強(qiáng)，對(duì)光的投射能力減弱，即透明度降低，當(dāng)酶處理后，黃米淀粉的透光率出現(xiàn)明顯的降低。

2.3 酶解對(duì)糯性大黃米淀粉品質(zhì)特性的影響

2.3.1 質(zhì)構(gòu)特性分析

餅干質(zhì)構(gòu)特性對(duì)比見(jiàn)表2。

表2 餅干質(zhì)構(gòu)特性對(duì)比/N

經(jīng)過(guò)3 次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果由表2 可知，添加酶處理后黃米淀粉制作餅干，剪切力明顯上升，餅干硬度增大。這可能是由于酶處理黃米淀粉后產(chǎn)生部分抗性淀粉，而隨著添加酶處理后黃米淀粉的比例增大，從而導(dǎo)致餅干面團(tuán)中的抗性淀粉含量升高，抗性淀粉對(duì)面筋網(wǎng)絡(luò)的形成造成了影響。因此，剪切力升高，餅干硬度增大。

2.3.2 餅干GI 值分析

添加酶處理后黃米淀粉對(duì)餅干GI 值的影響見(jiàn)表3。

表3 添加酶處理后黃米淀粉對(duì)餅干GI 值的影響

由表3 可知，全面粉餅干的GI 值高達(dá)78.73，為高GI 值食品（GI＞70）；酶處理后黃米淀粉餅干的GI 值明顯下降，成為中GI 值食品（50≤GI≤70）。餅干GI 值的下降，是由于酶處理后黃米淀粉中抗性淀粉的含量增加，隨著添加到面團(tuán)中的酶處理后黃米淀粉的比例不斷升高，餅干中的抗性淀粉含量升高，淀粉消化減緩，故GI 值降低。

3 結(jié)論

通過(guò)使用普魯蘭酶酶解黃米淀粉，根據(jù)酶處理后黃米淀粉中的抗性淀粉含量作為指標(biāo)，確定了最適酶用量為7 U/g，最佳酶處理時(shí)間為3 h。經(jīng)過(guò)普魯蘭酶酶處理后的黃米淀粉的溶解度與透光率均發(fā)生不同程度的降低，說(shuō)明酶處理后黃米淀粉的鍵結(jié)合力增強(qiáng)，直鏈淀粉含量相較于原黃米淀粉明顯升高，淀粉的凝沉性增強(qiáng)。通過(guò)添加酶處理后的糯性大黃米淀粉制作餅干，經(jīng)過(guò)測(cè)試后發(fā)現(xiàn)，添加過(guò)酶處理后黃米淀粉的餅干，硬度略微增大，剪切力上升，說(shuō)明抗性淀粉對(duì)面筋網(wǎng)絡(luò)的形成造成了影響；GI 值也出現(xiàn)明顯降低，由高GI 值食品降為中等GI值食品。