響應(yīng)面法優(yōu)化廢棄龍眼殼中黃酮的提取研究

葉 芳 ，李鶴祥

（韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與土木工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

龍眼又名桂圓，它開胃健脾，補(bǔ)虛益智，可藥食兼用，是極好的滋補(bǔ)佳品［1-2］. 中國是龍眼的原產(chǎn)國及生產(chǎn)大國，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位［2-3］. 我國每年在獲得龍眼果肉及其加工產(chǎn)品過程中會產(chǎn)生大量廢棄的龍眼殼，若能合理利用這些廢棄的龍眼殼，不僅能夠節(jié)約資源，保護(hù)環(huán)境，還能提高龍眼種植業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益. 而龍眼殼中所富含的黃酮類化合物，具有抗氧化抗衰老［4-5］、抗腫瘤［6-7］、改善血液循環(huán)［8-9］、降低膽固醇［10］、鎮(zhèn)痛［11］等作用.

影響龍眼殼黃酮提取率的因素較多，如提取的溶劑溶解度、溫度、時間以及料液比等，只有通過大量試驗(yàn)探索才能得到提取的最佳條件. 為了減少試驗(yàn)次數(shù)，本研究采用了響應(yīng)面法來得到龍眼殼中黃酮提取的最佳條件.

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要試驗(yàn)材料與儀器

龍眼購自韶關(guān)市市場；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（福州飛凈生物科技有限公司）；無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3及NaOH 均為分析純（天津大茂化學(xué)試劑廠）；722S 型分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；AUY-220 型電子天平（日本島津公司）；KQ-50B 型超聲波清洗儀器（江蘇昆山儀器有限公司）；SHD-Ⅲ型真空泵（保定市陽光儀器廠）.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 龍眼殼原料的處理

將廢棄的龍眼殼清洗干凈，自然晾干，80 ℃烘干，粉碎，過0.213 mm（80 目）的篩子，即為廢棄龍眼殼粉末，待用.

1.2.2 龍眼殼黃酮的超聲提取方法

準(zhǔn)確稱取一定量的廢棄龍眼殼粉末，分別加入適量乙醇，超聲提取一段時間，冷卻至室溫，離心，取上清液測定吸光度，計算廢棄龍眼殼中的黃酮提取率.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取25.0 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液完全溶解后轉(zhuǎn)移到250.0 mL 容量瓶中，再用50%乙醇溶液稀釋至刻度線并搖勻，即可得濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，待用［12］.

分別量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于25.0 mL 容量瓶中，各加入5% NaNO2溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min 后，各加入10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min［13-14］，再各加入4%NaOH 溶液10.0 mL，搖勻后用乙醇定容，搖勻，靜置15 min，在波長510 nm 處用分光光度計測其吸光度.繪制吸光度A隨蘆丁c（mg·mL-1）變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=27.336c-0.004 71，R2=0.999 8.

1.2.4 龍眼殼中黃酮含量的測定

準(zhǔn)確稱取1.00 g 廢棄龍眼殼粉末，加入25.0 mL 70%乙醇，超聲50 min 后，冷卻至室溫，離心，取1.0 mL的上清液于25.0 mL 容量瓶中，加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，加入1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置6 min［13-14］，再加入10.0 mL 4%NaOH 溶液，搖勻，再加入無水乙醇定容至刻度線，搖勻后靜置15 min，在510 nm 波長處用分光光度計測定吸光度A，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相對于標(biāo)準(zhǔn)品的黃酮質(zhì)量濃度c（mg·mL-1），按公式Y(jié)=c×1.0/（1.00×1 000）×25×100%計算黃酮提取率Y（%）. 式中，1.0 為所取上層清液體積，mL；1.00 為取樣質(zhì)量，g；1 000 為換算系數(shù)，mg·g-1；25 為返算倍數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲提取時間對黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6 份1.00 g 龍眼殼粉末，分別加25.0 mL的70%乙醇，使液料比為25∶1，分別超聲提取20、30、40、50、60、70 min，冷卻至室溫，離心，取1.0 mL 上層清液，按“1.2.4”方法測其吸光度，然后計算出龍眼殼中的黃酮提取率，考察超聲提取時間對龍眼殼黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1.由圖1 可知，隨著超聲提取時間的增加，龍眼殼黃酮提取率逐漸增加，但是超聲提取時間超過50 min 后，提取率反而下降，這可能是由于開始隨著提取時間增加，龍眼殼黃酮能夠充分溶解出來，所以黃酮含量逐步增加，但是提取時間超過50 min 后，長時間的超聲作用會破壞龍眼殼黃酮的結(jié)構(gòu)，降低黃酮的提取率，同時組織中大量破裂的細(xì)胞，增加了溶液中的雜質(zhì)含量，使有效成分的溶出受到影響［15］，因而，選擇50 min 為適宜的超聲提取時間.

圖1 超聲提取時間對黃酮提取率的影響

2.1.2 乙醇體積濃度對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6 份龍眼殼粉末1.00 g，分別加入25.0 mL的體積濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，使液料比25∶1，搖勻后，將其超聲提取50 min，提取過程及黃酮測定方法同“2.1.1”，考察乙醇體積濃度對龍眼殼黃酮提取率影響，結(jié)果見圖2. 由圖2 中可知，隨著乙醇體積濃度的增大，龍眼殼黃酮的提取率逐漸提高，但當(dāng)乙醇濃度超過70%后，龍眼殼黃酮的提取率反而降低，這可能是由于開始隨著乙醇體積濃度增加，龍眼殼中黃酮更容易溶解，但是乙醇體積濃度超過70%后，從廢棄龍眼殼中溶出的一些親脂類雜質(zhì)反而抑制了黃酮的溶出［16］.

圖2 乙醇體積濃度對黃酮提取率的影響

2.1.3 液料比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6 份1.00 g 龍眼殼粉于錐形瓶中，分別按照10∶1、15∶1、20∶1，25∶1、30∶1 的液料比加入不同體積的70%乙醇，搖勻后超聲提取50 min，提取過程及黃酮測定方法同“2.1.1”，考察液料比的改變對龍眼殼黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3. 由圖3 可知，隨著液料比的增加，龍眼殼黃酮提取率逐步增大，直到液料比超過25∶1 后，提取率趨于穩(wěn)定，這可能是由于開始隨著液料比增加，使得龍眼殼粉末與乙醇溶液接觸更充分，因此黃酮提取率也會隨著提高［17-18］，但是當(dāng)液料比超過25∶1 后，龍眼殼中的黃酮已在乙醇溶液中溶解達(dá)飽和，所以試驗(yàn)確定料液比為25∶1 較合適.

圖3 液料比對黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲提取時間（A），乙醇體積濃度（B）和液料比（C）3 個因素為自變量，并以1，0，-1 代表自變量的高、中、低水平，以廢棄龍眼殼黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，參照Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計原理，設(shè)計3 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平，如表1.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計

2.3 響應(yīng)面法分析及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)方案，以超聲提取時間（A），乙醇體積濃度（B）和液料比（C）3 個因素為自變量，龍眼殼黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計了3 因素3 水平共17 個響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2，采用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合分析［19-24］. 得到龍眼殼中黃酮提取率為響應(yīng)值（Y）的二次多元回歸方程為Y=-2.847 080+0.032 600A+0.059 678B+0.069 575C+1.665 330×10-18AB-1.400 000×10-4AC-5.000 000×10-6BC-2.772 500×10-4A2-4.097 500×10-4B2-1.179 000×10-3C2.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.4 回歸方程的方差分析

對回歸方程進(jìn)行顯著性方差分析及誤差統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3 和表4［10，19-24］. 回歸模型的F值為58.90，P＜0.01，表明回歸模型極顯著，回歸方程擬合度好；失擬項(xiàng)的F值為2.17，P值0.234 7＞0.05，說明模型的失擬項(xiàng)差異不顯著、誤差由隨機(jī)誤差而引起、該模型與試驗(yàn)有良好的擬合性；相關(guān)系數(shù)R2為0.987 0，表明預(yù)測值與試驗(yàn)值之間具有較高的相關(guān)性；校正系數(shù)R2Adj為0.970 2，預(yù)測系數(shù)R2Pred=0.863 2 且R2Adj-R2Pred＜0.2，兩個系數(shù)值高且接近，說明回歸模型能充分說明試驗(yàn)過程；模型的變異系數(shù)CV值為0.64%＜10%，表明試驗(yàn)可信度和精確度高；精密度（Adeq Precision）=21.466＞4，視為合理，也從另外一個角度表明此方程模型可信度高，能很好地描述本次試驗(yàn)結(jié)果，因此可用該模型來優(yōu)化龍眼殼中黃酮提取條件.

表3 方差分析結(jié)果

表4 誤差統(tǒng)計分析表

同時根據(jù)表3 中的P值大小可以看出，一次項(xiàng)A、B、C均對響應(yīng)值Y的影響極顯著（P＜0.01）；模型交互項(xiàng)AC、AB、BC均對響應(yīng)值的影響不顯著（P＞0.05）；模型二次項(xiàng)A2、B2、C2對響應(yīng)值的影響均極顯著（P＜0.01）. 因此，各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系. 由F值大小可知，各因素對龍眼殼中黃酮提取率的影響順序?yàn)椋築（乙醇體積濃度）＞C（液料比）＞A（超聲提取時間）.

2.5 響應(yīng)面圖和等高線圖分析

根據(jù)擬合的二次回歸方程可繪制各影響因素之間的三維立體響應(yīng)面圖和等高線圖，可直觀顯示相關(guān)因素對響應(yīng)值（龍眼殼黃酮提取率）的交互影響作用，其中響應(yīng)面的坡度越陡峭，表明該因素對響應(yīng)值的影響越大；且等高線圖的形狀越接近橢圓，表明兩因素間的交互作用越明顯［10，19-24］. 具體見圖5～圖7.

圖5 超聲提取時間和液料比交互作用的響應(yīng)面和等高線

由圖5 可知，響應(yīng)面中液料比曲線比超聲提取時間更為陡峭，說明液料比對響應(yīng)值（龍眼殼黃酮提取率）的影響比超聲提取時間大，但從兩者的等高線圖形狀可以看出，超聲提取時間和液料比的交互作用對響應(yīng)值的影響不太顯著，這與表3 中的方差分析結(jié)果相符.

由圖6 可知，響應(yīng)面中乙醇體積濃度曲線比超聲提取時間更陡峭，說明乙醇體積濃度對龍眼殼黃酮提取率的影響比超聲提取時間大，但從兩者的等高線圖形狀可以看出，超聲提取時間與乙醇體積濃度的交互作用對龍眼殼黃酮提取率的影響不顯著，這與表3 中的方差分析結(jié)果相符.

圖6 超聲提取時間和乙醇體積濃度交互作用的響應(yīng)面和等高線

由圖7 可知，響應(yīng)面上乙醇體積濃度曲線的陡峭程度比料液比大，說明乙醇體積濃度對龍眼殼黃酮提取率的影響比液料比大. 但從兩者的等高線圖形狀可以看出，乙醇體積濃度與液料比的交互作用對龍眼殼黃酮提取率的影響不顯著，這與表3 中的方差分析結(jié)果相符.

圖7 乙醇濃度和液料比交互作用的響應(yīng)面和等高線

2.6 驗(yàn)證優(yōu)化條件

經(jīng)過Design-Expert 8.0.6 軟件分析預(yù)測，在超聲提取時間為52.16 min，乙醇體積濃度為72.66%，液料比為26.25∶1 的條件下，可從廢棄龍眼殼中得到最大的黃酮提取率為1.085%. 為了檢驗(yàn)預(yù)測結(jié)果與真實(shí)情況是否吻合，我們進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn). 考慮試驗(yàn)實(shí)際操作情況，將條件數(shù)據(jù)四舍五入，調(diào)整超聲提取時間為52 min，乙醇體積濃度為73%，液料比為26∶1；在此條件下，分別進(jìn)行3 次試驗(yàn)，測得實(shí)際的廢棄龍眼殼中黃酮的提取率為1.071%、1.075%、1.078% ，取平均值約為1.075%，與預(yù)測結(jié)果相近，說明應(yīng)用響應(yīng)面法來優(yōu)化提取廢棄龍眼殼中黃酮，具有較好的實(shí)用價值.

3 結(jié)論

本研究試驗(yàn)利用響應(yīng)面法探究了超聲提取廢棄龍眼殼中的黃酮條件，試驗(yàn)表明各因素對提取率的影響大小順序?yàn)椋阂掖俭w積濃度＞液料比＞超聲提取時間，最佳提取條件是：超聲提取時間52 min，乙醇體積濃度73%，料液比26∶1 時，超聲輔助醇法對龍眼殼中黃酮的提取率可達(dá)1.075%.