阿法替尼脂質(zhì)體凍干粉的制備與性質(zhì)

朱效素,王曉雯,王 玉,梁涪淮,張 蓬,于曉鋒,劉 沙

(1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺 264005;2.煙臺毓璜頂醫(yī)院,山東 煙臺 264000)

目前,肺癌的治療手段及抗癌藥物存在一定的臨床問題[1]。近年來,小分子靶向制劑開啟了肺癌靶向治療的新時代[2],其中表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)對于肺癌病灶的靶向性治療具有不可替代的作用。阿法替尼(Afatinib,AT)是第二代不可逆的EGFR-TKI,能夠阻止EGFR激酶形成共價鍵和不可逆鍵,進而抑制腫瘤細胞生長,加速腫瘤細胞凋亡[3]。但目前市售AT為片劑,口服生物利用度較低,且易導(dǎo)致腹瀉等胃腸道不良反應(yīng)[4]。為提高肺癌患者的耐受性,更好地發(fā)揮藥效,亟需開發(fā)一種生物利用度高、不良反應(yīng)少的AT新型制劑。

脂質(zhì)體是一種兩親性納米載體,具有良好的靶向性、緩釋性、細胞親和性和生物相容性等優(yōu)勢,可提高藥物生物利用度,降低藥物的毒副作用[5]。脂質(zhì)體凍干粉作為吸入劑可增加負載藥物在肺內(nèi)的保留和吸收,使其在局部更好地發(fā)揮作用,降低口服給藥產(chǎn)生的胃腸道及全身性不良反應(yīng)[6-7]。

基于上述背景,本研究首次制備阿法替尼脂質(zhì)體凍干粉(AT-LP-FDP),優(yōu)化凍干處方工藝,考察凍干制劑的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性,并對制劑的腫瘤細胞殺傷作用和安全性進行初步評價,為開發(fā)抗腫瘤藥物吸入劑提供重要技術(shù)支持。

1 材 料

1.1 儀器

EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1300D-W (瑞徽電子(上海)有限公司),集熱式磁力攪拌器 DF-101s (西安太康生物科技有限公司),萬分之一電子分析天平(成都市科恒達儀器設(shè)備有限責(zé)任公司),納米粒度儀(美國PSS公司),離心機 PrimoR (美國 SORVALL 公司),雙光束紫外分光光度計 UV-6100 (濟南慧紅醫(yī)療設(shè)備有限公司),真空冷凍干燥機(上海皓莊儀器有限公司),多功能酶標儀(Molecular Devices)。

1.2 試劑

阿法替尼雙馬來酸鹽(AT)(上海東蒼生物科技有限公司),大豆卵磷脂(上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司),膽固醇(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司),無水乙醇(南通潤豐石油化工有限公司),甲醇、甘露醇(上海吉至生化科技有限公司),乳糖(上海創(chuàng)賽科技有限公司),蔗糖(武漢豐泰威遠科技有限公司),海藻糖(南通潤豐石油化工有限公司),叔丁醇(天津市富宇精細化工有限公司),A549人非小細胞肺癌細胞(上海語純生物科技有限公司),噻唑藍(MTT)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

2 方 法

2.1 阿法替尼脂質(zhì)體的制備及含量測定方法

采用硫酸銨梯度法制備阿法替尼脂質(zhì)體 (Afatinib Lipsome,AT-LP)[8],具體操作如下:取適量大豆卵磷脂、膽固醇,按比例溶于適量無水乙醇,超聲溶解后,將膜材置于60 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去無水乙醇,成膜后迅速加入相同溫度的硫酸銨溶液,60 ℃磁力攪拌和超聲各20 min,即得空白脂質(zhì)體(Lipsome,LP)。將LP置于質(zhì)量分數(shù)為0.9%的氯化鈉溶液中透析6 h,3 h時換水一次。透析完成后,將一定濃度的AT溶液加入LP中,混合,于55 ℃孵育15 min,即得AT-LP。用納米粒度儀測定脂質(zhì)體的粒徑和zeta電位。

為了確定AT溶液的最大吸收波長,取一定量的AT溶于甲醇溶液中,并取相應(yīng)量的LP,加入甲醇破乳。以甲醇作為空白對照,采用紫外分光光度法進行檢測。在200～700 nm范圍內(nèi)對AT甲醇溶液與LP甲醇稀釋液進行掃描,確定AT的最佳檢測波長為342 nm。配制一定濃度的AT甲醇溶液作為母液,依次稀釋至系列濃度后,測定其在342 nm處的吸光度值,制作AT標準曲線。將經(jīng)過葡聚糖凝膠過濾分離獲得的AT-LP和未經(jīng)葡聚糖凝膠過濾的AT-LP,分別用甲醇稀釋后測定吸光度,代入AT標準曲線中計算濃度,得出脂質(zhì)體中包封的AT的質(zhì)量WAT包封和載藥脂質(zhì)體投藥總質(zhì)量WAT總,WAT-LP總為脂質(zhì)體的總質(zhì)量,再通過如下公式求得AT-LP的包封率(EE)和載藥量(DL):

EE=WAT包封/WAT總×100%,

DL=WAT包封/WAT-LP總×100%。

2.2 AT-LP-FDP的制備及凍干工藝的考察

冷凍干燥一般分為預(yù)凍、升華干燥、解析干燥3步[9],研究表明冷凍干燥可以有效保留脂質(zhì)體及內(nèi)容物的穩(wěn)定性。采用冷凍干燥技術(shù)制備AT-LP-FDP,以粒徑、包封率、凍干樣品外觀和溶解性為主要評價指標,分別對凍干保護劑的種類、預(yù)凍方式、預(yù)凍溫度、預(yù)凍時間及干燥時間進行單因素考察。

2.2.1 凍干保護劑的考察 固定加入凍干保護劑的總量、預(yù)凍時間、溫度及干燥時間等其他條件,分別以蔗糖、甘露醇、海藻糖、乳糖、叔丁醇為凍干保護劑,設(shè)為實驗組;以不加任何保護劑的AT-LP為空白對照組,考察不同單一凍干保護劑對AT-LP的保護作用。

固定加入的凍干保護劑的質(zhì)量分數(shù)為10%,兩種保護劑質(zhì)量比為1∶1,以凍干制品的外觀、溶解性、包封率等為評價指標,考察聯(lián)用凍干保護劑對凍干樣品的保護效果。

2.2.2 預(yù)凍方式/溫度/時間的考察 預(yù)凍方式可以分為速凍和慢凍。采用速凍(液氮速凍,將樣品放入液氮中迅速成冰,后放入-80 ℃冰箱中進行樣品的預(yù)凍)和慢凍(將樣品分別放入-20、-40、-80 ℃冰箱預(yù)凍24 h); 考察預(yù)凍溫度為-20、-40、-80 ℃(固定凍干保護劑為5%甘露醇+5%乳糖,慢凍,預(yù)凍時間24 h,干燥時間12 h);預(yù)凍時間為12、24 和48 h時(固定凍干保護劑為5%甘露醇+5%乳糖,慢凍,預(yù)凍溫度為-80 ℃,干燥時間12 h)AT-LP-FDP的凍干效果。

2.2.3 干燥時間的考察 干燥時間是影響樣品水分含量的重要因素,樣品中的水分含量會影響樣品的外觀和溶解度[10]。考察了總干燥時間分別為8 h、12 h、24 h時對AT-LP-FDP的影響(固定凍干保護劑為5%甘露醇+5%乳糖,慢凍,預(yù)凍溫度為-80 ℃,預(yù)凍時間為24 h)。

2.3 AT-LP-FDP理化性質(zhì)的考察

2.3.1 外觀形態(tài) 采用掃描電子顯微鏡(SEM)對AT-LP-FDP表面形態(tài)進行觀察。在干燥環(huán)境下,取少量樣品粉末灑落在導(dǎo)電膠布上,吹掉多余粉末,置于離子濺射儀上噴金200 s后,用SEM觀察并采集圖像,電壓為5 kV,放大倍數(shù)為1000～10 000倍。

2.3.2 引濕性 根據(jù)《中國藥典》2020版藥物引濕性試驗指導(dǎo)原則的測定方法。取干燥的玻璃具塞稱量瓶(外徑為50 mm,高為15 mm),于試驗前一天置于(25±1) ℃的恒溫干燥器中(下部放氯化銨或硫酸銨飽和溶液),相對濕度為(80±2)%,精密稱定重量(m1),取供試品適量,平鋪于上述稱量瓶中,供試品厚度為1 mm,精密稱定重量(m2)。將稱量瓶敞口,并與瓶蓋同置于上述恒溫恒濕條件下24 h,蓋好稱量瓶蓋子,精密稱定(m3)。計算引濕率:

引濕率=(m3-m2)/(m2-m1)×100%。

2.3.3 密度測定 分別稱量一定量的阿法替尼凍干粉(AT-FDP)和AT-LP-FDP,每組3份,置于量筒中,記錄其體積V1,輕輕振動,使粉末落下并觀察量筒中粉體的體積變化,至體積無明顯變化后,第二次記錄粉末在量筒中的體積V2,分別稱量加樣前后量筒重,其差值即為所加入粉體的質(zhì)量(m)。計算堆密度(ρb)、振實密度(ρt):ρb=m/V1,ρt=m/V2。

2.3.4 休止角 休止角代表粉末的流動性。采用固定漏斗注入法測定AT-FDP和AT-LP-FDP的休止角[11]。將漏斗對準培養(yǎng)皿的圓心,將樣品粉末注入,直至粉體在培養(yǎng)皿上形成圓錐體,停止注入,測量錐體的高度(h),與錐體的半徑(r),將高度(h)與半徑(r)相比即得休止角的正切值(tanβ=h/r)。

2.3.5 體外釋放 分別取2份含量為1.0 mg的AT-LP-FDP,以PBS為釋放介質(zhì),加2 mL PBS置于透析袋內(nèi),分別放入裝有40 mL PBS和40 mL含20%FBS的PBS的離心管中,置于100 r/min、溫度為37 ℃的搖床中震蕩。分別于0.08、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h時各取2 mL釋放介質(zhì),并補充2 mL 相應(yīng)釋放介質(zhì)。采用紫外分光光度法測量并計算累積釋放量,繪制體外釋放曲線。

2.3.6 穩(wěn)定性 加速實驗:取樣品3份在恒溫恒濕箱(35±2)℃、(75±5)%中保存,于實驗期間0、1、2、3月末分別取樣,考察其外觀、粒徑、包封率、溶解性;長期實驗:取樣品3份在普通藥柜(25±2)℃、(50±10)%中保存,于試驗期間0、3、6、9、12月末分別取樣考察其外觀、粒徑、包封率、溶解性。

2.4 體外細胞實驗考察

2.4.1 空白載體細胞毒性實驗 采用MTT法對空白脂質(zhì)體凍干粉(LP-FDP)的安全性進行考察[12]。將A549細胞按5000個/孔的密度接種于96孔板中,每孔加入100 μL 細胞懸液,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將96孔板中的培養(yǎng)基吸去,每孔分別加入100 μL用完全培養(yǎng)基配成的質(zhì)量濃度分別為500、200、100、50、20、0 μg/mL的LP-FDP復(fù)溶液,每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。將上述96孔板放入二氧化碳培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h后,每孔分別加入20 μL 5.0 mg/mL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h;然后再次將96孔板中的培養(yǎng)基吸去,用PBS清洗3遍后,每孔加入200 μL DMSO,置于37 ℃搖床振搖10 min,用多功能酶標儀測定570 nm處各孔的吸光度(A),計算細胞存活率,公式如下:

細胞存活率=(At-Ao)/(Ac-Ao)×100%,式中,At、Ac、Ao分別代表給藥孔、對照孔、調(diào)零孔的A值。

2.4.2 AT-LP-FDP細胞毒性實驗 按照最優(yōu)工藝制備AT-LP和AT-LP-FDP,用完全培養(yǎng)基分別配制濃度為0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的AT-LP溶液和AT-LP-FDP復(fù)溶液。按照“2.4.1”的方法對AT-LP-FDP的毒性進行考察。

3 結(jié) 果

3.1 AT-LP標準曲線和包封率的測定

通過紫外分光光度計測定AT標準曲線:以吸光度為縱坐標,質(zhì)量濃度為橫坐標,繪制AT標準曲線得回歸線方程:y=0.028 8x+0.023 7,R2=0.999 1,表明AT在5～25 μg/mL之間的線性關(guān)系良好。通過硫酸銨梯度法制備的AT-LP,如圖1～2,粒徑為(168±0.5) nm,zeta電位為(-19.44±2.1) mV,多分散系數(shù)PDI為(0.186±0.031,n=3),證明制備的AT-LP粒徑較小且均一,為負電荷脂質(zhì)體且穩(wěn)定。根據(jù)“2.1”的葡聚糖凝膠過濾法測定的包封率為(91.43±3.2)%,載藥量為(6.38±0.57)%,證明制備的AT-LP包封率和載藥量較高。

圖1 AT-LP粒徑分布

圖2 AT-LP電位分布

3.2 凍干工藝考察結(jié)果

分別以粒徑、包封率、凍干樣品外觀和溶解性為參考指標,對凍干保護劑進行篩選。溶解性評價:+++表示30秒內(nèi)溶解,++表示1分鐘內(nèi)溶解,+表示2分鐘內(nèi)溶解。

3.2.1 凍干保護劑的考察結(jié)果 由表1～3可知,通過對凍干保護劑的種類和用量等因素進行考察,結(jié)果表明以5%甘露醇+5%乳糖作為凍干保護劑時,制備的AT-LP-FDP的外觀飽滿,粒徑較小,復(fù)溶后脂質(zhì)體與凍干前相比粒徑變化差別小,包封率略降低,溶解性較好。

表1 不同種類凍干保護劑對AT-LP-FDP的影響(n=3)

表2 甘露醇比例及聯(lián)合凍干保護劑對AT-LP-FDP的影響(n=3)

表3 聯(lián)合凍干保護劑用量對AT-LP-FDP的影響(n=3)

3.2.2 預(yù)凍方式/溫度/時間的篩選 由表4可知,液氮速凍法與-80 ℃冰箱慢凍法相比,采用慢凍法作為預(yù)凍制得的脂質(zhì)體干粉的粒徑小,包封率高,外觀蓬松多孔,有顆粒感。當預(yù)凍溫度為-80 ℃、預(yù)凍時間為24 h時得到的脂質(zhì)體干粉的效果更好,符合生產(chǎn)的需要。

表4 預(yù)凍方式、溫度、時間對AT-LP-FDP的影響(n=3)

3.2.3 干燥時間的考察 如表5,干燥時間為8 h時的樣品,表面塌陷,24 h時脂質(zhì)體包封率降低。干燥時間為12 h時,樣品外觀蓬松飽滿,包封率較高。

表5 干燥時間對AT-LP-FDP的影響(n=3)

3.3 AT-LP-FDP的理化性質(zhì)考察

3.3.1 外觀形態(tài) 如圖3,AT-LP-FDP表面蓬松多孔,形態(tài)不規(guī)則,變現(xiàn)為聚集狀態(tài),符合固體分散體的特性;制劑外觀圖顯示,制劑整體為白色、蓬松多孔的粉末,表面平整呈顆粒感。

圖3 AT-LP-FDP的SEM照片與外觀圖

3.3.2 引濕性 測定結(jié)果顯示,在相對濕度低于70%時,引濕率低于1%,相對濕度為80%時,引濕率為(1.47±0.13)%,均低于2%,略有引濕性。

3.3.3 密度及休止角 測定結(jié)果顯示,AT-LP-FDP的休止角比AT-FDP小,堆密度和振實密度比AT-FDP大,表明制備的粉末流動性較好(表6)。

表6 AT-LP-FDP的密度及休止角(n=3)

3.3.4 體外釋放 實驗結(jié)果如圖4,AT-LP-FDP在PBS和含20%FBS的PBS中的體外釋放曲線在6 h內(nèi)無明顯差別,無突釋現(xiàn)象,在48 h時最大累積釋放量達到60%左右。

圖4 AT-LP-FDP的體外釋放曲線

3.3.5 穩(wěn)定性 加速實驗中溫度為(35±2)℃、相對濕度為(75±5)%條件下放置3個月(表7),制劑外觀、粒徑和溶解性并無明顯變化,放置3個月時包封率降低了30%。

表7 AT-LP-FDP加速實驗結(jié)果(n=3)

長期實驗中在(25±2)℃、相對溫度為(50±10)%條件下,0～3個月時制劑的外觀形態(tài)、粒徑、包封率等無明顯變化(表8),6～12個月時制劑開始出現(xiàn)塌陷,粒徑增大,包封率和溶解性降低。

表8 AT-LP-FDP長期實驗結(jié)果(n=3)

3.4 體外細胞實驗

3.4.1 空白載體的細胞毒性 如圖5,不同質(zhì)量濃度的LP-FDP與A549細胞共孵育24 h和48 h時,細胞存活率無明顯差別,且都在80%以上,說明空白載體對A549肺癌細胞無明顯毒性。

圖5 空白載體的細胞毒性

3.4.2 AT-LP-FDP細胞毒性實驗 如圖6,給藥24 h后A549細胞存活率隨著濃度的增大而顯著下降,AT-LP-FDP與AT-LP相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義;給藥48 h后,細胞存活率隨濃度的增大而下降的趨勢更顯著,AT-LP與AT-LP-FDP的IC50值分別為(7.2±1.3)μg/mL和(4.9±0.6)μg/mL,表明AT-LP-FDP對A549肺癌細胞的細胞毒性作用比AT-LP的效果更強。

圖6 AT-LP和AT-LP-FDP的細胞毒性對比與AT-LP組比,*P<0.05)

4 討 論

本研究首先采用硫酸銨梯度法制備了AT-LP,然后通過優(yōu)化凍干工藝制備了可用于吸入的AT-LP-FDP。以凍干前后粒徑、包封率、外觀等為考察指標,篩選凍干保護劑的種類及用量、預(yù)凍時間、預(yù)凍溫度、干燥時間等工藝參數(shù),得到最優(yōu)凍干工藝;以此方法制備的AT-LP-FDP的粒徑、包封率均在3個月內(nèi)維持穩(wěn)定;釋放實驗結(jié)果表明,AT-LP-FDP在兩種不同的釋放介質(zhì)中的釋放量相近,血清蛋白對藥物的釋放無影響;空白載體細胞毒性實驗結(jié)果表明,凍干后的空白載體組細胞存活率均在80%以上,實驗所用的載體材料和凍干保護劑無細胞毒性;AT-LP-FDP細胞毒性實驗中48 h時的IC50值結(jié)果顯示,AT-LP-FDP比AT-LP的毒性略強,表明凍干工藝不會影響藥物活性。

本研究報道的AT-LP-FDP的制備方法操作簡單、可重復(fù)性好,制得的AT-LP-FDP粉外觀蓬松,溶解性好,引濕性較低,釋放量可達要求,抑制細胞作用較好。本研究為AT的給藥提供了新的思路,在減輕患者的不良反應(yīng)方面做出了努力,為AT的應(yīng)用和肺癌治療藥物新制劑的開發(fā)提供新方法。