疏肝健脾顆粒對(duì)大鼠乳腺癌癌前病變組織Fas、FasL表達(dá)的影響

王 瑩,張 明,王紅月,李湘奇

(1山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院·山東 泰安 271000;2泰安市中心醫(yī)院·山東 泰安 271000)

乳腺癌的發(fā)病率逐年攀升,目前已經(jīng)躍居女性惡性腫瘤的首位[1]。乳腺癌如能早期診斷, 早期治療,可提高病人的生存獲益,并有效改善病人的生存質(zhì)量。乳腺的癌前病變,是乳腺浸潤(rùn)性癌癌變過程中的一個(gè)階段,是乳腺組織從量變到質(zhì)變的過程,在轉(zhuǎn)化成乳腺癌之前,經(jīng)過干預(yù)可逆轉(zhuǎn)乳腺癌的進(jìn)程。復(fù)方中藥疏肝健脾顆粒是本院科研處方,又名乳康飲,具有疏肝理氣、益氣健脾、化瘀散結(jié)的功效,已廣泛應(yīng)用于乳腺癌的臨床輔助治療[2]。前期研究發(fā)現(xiàn),其含藥血清作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,對(duì)Hippo信號(hào)通路蛋白YAP、TAZ的表達(dá)有抑制作用,對(duì)YAP、TAZ的磷酸化有促進(jìn)作用,并阻礙了YAP蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的聚集,通過下調(diào)其下游與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)靶基因的表達(dá),誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡[3];但對(duì)乳腺癌癌前病變是否有抑制作用,有待于進(jìn)一步研究。本研究選用雌孕激素與二甲基苯蒽(DMBA)聯(lián)合誘發(fā)大鼠乳腺組織的癌前病變,同時(shí)給予不同劑量的疏肝健脾顆粒進(jìn)行干預(yù),免疫組化法檢測(cè)乳腺癌前病變組織Fas、FasL蛋白表達(dá),初步探討疏肝健脾顆粒對(duì)模型大鼠乳腺組織癌前病變的作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠90只,SPF級(jí), 6～8 周齡,健康未育,體質(zhì)量180～220 g,動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(魯)2012-0005,購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。常規(guī)飼養(yǎng)1 周以適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度18～26 ℃,相對(duì)濕度42%～70%,通風(fēng)換氣良好。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 疏肝健脾顆粒劑由黃芪、茯苓、柴胡、青皮、薏苡仁、莪術(shù)組成,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的單味藥顆?；旌隙?購(gòu)自山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房,按照處方比例,溶于100 mL生理鹽水,然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求配成1.8 g/mL生藥備用。枸櫞酸他莫昔芬片(三苯氧胺)：江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H32021472,實(shí)驗(yàn)時(shí)按10 mg∶50 mL溶于生理鹽水。

1.3 試劑及儀器 Fas/CD95/Apo-1(RAB-0022)兔抗人多克隆抗體、Fas-L(RAB-0199)兔抗人多克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;鏈霉卵白素-過氧化物酶試劑盒(SP-9001)、DAB顯色濃縮型試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DMBA(9,10-二甲基-1,2苯并蒽)：Sigma公司,產(chǎn)品號(hào)：D8480-100,按比例溶于植物油,DMBA終濃度為10 g/L備用;苯甲酸雌二醇：上海通用藥業(yè)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H31021114;黃體酮注射液：天津金耀氨基酸有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H12020533;脫毛膏：廣州賽因化妝品有限公司,TP0120648。CM1900型冰凍切片機(jī)、EG1150C包埋機(jī)：德國(guó)LEICA公司; 日本三豐數(shù)顯500-171游標(biāo)卡尺;BH-2 OLYMPUS照像顯微鏡;HPIAS-1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)：同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)開發(fā);JA5003X型電子精密天平：上海方瑞儀器有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模、給藥 SD大鼠90只按照抽簽法隨機(jī)分為6 組,每組15只,正常對(duì)照組：生理鹽水一次性灌胃1 mL,第2 天開始,30 d為1個(gè)周期(肌肉注射生理鹽水0.5 mL/只,連續(xù)25 d,觀察5 d,共2個(gè)周期。其余75只大鼠參照文獻(xiàn)[4]方法稍加修改進(jìn)行造模,將DMBA 10 mg一次性灌胃后,第2天起,5 d為1個(gè)周期(第1～3 天,苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg后肢肌肉注射,1次/天;第4 天,黃體酮4 mg/kg后肢肌肉注射)連續(xù)12個(gè)周期;DMBA灌胃24 h后隨機(jī)分為5組,每組15只。①模型組：造模的同時(shí)腹腔注射生理鹽水1 mL/100g;②疏肝健脾低劑量組(簡(jiǎn)稱低劑量組)：疏肝健脾顆粒18 g/(kg·d)灌胃;③疏肝健脾中劑量組(簡(jiǎn)稱中劑量組)：疏肝健脾顆粒45 g/(kg·d)灌胃;④疏肝健脾高劑量組(簡(jiǎn)稱高劑量組)： 疏肝健脾顆粒90 g/(kg·d)灌胃;⑤三苯氧胺組：三苯氧胺0.5 mL/100 g灌胃。實(shí)驗(yàn)藥物灌胃劑量按《抗癌藥物研究與實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[5]換算人鼠等效灌胃劑量,以上各組大鼠造模及給藥60 d,均常規(guī)飼養(yǎng)。

大鼠在DMBA灌胃5 d后,每組均有部分出現(xiàn)程度不等的腹瀉、死亡情況,第6周后逐漸趨于平穩(wěn),至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組剩余動(dòng)物數(shù)量,正常對(duì)照組15只、模型組13只、疏肝健脾低劑量組12只、疏肝健脾中劑量組12只、疏肝健脾高劑量組10只、三苯氧胺組11只。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.2.1 癌前病變?nèi)橄俳M織病理學(xué)觀察 末次給藥后,禁食不禁水12 h,以脫毛劑去除大鼠胸部鼠毛,3%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉,取大鼠胸腹部第3、4對(duì)完整乳腺組織,10%福爾馬林固定后石蠟包埋,切片厚度4 μm,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。HE染色根據(jù)2012年版WHO乳腺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[5-6]分為：正常乳腺、普通乳腺增生、癌前病變、浸潤(rùn)癌。

2.2.2 癌前病變?nèi)橄俳M織Fas、Fas-L蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè) 免疫組化S-P法檢測(cè),步驟按說明書進(jìn)行。用邁新公司提供的Fas/Fas-L陽性組織片作為陽性對(duì)照,用PBS代替一抗為陰性對(duì)照。Fas、FasL陽性強(qiáng)度判斷采用半定量法,參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[7],蛋白陽性染色均為胞漿、胞膜出現(xiàn)棕黃棕褐色均勻顆粒。切片組織中(-)為陽性細(xì)胞≤5%,(+)為陽性細(xì)胞6%～25%,(++)為陽性細(xì)胞達(dá)26%～50%,(+++)為陽性細(xì)胞>50%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 版統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 疏肝健脾顆粒對(duì)模型大鼠乳腺組織病理變化的影響 模型組大鼠乳腺癌癌前病變發(fā)生率為69.2%,疏肝健脾顆粒各劑量組及三苯氧胺組的癌前病變發(fā)生率均低于模型組(P<0.01),疏肝健脾顆粒高劑量組和三苯氧胺組亦低于疏肝健脾顆粒低劑量組(P<0.05),與疏肝健脾顆粒中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。部分大鼠乳腺組織發(fā)生浸潤(rùn)癌,主要在模型組和疏肝健脾中、低劑量組,疏肝健脾高劑量組和三苯氧胺組大鼠乳腺組織未見浸潤(rùn)癌發(fā)生。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠乳腺組織病理變化比較[個(gè)(%)]

3.2 疏肝健脾顆粒對(duì)模型大鼠乳腺組織Fas、FasL表達(dá)的影響 正常對(duì)照組大鼠乳腺組織Fas蛋白呈高表達(dá),模型組Fas蛋白表達(dá)減弱,疏肝健脾顆粒各劑量和三苯氧胺組Fas表達(dá)均較模型組增強(qiáng)(P<0.01),低劑量組作用較弱,與三苯氧胺比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組大鼠乳腺組織FasL蛋白表達(dá)較正常組升高,疏肝健脾顆粒各劑量和三苯氧胺組均能夠降低FasL蛋白的表達(dá),與模型組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),與三苯氧胺組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖1～圖2,表2。

圖1 各組大鼠乳腺組織Fas蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

圖2 各組大鼠乳腺組織FasL蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

表2 各組大鼠乳腺組織Fas、FasL表達(dá)的比較(個(gè))

4 討論

關(guān)于乳腺癌的癌前病變的界定,至今尚無統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。普遍認(rèn)為癌前期病變是指形成于惡性腫瘤之前,形態(tài)學(xué)出現(xiàn)不典型增生,或原位癌階段,而組織尚不具備特征性的惡性改變或某些較容易發(fā)展成為癌的病變。乳腺癌癌前病變是介于乳腺增生向乳腺癌發(fā)展的過渡中間環(huán)節(jié),病理變化有其特殊性,但乳腺癌癌前病變經(jīng)過治療尚可以阻斷和逆轉(zhuǎn)其進(jìn)一步的發(fā)展。目前尚無特異性的方法和藥物治療乳腺癌癌前病變,手術(shù)治療亦無明確的針對(duì)性,中醫(yī)藥治療能夠獲得一定的療效,因此積極尋求中醫(yī)藥干預(yù)治療乳腺癌癌前病變的藥物和方劑,對(duì)于乳腺癌的二級(jí)預(yù)防,降低乳腺癌的發(fā)生率,具有重要意義。

本病在中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中無明確的概念,但在《瘍科心得集》中有 “有乳中結(jié)核.形如丸卵,不疼痛,不發(fā)寒熱,皮色不變,其核隨喜怒而消長(zhǎng),從名乳癖”的描述,可與之對(duì)應(yīng)。另一病癥“乳巖”與“乳癖”亦有密切的關(guān)聯(lián),所以可歸屬于“乳癖”與“乳巖”的過渡階段,即經(jīng)過“量變”到“質(zhì)變”的過程[8]。中醫(yī)理論認(rèn)為,乳癖病機(jī)多為肝失疏泄,乘脾克胃,氣血運(yùn)行不暢,郁久化熱,灼津?yàn)樘?或沖任失調(diào)使氣血瘀滯,痰濕內(nèi)生,聚結(jié)于乳絡(luò)而成?！夺t(yī)宗金鑒》曰：“乳中結(jié)核梅李形……癥由肝脾郁結(jié)成”。乳癖發(fā)展為乳巖更多與情志因素有關(guān),與肝脾關(guān)系密切?！锻庾C醫(yī)案匯編》云：“少陽行經(jīng)之地,氣血皆薄,加以情懷失暢,氣血痹郁,故難治,日久恐成巖證”。這些論述提示其病因病機(jī)為情志失調(diào),肝氣郁結(jié),乘克脾土,致使肝郁脾滯,脾失健運(yùn),聚濕成痰,痰瘀互結(jié)加速乳癖向乳巖轉(zhuǎn)變。因此,乳腺癌癌前病變的治療宜從肝脾論治,疏肝健脾為基本治則,輔以化痰散瘀,可庶免乳巖之變。

疏肝健脾顆粒方中柴胡、青皮疏肝理氣,黃芪、茯苓益氣健脾,莪術(shù)、薏苡仁化痰散瘀。全方及拆方研究對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞有明顯的增殖抑制效應(yīng),而且能夠誘導(dǎo)凋亡;含藥血清能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力[9-10]。動(dòng)物移植瘤模型研究表明乳康飲對(duì)裸鼠乳腺原位移植瘤的生長(zhǎng)和淋巴轉(zhuǎn)移有顯著的抑制作用,其作用機(jī)制為抑制乳腺癌組織VEGF-C/D、VEGFR-3 mRNA水平的表達(dá)和Ang-2 蛋白及mRNA水平表達(dá),干擾 Ang-2/Tie2 信號(hào)通路,阻斷VEGF-C、D/VEGFR-3信號(hào)通路的傳導(dǎo),阻礙乳腺癌組織的淋巴管生成,從而控制淋巴轉(zhuǎn)移[11-12];而且只對(duì)PI3K/AKT通路中 PI3K、AKT 的表達(dá)起抑制作用,在促進(jìn)上游 PTEN、SHIP 表達(dá)的同時(shí),調(diào)控PI3K/AKT通路信號(hào)傳導(dǎo),抑乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[13]。以上研究均集中在乳腺癌的研究,對(duì)于乳腺增生以及癌前病變尚未涉及。

本研究結(jié)果表明,疏肝健脾顆粒能夠阻斷DMBA誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌癌前病變過程,表現(xiàn)為隨著疏肝健脾顆粒劑量的增加,癌前病變和導(dǎo)管內(nèi)癌的發(fā)生率逐漸降低,且與雌激素受體拮抗劑三苯氧胺作用相近。

Fas/FasL信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Fas是死亡受體,表達(dá)于細(xì)胞表面,是細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)通路因子,其天然配體FasL是腫瘤壞死因子家族中的Ⅱ 型跨膜蛋白,在激活的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞以及免疫赦免組織均有表達(dá),生理?xiàng)l件下FasL與Fas結(jié)合后,可導(dǎo)致表達(dá)Fas的細(xì)胞凋亡[14]。許多惡性腫瘤組織中,包括乳腺癌組織均存在Fas表達(dá)的下調(diào),相反FasL表達(dá)上調(diào),因此由于腫瘤細(xì)胞表面Fas蛋白表達(dá)的缺失,導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡受阻成為惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的根源[15]。劉曉紅等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)Fas的表達(dá)情況,在不同的乳腺組織中有一定規(guī)律,正常乳腺組織中高于乳腺腺瘤和乳腺不典型增生,而乳腺癌組織中的表達(dá)最低; FasL的表達(dá)規(guī)律卻相反,正常的乳腺組織中最低甚至不表達(dá),乳腺腺瘤和乳腺不典型增生中有部分表達(dá),而乳腺癌組織表達(dá)最高,因此推測(cè)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展等過程與細(xì)胞凋亡異常有密切關(guān)系。乳腺增生到乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程,最大可能的是以乳腺不典型增生為界限的細(xì)胞凋亡過程,增生至不典型增生的乳腺組織Fas的表達(dá)逐漸減少,而FasL的表達(dá)逐漸增加,細(xì)胞凋亡相對(duì)比較活躍,機(jī)體啟動(dòng)了細(xì)胞的凋亡機(jī)制,淘汰或清除過度增生的細(xì)胞和具有惡變傾向的細(xì)胞,從而盡可能地抑制乳腺組織過度增生而遏制其惡變的發(fā)生。

本文免疫組化結(jié)果顯示,Fas蛋白表達(dá)在正常對(duì)照組大鼠乳腺組織中較高,在模型組表達(dá)較低,疏肝健脾顆粒有提升Fas表達(dá)的作用,與三苯氧胺組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);FasL蛋白表達(dá)與Fas相反,在模型組乳腺組織有較高表達(dá),疏肝健脾顆粒各劑量組均能夠降低FasL蛋白的表達(dá),與三苯氧胺組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);且隨著疏肝健脾顆粒劑量的增加,對(duì)Fas、FasL的作用增強(qiáng)。由此推知,疏肝健脾顆粒通過干預(yù)乳腺組織Fas、FasL的表達(dá),在大鼠乳腺癌癌前病變過程中,Fas/FasL通路啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡機(jī)制,促進(jìn)了乳腺組織細(xì)胞的凋亡,從有效地阻止乳腺組織的過度增生及癌變過程。