星康吉鰻精子的超微結構研究

史 寶, 王成剛, 湯曉華, 趙新宇, 晏科文, 馬曉東

星康吉鰻精子的超微結構研究

史 寶1, 王成剛2, 湯曉華2, 趙新宇1, 晏科文1, 馬曉東1

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業(yè)農村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室, 山東 青島 266071; 2. 海陽市黃海水產有限公司, 山東 煙臺 265100)

為探討星康吉鰻()精子的超微結構和形態(tài), 應用掃描電鏡和透射電鏡對星康吉鰻精子結構進行觀察。結果表明, 精子由頭部、中段和鞭毛3部分組成, 有其獨特的結構, 總長度為35.75± 1.15μm。精子頭部為新月形, 主要由細胞核構成, 細胞核內有核泡, 無頂體結構。精子頭部的質膜內包含單一的線粒體。精子頭部長為3.33±0.16um, 頭寬為1.12±0.13 um。在精子頭部的凸面上, 有4條從中段到頭端的條紋。精子中段伸出一支根, 支根位于精子的中段末端。精子中段長度為0.55±0.05 um, 支根長度為1.38±0.08 um、直徑為90.48±6.06 nm。精子尾部鞭毛細長, 鞭毛橫切面呈圓形, 無側鰭, 鞭毛的軸絲結構為“9+0”型; 一些鞭毛的末端呈現卷曲狀, 發(fā)育機制尚不明確。精子鞭毛長為31.16±1.51 μm, 鞭毛直徑為0.17±0.01 μm。通過比較分析發(fā)現精子的這些形態(tài)學特征不僅表現在星康吉鰻精子, 還表現在鰻鱺目其他屬的精子; 表明是鰻鱺目精子的共同特征。本研究揭示了星康吉鰻精子的形態(tài)結構, 為突破星康吉鰻人工繁殖技術提供了理論參考。

星康吉鰻(); 精子; 超微結構; 精子形態(tài)

在超過17.1萬種已做過分類學研究的水生動物中, 有超過3.3萬種是魚類, 其中1.98萬種是海洋魚類[1]。在大約350種魚類研究了精子的形態(tài)、活力, 精液生化等生物學特征[2]。精子將雄性單倍體染色體組運送到卵母細胞。精子的形態(tài)與精子的質量密切相關, 高質量的配子是成功受精的先決條件, 并確保獲得優(yōu)質水產養(yǎng)殖苗種[3-4]。硬骨魚類的繁殖方式和系統進化上所處的位置影響其精子結構。而且, 魚類精子的形態(tài)和超微結構在不同科之間甚至在亞科之間存在差異[5]。精子形態(tài)和超微結構研究對于鑒定魚類系統進化分類[6]以及確定冷凍保存操作引起的細胞損傷[7]等方面也具有指導作用。

星康吉鰻()隸屬于脊索動物門(Chordata)、腹鰭魚綱(Actinopterygii)、鰻鱺目(Anguil-liformes)、康吉鰻科(Congridae)、康吉鰻屬(), 系暖溫性近海底層魚類, 主要分布于中國黃渤海、東海, 以及朝鮮、日本、韓國等海域沿岸, 具有重要的生態(tài)和經濟價值, 是重要的捕撈對象[8-9]。星康吉鰻肉質鮮美、出口創(chuàng)匯潛力大, 是中國重要的經濟魚種之一[10]。2011—2017年在中國東黃海進行的底拖網調查數據顯示星康吉鰻開發(fā)率過高, 處于過度捕撈狀態(tài)[11]; 1995—2008年日本農林水產省官網數據顯示日本海域星康吉鰻漁獲量從13 000 t降到6 300 t[12]; 1985—2001年聯合國糧食及農業(yè)組織(FAO)數據顯示韓國海域星康吉鰻漁獲量從20 000 t降到8 000 t, 然后逐步恢復到20 000 t[13]。因為星康吉鰻較高的經濟價值和持續(xù)增加的捕撈力度, 東亞國家的漁政管理者、科研工作者和水產養(yǎng)殖、加工企業(yè)加大對星康吉鰻這一重要漁業(yè)資源的關注[14-15]。但發(fā)展星康吉鰻養(yǎng)殖產業(yè), 當前主要限制因素是還不能通過人工繁育技術提供玻璃鰻苗種, 亟需開展星康吉鰻繁育技術研究。

國內外對日本鰻鱺()、歐洲鰻鱺()等鰻鱺目魚類的精子超微結構進行了研究[16-20]; 星康吉鰻為體外受精魚類, 但其精子形態(tài)結構方面研究資料相對匱乏。在星康吉鰻繁育探索試驗中, 我們發(fā)現精子活力弱、受精率低的現象。精子的形態(tài)和功能存在密切的關系, 影響精子游動速度、授精能力[21-23]。本研究采用掃描電鏡和透射電鏡對星康吉鰻精子形態(tài)的超微結構進行觀察, 并和鰻鱺目魚類精子形態(tài)進行比較分析, 探討了星康吉鰻精子的形態(tài)和精細結構特征, 以期豐富星康吉鰻繁殖生物學的內容, 為提高星康吉鰻高精子活力、受精率和精子冷凍保存效果等研究提供科學依據, 并為提高其人工繁殖的成功率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗魚和精液采集

挑選體質健壯、性成熟的雄性星康吉鰻親魚30尾用于本研究。試驗魚體質量范圍84.9～2 413.7 g, 全長范圍36.1～96.2 cm, 培育水溫12～22 ℃, 鹽度27～ 32, 光照強度 200～1 000 lx, 溶氧大于≥6 mg/L, pH 為7.8～8.2, 日換水率400%～900%; 試驗所用的雄鰻培育在海陽市黃海水產有限公司的星康吉鰻親魚培育系統。

對性成熟雄性星康吉鰻親魚采用人工擠壓的方式采集精液。采精時先將實驗魚以240 mg/L的MS222輕度麻醉, 后用干凈紗布輕輕擦拭魚體生殖孔及其周圍區(qū)域, 防止體表尿液和糞便等污染。將雄鰻置于墊有干凈濕毛巾的泡沫板上, 輕輕擠壓雄鰻的生殖腺, 擠出精液, 待流出的精液呈乳白色后, 用經過消毒的干燥玻璃管吸取精液并置于潔凈的離心管, 放入2.5%的戊二醛(0.1 mol/L PBS配制, pH 7.4, 4 ℃)固定, 置于4 ℃冰箱保存, 用于電鏡制樣和實驗觀察。同時, 每批雄鰻精子采集時, 取1 μL精液, 使用過濾的海水激活精子, 快速在顯微鏡下觀察精子運動情況; 鏡檢發(fā)現精子運動率在90%以上的樣品, 該批精子用于后續(xù)電鏡試驗研究。

1.2 掃描電鏡樣品準備

分別對10尾性成熟雄鰻精液取樣, 每尾取約0.5 mL精液, 混合置于15 mL無菌的離心管中。取l mL混合精液立即注入盛有10倍體積2.5%戊二醛的離心管中, 4 ℃冰箱保存, 備用。用0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH 7.4, 4 ℃)漂洗, 再用l%的鋨酸進行固定, 經乙醇系列梯度脫水,后進行乙酸異戊酯取代乙醇。EiKo公司XD-1型二氧化碳臨界點干燥器干燥, EiKo公司IB-3型離子鍍膜儀噴金鍍膜。采用日本日立公司SN-3500掃描電鏡觀察并拍照。

1.3 透射電鏡樣品準備

將1.2所述固定精液以2 000 r/min離心10 min, 去除上清液, 經0.1 mol/L pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌, 用1%鋨酸4 ℃固定2 h。PBS緩沖液洗滌, 乙醇系列逐級脫水, Epon812環(huán)氧樹脂包埋, ULTRACUTE超薄切片機切片, 樣品經乙酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色, 采用JEOL-100cx II型透射電鏡觀察并拍照。

1.4 圖像與數據處理

選擇清晰的電鏡樣品圖像, 采用Adobe Photoshop CS3對圖像進行編輯處理, 用Microsoft Excel 2010對精子各組成部分長度進行數據相關性分析。

2 結果

2.1 掃描電鏡觀察

掃描電鏡結果顯示星康吉鰻精子由頭部(H, Head)、中段(MP, Middle piece)和鞭毛(F, Flagellum)3個部分組成, 總長度為35.75±1.15 μm。頭部微微彎曲, 中段變窄, 中段除了與鞭毛鏈接外, 末端有1個突出的短棒狀結構支根(R, Rootlet); 中段與尾部鞭毛相連, 部分精子鞭毛的末端卷曲略微呈扇形(圖1-1、1-2)。

星康吉鰻精子頭部長為3.33±0.16 μm, 頭部寬為1.12±0.13 μm, 頭部外觀呈現為新月形, 無頂體結構; 精子頭部后方逐漸變錐形至細的中段(圖1-1、1-2)。在精子頭部的凸面上, 可以看到4條從中段到頭端的條紋(S, Striae)(圖1-3)。精子的中段收縮, 長度為0.55±0.05 μm(圖1-2)。支根長為1.38±0.08 μm, 支根直徑為90.48±6.06 nm, 從中段末端靠近鞭毛的起始處向外突出形成(圖1-2)。精子的鞭毛多數是延長的線型, 鞭毛長為31.16±1.51 μm, 鞭毛的直徑為0.17±0.01 μm; 部分鞭毛呈現卷曲狀, 在卷曲情況下鞭毛從中心到外圍緊緊地卷曲著大約5～8層(圖1-1、1-2)。星康吉鰻精子的頭長、頭寬、鞭毛長、支根長的長度與鰻鱺目其他魚類精子相關指標的長度匯總見表1。

圖1 星康吉鰻精子的超微結構

注: 1. 掃描電鏡下精子全貌; 2. 掃描電鏡下精子全貌的放大; 3. 掃描電鏡下精子頭部; 4. 透射電鏡高倍下精子頭部縱切, 可見線粒體; 5. 透射電鏡下精子頭部縱切, 可見支根; 6. 透射電鏡高倍下精子頭部縱切, 可見核糖核蛋白體; 7. 透射電鏡高倍下精子頭部縱切, 可見遠端中心粒和近端中心粒; 8. 透射電鏡下鞭毛縱切; 9. 透射電鏡下鞭毛橫切面; 10. 透射電鏡下鞭毛遠端橫切面; H. 頭部; MP. 中段; F. 鞭毛; R. 支根; S.條紋; PM. 質膜; N. 細胞核; NM. 核膜; NV. 核泡; M. 線粒體; MM. 線粒體膜; Cr. 嵴; Rib. 核糖核蛋白體; PC. 近端中心粒; DC. 近端中心粒; IDA. 內動力蛋白臂; Y. 放射狀的Y形電子致密體

表1 鰻鱺目魚類精子形態(tài)特征比較

2.2 透射電鏡觀察

2.2.1 頭部微觀結構

在透射電鏡下縱切可以觀察到星康吉鰻的精子頭部外被一層不平滑的波浪形質膜(PM, Plasma membrane)包被, 質膜與致密的核(N, Nuclear)之間有較大的空隙(圖1-4、1-5)。精子核很大, 幾乎占據了精子頭部整個空間, 精核由核膜(NM, Nuclear membrane)包裹, 核內充滿電子致密物質, 含有形成細胞核的染色質物質; 細胞核內有核泡 (NV, Nuclear vacuole), 并且隨機分布在細胞核內, 核泡中含有細胞質物質, 一些細胞核含有多個核泡(圖1-4、1-5)。精子頭部的質膜內包含一個球狀體呈晶體結構, 表明它是線粒體(M, Mitochondrion), 線粒體由線粒體外膜(MM, Mitochondrial membrane)包圍, 內膜向內延伸, 形成眾多的嵴(Cr, Cristae), 基質和核糖核蛋白體(Rib, Ribonucleoprotein)分散在線粒體內(圖1-4、1-6)。整個精子頭部包括線粒體在內均覆蓋著一層質膜(圖1-4、1-5)。

2.2.2 中段微觀結構

星康吉鰻精子頭部靠近鞭毛側基部凹陷形成中段(圖1-5)。中段位于頭、尾結合處, 中段與尾部鞭毛鏈接, 并伸出一支根(圖1-5)。透射電鏡下可觀察到靠近精子頭部的近端中心粒(PC, Proximal centriole)和靠近鞭毛的遠端中心粒(DC, Distal centriole)(圖1-5、1-7)?？梢钥吹骄颖砻嫔系臈l紋(S)從近端中心粒延伸到精子頭部(圖1-5、1-6)。

2.2.3 尾部微觀結構

星康吉鰻精子的鞭毛橫切面呈圓形(圖1-8), 無側鰭, 鞭毛外由一層質膜包圍, 鞭毛的軸絲為“9+0”結構(圖1-9、1-10)。在鞭毛的橫切面上, 每兩個亞纖維上都有內動力蛋白臂(IDA, Inner dynein arm), 但沒有發(fā)現外動力蛋白臂(圖1-9)。在靠近遠端中心粒的鞭毛中, 兩個亞纖維通過放射狀的Y形電子致密體(Y, Radial Y-shape electron dense body)與質膜相連(圖1-9)。在鞭毛遠端, 兩個亞纖維變得不清楚(圖1-10)。

3 討論

魚類的精子形態(tài)和功能密切相關[23-24]。在系統分類學水平上, 硬骨魚類的精子結構顯示出高度的多樣性。硬骨魚的精子結構按照受精方式可分為兩類: 體內受精魚類, 如杜父魚科(Cottidae)、海鯽科(Embiotocidae)、花鳉科(Poeciliidae)和體外受精魚類, 如鯉科(Cyprinidae)、狼鱸科(Moronidae)、鮭科(Salmonidae); 體內受精和體外受精魚類的精子結構不同, 體外受精魚類精子的結構相對簡單, 具有卵圓形或球形的核和僅包含少量線粒體的較小的中段, 而體內受精的魚類精子具有細長的核和相對較大的中段[5]。精子形態(tài)學特征研究對于闡明不同精子結構形式的適應性進化也具有重要的參考價值并可以將精子形態(tài)與系統分類聯系起來[25-29]。

以往的研究結果揭示了鰻鱺目精子獨特的超微結構, 包括一個新月形的核、一個附著在中段的支根、“9+0”型模式的鞭毛, 以及從近端中心粒延伸的條紋(擬鞭毛)[17, 30]。星康吉鰻的精子形態(tài)特征與鰻鱺目其他魚類的比較表明它們在整體結構上非常相似,不同之處是形態(tài)大小和細胞器的位置。其他鰻鱺目魚類精子的頭長大約4～20 μm[31], 表明星康吉鰻精子頭長(3.33±0.16 μm)相對較小。星康吉鰻精子頭寬(1.12± 0.13 μm)接近于日本鰻鱺精子頭寬(1.2±0.1 μm)[17],而且星康吉鰻的頭部形狀相比鰻鱺目其他魚類更近似圓形[17, 30]。在哺乳動物各分支類群雄性動物精子頭部、中段和鞭毛的尺寸存在正相關關系[29], 但在大西洋鮭()精子頭部長度和鞭毛長度是負相關關系[24]。分析已報到的鰻鱺目魚類精子頭部和鞭毛長度數據(表1), 發(fā)現只有本研究中星康吉鰻和日本鰻鱺[17]精子頭部長度和鞭毛長度存在類似正相關關系。盡管采用切片電鏡觀察的方法很難準確測量精子形態(tài)指標, 但通過形態(tài)的基本測量仍可看出鰻鱺目魚類精子的形態(tài)差異。鰻鱺目魚類精子頭部細長的新月形與其他目魚類精子頭部近似球形的形態(tài)學上差異的機制仍不清楚。通常延長型的精子頭部是與營體內受精方式相適應的[31]。但是鰻鱺目是營體外受精的魚類, 所以鰻鱺目魚類精子頭部的奇特形態(tài)的受精生物學意義無法用上述理論解釋。我們推測鰻鱺目精子特殊形狀可能是中性進化如遺傳漂變而不是自然選擇產生的。精子頭部形狀對精子的運動能力和速率影響較大[22]。但精子頭部尺寸和生物自身基因組大小、染色體數目無關, 其決定因素還不明確。章龍珍等[19]報道了日本鰻鱺正常、成熟精子頭部的形態(tài)為圓形或近似圓形, 不成熟的精子頭部為新月形。因此要進一步揭示形態(tài)學差異的問題仍需調查和研究。魚類精子形態(tài)分析過程中采用的透射電鏡和掃描電鏡等分析技術, 涉及到精液樣品稀釋溶液固定或涂片/干燥、染色等操作步驟, 盡管采用標準的實驗分析流程, 仍可能會得到一些改變精子形態(tài)的人工制品; 今后研究中需進一步采用透射電鏡、掃描電鏡和近年來新發(fā)展的、在魚類精子形態(tài)研究中可實際應用的精子形態(tài)分析技術如TruMorph?技術結合計算機輔助精子形態(tài)分析[32]對鰻鱺目魚類精子準確的三維結構進行評價。

在日本鰻鱺, 研究表明單一的線粒體位于精子頭部的前端[16, 33]。在本研究, 一個較大的線粒體位于星康吉鰻精子頭部前端, 這與日本鰻鱺精子線粒體位置的研究結果一致[16, 20, 33], 以及與鰻鱺目的新澳鰻鱺、大鰻鱺[34]和幾內亞副康吉鰻()、小眼蟒鰻()[35]的研究結果一致。而且, 隸屬于海鰻科的海鰻精子頭部的線粒體位置也是類似鰻鱺科[17]。因此, 眾多研究表明單個線粒體位于精子頭部前端是鰻鱺目精子的共同特征。星康吉鰻精子中段的支根長約為1.38±0.08 μm, 與日本鰻鱺精子支根長(1.3±0.1 μm)和歐洲鰻鱺精子支根長(1.2±0.3 μm)較為相近[17, 30]; 星康吉鰻精子的支根長度位于鰻鱺目魚類精子支根長度范圍內(表1), 但當前有關精子支根的生理功能仍不清楚。

迄今, 所有分析過的鰻鱺目魚類精子都有“9+0”型鞭毛模式, 鞭毛缺少中間的一對中央微管。本研究中星康吉鰻精子的鞭毛也是“9+0”結構。星康吉鰻精子鞭毛長度(31.16±1.51 μm)與日本鰻鱺精子鞭毛長度(29±6.9 μm)、大鰻鱺精子鞭毛長度(28～44 μm)相近[17, 34](表1)。本研究中發(fā)現在星康吉鰻精子頭部有4條從近端中性粒向前方延伸的條紋(擬鞭毛)。有研究表明日本鰻鱺精子近端中心粒的這種延伸條紋(擬鞭毛)在中心粒-鞭毛復合體與精子頭部的連接中起著穩(wěn)定作用[16, 34, 36]。線粒體在是產生三磷酸腺苷ATP (Adenosine triphosphate, ATP)的主要細胞器, 而ATP是精子在有氧條件下運動的能量來源[37]。ATP通過精子鞭毛中的ATP酶(動力蛋白)水解, 由此釋放出的能量用來移動鞭毛[38]。這種ATP從線粒體到鞭毛的轉運或是通過簡單的擴散或主要通過細胞生化途徑中的磷酰肌酸穿梭和代謝分室作用進行的[39-40]。在大多數硬骨魚精子中, 線粒體通常位于靠近鞭毛基部的中段[41-43], 因為距離相近, 使這兩種ATP能量傳遞系統都能發(fā)揮功能。但是大多數鰻鱺目魚類精子線粒體位于精子頭部的前端, 距離鞭毛遠, 因此ATP的運輸可能較難用這些運輸系統來解釋。

我們觀察到的星康吉鰻精子條紋結構可能在ATP運輸中發(fā)揮作用, 從而為驅動鞭毛運動提供能量, 與精子在運動過程對較多能量的需求相適應, 與精子的泳動速率有關。有研究表明鞭毛軸絲動力蛋白臂利用ATP能量輔助鞭毛軸絲自旋彎曲[44]。類似的條紋在日本鰻鱺精子結構中被認為是“管狀結構”, 參與運輸ATP[17]。因此, 我們推測鰻鱺目魚類精子通過這種管狀結構條紋發(fā)生的ATP轉運比通過細胞質更有效。但國內學者在日本鰻鱺精子結構的研究中沒發(fā)現精子頭部的這種延伸條紋結構[19-20]。魚類精子線粒體的數目不一致, 從一個到幾十個不等, 如褐石斑魚()精子中有6～9個線粒體[45]、秦嶺細鱗鮭()精子中有1個線粒體[23]。線粒體作為精子能量的一個來源, 線粒體的數目可能是一個關鍵因素影響精子泳動速度和時間, 并在魚類受精過程起到重要作用[46]。在星康吉鰻繁育試驗中, 發(fā)現存在精子活力弱, 受精率低的現象, 可能與精子中只有唯一的線粒體有關。

在當前研究中作者觀察到了星康吉鰻部分精子有盤繞的鞭毛形態(tài), 推測這些卷曲的鞭毛可能是不成熟的精子, 因為這種更緊湊的形狀使它們更容易容納在星康吉鰻精巢的有限空間中。有研究表明在部分日本鰻鱺精子鞭毛末端也存在形狀近似的環(huán)狀結構, 該結構容易與其他物質粘連, 便于完成受精[20]。但在本研究中我們無法明確這些卷曲鞭毛的發(fā)育機制及生理作用。在多種魚類精子尾部鞭毛發(fā)現具有側鰭結構, 但星康吉鰻精子尾部無側鰭結構。關于魚類精子鞭毛側鰭結構能否改善精子游泳速度和提高受精率尚無定論。通過上述的比較分析, 星康吉鰻精子結構相對其他目魚類的精子結構簡單, 有可能作為研究魚類精子超微結構和形態(tài)的理想實驗材料, 筆者認為深入解析這些有差異的結構有助于了解這些結構的來源和進化上的意義及其生理作用, 并為提高星康吉鰻精子活力和受精率提供參考。

學者們一直以來認為鰻鱺目、海鰱目(Elopiformes)、背棘魚目(Notacanthiformes)屬于同一總目即海鰱總目(Elopomorpha)[47], 該分類是界定在魚類解剖學和骨骼學特征的基礎上, 并且另一最顯著的特征是都出現了柳葉狀幼體[48]。此外, 精子的主要特征即新月形頭部、一個支根、“9+0型”模式的鞭毛, 不僅在鰻鱺目中發(fā)現, 而且在海鰱目[35]和背棘魚目[49]中也有發(fā)現。但是有例外, 鰻鱺目中的海鱔科(Muraenidae)的精子有一個圓形的細胞核, 細胞核后方有一些線粒體, 無支根[50]。MATTEI等[35]指出精子之間的形態(tài)學特征的相似性可能對研究海鰱總目魚類的進化具有重要意義。JAMIESON[31]隨后將精子的形態(tài)特征研究疊加到海鰱總目魚類的系統發(fā)育樹上, 結果顯示出與之前的分類情況有很好的一致性。這些研究發(fā)現表明, 除了傳統的魚類解剖學和骨骼學特征指標外, 精子的形態(tài)結構特征也越來越多地與海鰱總目魚類的種間分化密切相關。我們當前的分析總結了多個鰻鱺目魚類的形態(tài)學特征研究文獻(包括表1),對進一步研究鰻鱺科魚類或者海鰱總目魚類的進化和分類學也具有重要作用。

4 結論

本研究以黃海海域星康吉鰻精子為研究對象, 采用掃描電鏡和透射電鏡揭示了星康吉鰻精子超微結構的詳細特征。星康吉鰻精子由頭部、中段和鞭毛3部分組成, 具有鰻鱺目精子獨特的超微結構特征。星康吉鰻精子頭部為新月形, 主要由細胞核構成, 無頂體結構; 精子中段伸出一支根, 支根位于精子的中段末端; 精子尾部鞭毛細長, 鞭毛橫切面呈圓形, 無側鰭, 鞭毛的軸絲結構為“9+0”型。星康吉鰻精子超微結構研究增加了我們對其繁殖生物學的理解, 并為突破星康吉鰻人工繁育技術提供了理論參考。

[1] MORA C, TITTENSOR D P, ADL S, et al. How many species are there on earth and in the ocean?[J]. PLoS Biology, 2011, 9: e1001127.

[2] ALAVI S M H, HATEF A, BUTTS I A E, et al. Some recent data on sperm morphology and motility kinetics in Atlantic cod (L.)[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2021, 47(2): 327-338.

[3] HE W C, SUN Y, QIANG J X, et al. Structural abnormalities of spermatozoa in triploid gynogenetic crucian carp ()[J]. Frontiers in Genetics, 2021, 12: 783014.

[4] BOBE J, LABBé C. Egg and sperm quality in fish[J]. General and Comparative Endocrinology, 2010, 165: 535-548.

[5] ALAVI S M H, COSSON J J, COWARD K, et al. Fish spermatology[M]. Oxford: Alpha Science Ltd, 2008: 1-61.

[6] QUAGIO-GRASSIOTTO I, BAICERE-SILVA C M, OLIVEIRA S J C, et al. Spermiogenesis and sperm ultrastructure as sources of phylogenetic characters. The example of characid fishes (Teleostei: Characiformes)[J]. Zoologischer Anzeiger, 2020, 289: 77-86.

[7] FIGUEROA E, LEE-ESTEVEZ M, VALDEBENITO I, et al. Effects of cryopreservation on mitochondrial function and sperm quality in fish[J]. Aquaculture, 2019, 511: 634190.

[8] 張春光. 中國動物志: 硬骨魚綱·鰻鱺目·背棘魚目[M]. 北京: 科學出版社, 2010: 199-203. ZHANG Chunguang. Chinese animal records: Actinopterygii Anguilliformes Notacanthiformes[M]. Beijing: Science Press, 2010: 199-203.

[9] 陳大剛, 張美昭. 中國海洋魚類(上卷)[M]. 青島: 中國海洋大學出版社, 2015: 176-188. CHEN Dagang, ZHANG Meizhao. Marine fishes of China (Volume 1)[M]. Qingdao: China Ocean University Press, 2015: 176-188.

[10] 楊浩, 史寶, 牛化欣, 等. 星康吉鰻生物學與生態(tài)學的研發(fā)現狀與展望[J]. 海洋科學, 2020, 44(6): 152-158. YANG Hao, SHI Bao, NIU Huaxin, et al. Advances and future prospects inresearch[J]. Marine Sciences, 2020, 44(6): 152-158.

[11] 麻秋云, 牟秀霞, 任一平, 等. 東、黃海星康吉鰻生長、死亡和單位補充量漁獲[J]. 水產學報, 2018, 42(6): 881-888. MA Qiuyun, MU Xiuxia, REN Yiping, et al. The growth, mortality and yield per recruitment of white- spotted conger () in the Yellow Sea and the East China Sea[J]. Journal of Fisheries of China, 2018, 42(6): 881-888.

[12] GORIE S, TANDA M, NAGASWA K. Movement and growth of whitespotted congerin the Eastern Seto Inland Sea, Japan[J]. Aquaculture Science, 2010, 58(2): 233-242.

[13] KUROGI H, MOCHIOKA N, OKAZAKI M, et al. Discovery of a spawning area of the common Japanese congeralong the Kyushu-Palau Ridge in the western North Pacific[J]. Fisheries Science, 2012, 78: 525-532.

[14] KAWAZU M, KAMEDA T, KUROGI H, et al. Biological characteristics ofduring the initial stage of spawning migration in the East China Sea[J]. Fisheries Science, 2015, 81: 663-671.

[15] LI M, JIAO Y, BI R J, et al. Population status and distribution of whitespotted conger () in Yellow Sea: An important migratory species along coastal China with limited data[J]. Fisheries Oceanography, 2020, 29: 32-45.

[16] GWO J C, GWO H H, CHANG S L. The spermatozoon of the Japanese eel,(Teleostei, Anguilliformes Anguillidae)[J]. Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1992, 24(4): 571-574.

[17] OKAMURA A, ZHANG H, YAMADA Y, et al. Re-examination of the spermatozoal ultrastructure of eels: observations of the external morphology of spermatozoa in three species[J]. Journal of Fish Biology, 2000, 57: 161-169.

[18] MARCO-JIMéNEZ F, PéREZ L, VIUDES D C M P, et al. Morphometry characterisation of European eel spermatozoa with computer-assisted spermatozoa analysis and scanning electron microscopy[J]. Theriogenology, 2006, 65: 1302-1310.

[19] 章龍珍, 喬振國, 莊平, 等. 人工催熟日本鰻鱺精子的顯微和超微結構[J]. 水產學報, 2006, 30(5): 611-617. ZHANG Longzhen, QIAO Zhenguo, ZHUANG Ping, et al. Microstructure and ultrastructure of spermatozoa ofartificially induced by extraneous hormone[J]. Journal of Fisheries of China, 2006, 30(5): 611-617.

[20] 張濤, 柳凌, 張潔明, 等. 日本鰻鱺精卵的超微結構以及受精過程觀察[J]. 水生生物學報, 2010, 34(4): 769-778. ZHANG Tao, LIU Ling, ZHANG Jieming, et al. Ultrastructure of spermatozoa and fertilized eggs ofand observation on the fertilization process[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2010, 34(4): 769-778.

[21] ANDERSON M J, DIXSON A F. Sperm competition: motility and the midpiece in primates[J]. Nature, 2002, 416(6880): 496.

[22] MALO A F, GOMENDIO M, GARDE J, et al. Sperm design and sperm function[J]. Biology Letters, 2006, 2: 246-249.

[23] GUO W, SHAO J, LI P, et al. Morphology and ultrastructure ofspermatozoa by scanning and transmission electron microscopy[J]. Tissue and Cell, 2016, 48: 321-327.

[24] GAGE M J G, MACFARLANE C, YEATES S, et al. Relationships between sperm morphometry and sperm motility in the Atlantic salmon[J]. Journal of Fish Biology, 2002, 61: 1528-1539.

[25] ROWLEY A, LOCATELLO L, KAHRL A, et al. Sexual selection and the evolution of sperm morphology in sharks[J]. Journal of Evolutionary Biology, 2019, 32(10): 1027-1035.

[26] ROLDAN R S R, TEVES M E. Understanding sperm physiology: proximate and evolutionary explanations of sperm diversity[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2020, 518: 110980.

[27] MEISNER A D, KLAUS A V, O’LEARY M A. Sperm head morphology in 36 species of artiodactylans, perissodactylans, and cetaceans (Mammalia)[J]. Journal of Morphology, 2005, 263(2): 179-202.

[28] ROLDAN E R S. Sperm competition and the evolution of sperm form and function in mammals[J]. Reproduction in Domestic Animal, 2019, 54(4): 14-21.

[29] GAGE M J G. Mammalian sperm morphometry[J]. Proceedings of the Royal Society of London, 1998, 265: 97-103.

[30] MüLLER T, BASKA F, NIKLESZ C, et al. The testis histology of artificially maturated European eel (L.) at the end of sexual maturation, and spermatozoa ultrastructure in freshwater rearing[J]. Acta Biologica Hungarica, 2005, 56(1/2): 169-172.

[31] JAMIESON B G M. Fish evolution and systematics: Evidence from spermatozoa[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 1991: 122-131.

[32] CALDEIRA C, HERNáNDEZ-IBáNEZ S, VENDRELL A, et al. Characterisation of European eel () spermatozoa morphometry using Trumorph tool in fxed and non-fxed samples[J]. Aquaculture, 2022, 553: 738047.

[33] MIURA T, YAMAUCHI K, NAGAHAMA Y, et al. Induction of spermiogenesis in male Japanese eel,, by a single injection of human chorionic gonadotropin[J]. Zoological Science, 1991, 8: 63-73.

[34] TODD P. Ultrastructure of spermatozoa and spermiogenesis in New Zealand freshwater eels (Anguillidae)[J]. Cell and Tissue Research, 1976, 171: 221-232.

[35] MATTEI C, MATTEI X. The functional anatomy of the spermatozoon[M]. Oxford: Pergamon Press, 1974: 211-221.

[36] GIBBONS B H, GIBBONS I R, BACCETTI B. Structure and motility of the 9+0 flagellum of eel spermatozoa[J]. Journal of Submicroscopic Cytology, 1983, 15: 1-20.

[37] BILLARD R, COSSON J, LINHART O. Changes in the flagellum morphology of intact and frozen/thawed Siberian sturgeon(Brandt) sperm during motility[J]. Aquaculture Research, 2000, 31: 283-287.

[38] MOHRI H. Amino-acid composition of ‘Tubulin’ consisting microtubules of sperm flagella[J]. Nature, 1968, 216: 1053-1054.

[39] NEVO A C, RIKMENSPOEL R. Diffusion of ATP in sperm flagella[J]. Journal of Theoretical Biology, 1970, 26: 11-18.

[40] SHAPIRO B M, TOMBES R M. A biochemical pathway for a cellular behavior: pHi, phosphorylcreatine shuttles, and sperm motility[J]. Bioessays, 1985, 3(3): 100-103.

[41] 劉琨, 劉長琳, 陳四清, 等. 綠鰭馬面鲀精子的超微結構[J]. 海洋科學, 2017, 41(8): 40-45.LIU Kun, LIU Changlin, CHEN Siqing, et al. Ultrastructure of spermatozoa of[J]. Marine Sciences, 2017, 41(8): 40-45.

[42] DUMORNé K, VALDEBENITO I, RISOPATRON J, et al. Morphology and ultrastructure of pink cusk-eel (, Schneider 1801) spermatozoa by scanning and transmission electron microscopy[J]. Tissue and Cell, 2018, 54: 26-29.

[43] ULLOA-RODRíGUEZ P, CONTRERAS P, DUMORNé K, et al. Sperm morphology and ultrastructure of Patagonian blenny ()[J]. Tissue and Cell, 2019, 57: 66-69.

[44] MARICCHIOLO G, GENOVESE L, LAURá R, et al. Fine structure of spermatozoa in the common pandora (Linnaeus, 1758) (Perciformes, Sparidae)[J]. Histology and Histopathology, 2004, 19: 1237-1240.

[45] KIM S H, LEE C H, SONG Y B, et al. Ultrastructure of late spermatids and spermatozoa during spermiogenesis in longtooth grouperfrom Jeju, Korea[J]. Tissue and Cell, 2013, 45(4): 261-268.

[46] LAHNSTEINER F, PATZNER R A. Fine-structure of spermatozoa of 2 marine teleost fishes, the red mullet,(mullidae) and the white bream,(sparidae) [J]. Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1995, 27(2): 259-266.

[47] GREENWOOD P H. Notes on the anatomy and classification of elopomorph fishes[J]. Bulletin Museum of Comparative Zoology, 1977, 32: 65-102.

[48] SMITH D G. Ontogeny and systematics of fishes[M]. New Hampshire: Allen Press, 1984: 94-102.

[49] MATTEI X. The flagellar apparatus of spermatozoa in fish. Ultrastructure and Evolution[J]. Biology of the Cell, 1988, 63(2): 151-158.

[50] BOISSON C, MATTEI X, MATTEI C. Le flagelle de type 9+0 et la remarquable extension du centriole proximal dans les spermatides de(Bloch, 1795) (Poisson Muraenidae)[J]. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences (Paris), 1967, 264(25): 2909-2912.

A study on sperm ultrastructure in the whitespotted conger,

SHI Bao1, WANG Cheng-gang2, TANG Xiao-hua2, ZHAO Xin-yu1, YAN Ke-wen1, MA Xiao-dong1

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071, China; 2. Haiyang Yellow Sea Aquatic Product Co., Ltd., Yantai 265100, China)

Whitespotted conger,, is one of the most valuable fishery resources in the seas around China, Korea, and Japan. Thus, it has become important to protect this species, as the annual commercial catch is decreasing. Despite being an important resource for East Asian countries, little is known about the reproductive biologyof. Therefore, only very limited information is available regarding the reproductive characteristics of male. Teleost sperm is very morphologically diverse, particularly the sperm head shape; the shape, location, and number of mitochondria, and the structure and length of the flagellum. This study investigated the ultrastructure and morphology ofsperm by scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). The SEM and TEM images revealed that the sperm were composed of a head, a middle piece, and a flagellum..sperm hada unique structure except for the common sperm characteristics of teleost. The total mean length was 35.75±1.15 μm. The head of the spermatozoon was electron-dense and contained chromatin material forming the nucleus. The nucleus was asymmetrically shaped along the longitudinal axis. We observed nuclear vacuoles in the nucleus, which were not fixed in size or position. The head had no acrosomal structure. A single spherical mitochondrion was located along the longitudinal center line of the nucleus but was offset slightly to one side. The mitochondrion was surrounded by an outer mitochondrial membrane. The inner mitochondrial membrane extended inward, forming rich cristae. Ribonucleoprotein and matrix were scattered in the mitochondrion. The mean head length was 3.33±0.16 μm, and the mean head width was 1.12±0.13 μm. Four striae ran from the caudal portion to the cephalad on the convex surface of the head. Additionally, four striae arose from the proximal centriole. The middle piece was constricted and projected a short rootlet located at the end of the middle piece. The mean middle piece length was 0.55±0.05 μm. The mean length of the rootlet was 1.38±0.08 μm, and the mean diameter was 90.48±6.06 nm. The proximal centriole in the middle piece was located near the caudal portion of the sperm head. The distal centriole was located near the flagellum. A cross-section oftheflagellum was thin and appeared round with no side fin. Inner dynein arms were seen on the two subfibrils of each filament on a cross-section of the flagellum, but no outer dynein arms were seen. The two subfibrils of the flagellum near the distal centriole were linked to the plasma membrane by radial Y-shape electron-dense bodies. The flagellum was arranged in a 9+0 axonemal pattern. Some flagella were coiled, but the developmental mechanism was unclear. These flagella were coiled tightly, with about five strata counted from the center to the periphery. The mean flagellum length was 31.16±1.51 μm, and the mean flagellum diameter was 0.17±0.01 μm. These features were seen inand are also evident in other species of Anguilliformes. These findings suggest that these features are common to Anguilliformes. This study revealed the morphological structure of.sperm to improve our understanding of the reproductive biology of.and provide a theoretical basis for developing methods to artificially reproduce..

; sperm; ultrastructure; spermic shape

Dec. 15, 2022

[The Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS, No. 20603022021004, 20603022023023; Key Research and Development Program of Shandong Province, No. 2021LZGC028; National Key Research and Development Program of China, No. 2019YFD0900503; China Agriculture Research System of MOF and MARA, No. CARS-47]

S962

A

1000-3096(2023)10-0112-09

10.11759/hykx20221215001

2022-12-15;

2023-03-30

中國水產科學研究院黃海水產研究所基本科研業(yè)務費資助項目(20603022021004, 20603022023023); 山東省重點研發(fā)計劃項目(2021LZGC028); 國家重點研發(fā)計劃項目(2019YFD0900503); 國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系資助項目(CARS-47)

史寶(1979—), 男, 副研究員, 主要從事海水魚類繁育理論與增養(yǎng)殖技術研究, E-mail: shibao@ysfri.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)