胃癌診斷生物學(xué)標(biāo)志物的研究進(jìn)展

孟文婷 王蔚虹

北京大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科（100034）

胃癌是目前世界上發(fā)病率較高的腫瘤之一，2020 年全球胃癌新確診病例數(shù)>100 萬例[1]，其中中國胃癌發(fā)病例數(shù)約占世界病例數(shù)的50%[2]，而胃癌預(yù)后與治療時(shí)機(jī)息息相關(guān)，早期診斷和治療對提高胃癌患者的生存率至關(guān)重要。早期胃癌患者通常無特異性癥狀，胃癌診斷主要依賴胃鏡和組織病理學(xué)檢查，但操作過程復(fù)雜且費(fèi)用較高，限制了其在大規(guī)模無癥狀人群中的篩查和普及[3]。因此，探索可應(yīng)用于胃癌篩查的無創(chuàng)或微創(chuàng)診斷方法對早期發(fā)現(xiàn)胃癌尤為重要。

生物學(xué)標(biāo)志物（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)）能反映人體內(nèi)生理、生物化學(xué)、免疫等多方面改變，其中部分來源于惡性腫瘤細(xì)胞或由腫瘤組織刺激人體所產(chǎn)生，對腫瘤具有提示意義[4]。血液、胃液、唾液、尿液等均可作為胃癌生物學(xué)標(biāo)志物的來源，本文對部分胃癌診斷生物學(xué)標(biāo)志物的研究進(jìn)展作一綜述。

一、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）

CEA 是存在于消化道腫瘤細(xì)胞與胚胎結(jié)腸上皮細(xì)胞的一種糖蛋白，一般只在胎兒期存在，若人體細(xì)胞發(fā)生癌變，則可以重新分泌。健康成人血液CEA 濃度＜2.5 μg/L，CEA 異常升高時(shí)提示有消化系統(tǒng)腫瘤（包括結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌等）的風(fēng)險(xiǎn)。作為廣譜生物學(xué)標(biāo)志物，CEA 升高也可見于肺癌、乳腺癌等。研究發(fā)現(xiàn)CEA 過度表達(dá)發(fā)生于包括胃癌在內(nèi)的60%的腫瘤[5]，且在腫瘤早期診斷的敏感性和特異性均不高，對于胃癌篩查價(jià)值有限。

二、糖類抗原（carbohydrate antigen,CA）72-4

CA72-4 是一種高分子質(zhì)量的黏液糖蛋白，對胃癌也具有提示意義。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)應(yīng)用CA72-4 診斷胃癌的敏感性為49%，特異性為96%[6]。對該腫瘤標(biāo)志物的連續(xù)監(jiān)測、聯(lián)合檢測有助于提高診斷的敏感性，可應(yīng)用于胃癌篩查。但該生物學(xué)標(biāo)志物在卵巢癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌中也有一定的陽性率。

三、DNA

DNA 是生物遺傳信息的載體，腫瘤DNA 攜帶腫瘤細(xì)胞的遺傳學(xué)特征，DNA 豐度和相關(guān)特征（基因突變、甲基化）等可作為腫瘤篩查的重要指標(biāo)。

1. 循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）：cfDNA 是細(xì)胞釋放到血漿中的降解DNA 片段，可來源于正常組織或腫瘤，其中由腫瘤細(xì)胞釋放的cfDNA又稱為循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）。cfDNA 豐度、甲基化水平均對腫瘤有提示意義，有望作為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

①cfDNA 豐度：腫瘤組織增殖迅速，故腫瘤患者外周血中cfDNA 豐度遠(yuǎn)高于健康人群。Kim 等[7]以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）方法檢測30 例胃癌患者和34 名健康對照者血漿cfDNA 水平，發(fā)現(xiàn)健康對照者、早期和進(jìn)展期胃癌患者血漿中可檢測到的cfDNA 豐度平均值分別為（79.78±8.12）、（106.88±12.40）和（120.23±10.08）μg/L。若取90 μg/L 為臨界值，cfDNA 作為胃癌篩查生物學(xué)標(biāo)志物的ROC曲線下面積（AUC）為0.991，敏感性、特異性分別為96.67%、94.11%。

實(shí)時(shí)定量PCR 是目前常用的DNA 定量檢測方法，但DNA 提取、純化和多次核酸擴(kuò)增均可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性?；谥ф淒NA-Alu檢測技術(shù)是定量測定cfDNA的新方法，分支DNA 依據(jù)固相雜交可結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)志物，以便于檢測靶標(biāo)。Alu 重復(fù)序列是基因組中重復(fù)次數(shù)最多的序列，檢測到的Alu 數(shù)量與cfDNA 豐度密切相關(guān)。該法無需核酸擴(kuò)增，敏感性和準(zhǔn)確性較高。Qian 等[8]以支鏈DNA-Alu 檢測技術(shù)定量檢測124 例胃癌患者、64 例胃良性疾病患者、92 名健康者的cfDNA水平，結(jié)果顯示健康者、胃良性疾病患者、胃癌患者的cfDNA 平均水平分別為181.90、244.42、1475.92 μg/L，胃癌患者cfDNA 水平顯著高于健康者，進(jìn)一步驗(yàn)證了cfDNA 水平有望成為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。然而，cfDNA 在血液循環(huán)中并不穩(wěn)定，代謝途徑尚未被完全闡明；且特異性不高，在炎性疾病、心血管疾病中水平也會(huì)有所升高。cfDNA 的這些特點(diǎn)均限制了其臨床應(yīng)用。

②cfDNA 甲基化：DNA 甲基化指在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基選擇性添加到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶，屬于表觀遺傳學(xué)改變。其在基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期、DNA 修復(fù)、凋亡和特定的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。啟動(dòng)子異常甲基化被認(rèn)為是胃癌潛在的分子標(biāo)志。Wang等[9]通過定量甲基化特異性PCR 法檢測82例胃癌患者、46 例慢性萎縮性胃炎患者和40 名健康對照者血清中不同基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)胃癌患者UCHL1、FLNC、THBS1 和DLEC1 啟動(dòng)子的甲基化水平明顯高于其他組別。Xue 等[10]發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中RASSF10 啟動(dòng)子的甲基化水平顯著高于健康對照者。說明血清UCHL1、FLNC、THBS1 和DLEC1、RASSF10 啟動(dòng)子甲基化有望作為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。部分抑癌基因甲基化也參與胃癌的發(fā)生。Pimson 等[11]發(fā)現(xiàn)胃癌患者血循環(huán)中抑癌基因PCDH10和RASSF1A甲基化陽性率高于健康人群，提示血漿PCDH10和RASSF1A 甲基化同樣有望成為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物之一。

部分細(xì)胞周期相關(guān)基因甲基化同樣參與胃癌的發(fā)生。Septin9 是一種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，參與細(xì)胞分裂，Septin9 基因甲基化與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)。王炳龍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在2128例受檢者(包括結(jié)直腸癌、胃癌、消化系統(tǒng)良性病變患者和健康受試者)中采用PCR熒光法檢測血漿Septin9基因甲基化程度，胃癌患者Septin9 基因甲基化的陽性率為43.71%，敏感性、特異性分別為43.71%、95.12%。說明Septin9基因甲基化對胃癌具有診斷價(jià)值。

2.胃液DNA：胃液中存在豐富的胃黏膜細(xì)胞，但胃液酸性較強(qiáng)（pH 值＜3），胃液DNA 易被降解，常用胃灌洗液或外泌體檢測胃液DNA[13]。胃灌洗液指胃鏡檢查時(shí)用0.9%NaCl溶液灌洗胃黏膜，得到內(nèi)含大量胃黏膜脫落細(xì)胞和腫瘤脫落細(xì)胞。外泌體是由細(xì)胞分泌到胞外的囊泡，攜帶來源細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，可通過超速離心法、聚合物沉淀法等方法分離得到[14]。Watanabe 等[15]胃癌細(xì)胞株的研究從31 個(gè)靶基因中篩選出6 個(gè)甲基化頻率較高的基因，分別為MINT25、RORA、GDNF、ADAM23、PRDM5、MLF1，其中，MINT25 甲基化對胃癌的診斷價(jià)值最高，診斷胃癌的AUC、敏感性和特異性分別為0.961、90%和96%。Yamamoto 等[16]對胃癌細(xì)胞株外泌體和胃癌患者胃灌洗液的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BARHL2 基因甲基化可以區(qū)分胃癌患者與健康個(gè)體。其中，外泌體BARHL2甲基化診斷胃癌的AUC 為0.923，敏感性、特異性分別為90%、100%。

四、非編碼RNA

微RNA（microRNA, miRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）等非編碼RNA 通過調(diào)控基因表達(dá)、參與體內(nèi)生理和腫瘤等病理過程，其不易降解、穩(wěn)定性佳，有潛力作為腫瘤診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

1. MiRNA：MiRNA 是由20～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程。MiRNA 具有組織特異性，在腫瘤中存在異常表達(dá)，有潛力作為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

①血漿miRNA：Tsujiura 等[17]分析了69 例胃癌患者和30 名健康對照者血漿中miRNA 水平，發(fā)現(xiàn)血漿miR-17-5p、miR-21、miR-106a和miR-106b水平在胃癌患者中表達(dá)上調(diào)，而血漿let-7a 水平在胃癌患者中表達(dá)下調(diào)（表1），血漿miR-106b 、miR-106a 聯(lián)合let-7a 水平診斷胃癌的AUC 分別為0.721、0.879。另有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者較健康人群血清中miR-206 表達(dá)下調(diào)，其診斷胃癌的敏感性、特異性分別為78%、86%[18]；胃癌患者血漿中miR-376c 表達(dá)上調(diào)，其敏感性、特異性分別為71.0%、78.0%[19]。聯(lián)合多種miRNA 檢測可提高其對胃癌的診斷效能。Zhu 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，5 種血漿miRNA（miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p）在所有類型胃癌患者中均表達(dá)升高。

表1 在胃癌患者中差異表達(dá)的miRNA和蛋白

②胃液miRNA：多項(xiàng)研究[21-23]以實(shí)時(shí)定量PCR 和測序法測定99例健康或良性胃疾病、42例胃癌患者胃液miRNA，發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃液中miR-21、miR-106a、miR-129-1-3p、miR-129-2-3p、miR-421的表達(dá)均下降（表1），其中miR-21和miR-106a診斷價(jià)值最佳。MiR-21診斷胃癌的AUC 為0.969，敏感性、特異性分別為85.7%、97.8%；miR-106a 診斷胃癌的AUC為0.871，敏感性、特異性分別為73.8%、89.3%。

③唾液miRNA：胃癌患者唾液中同樣存在miRNA 的差異表達(dá)，其中有6 種miRNA（miR-140-5p、miR-374a、miR-454、miR-15b、miR-28-5p 和miR-301a）下調(diào)（表1），其診斷胃癌的AUC波動(dòng)于0.79～0.88[24]。

④尿液miRNA：尿液中miRNA 可能來源于循環(huán)游離miRNA 或由泌尿系統(tǒng)細(xì)胞分泌，可以單體形式穩(wěn)定存在、以蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合體存在，或存在于外泌體中。Kao等[25]在胃癌患者尿液的研究中發(fā)現(xiàn)，即便在很少的尿液標(biāo)本中，胃癌患者尿液中miR-21-5p 水平明顯升高；而當(dāng)切除胃癌組織后，尿液標(biāo)本中miR-21-5p 水平明顯下降，提示尿液miR-21-5p 有期望成為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物之一。Iwasaki 等[26]在197 例胃癌患者和175 名健康人的尿液研究中，發(fā)現(xiàn)胃癌患者尿液中存在22 種差異表達(dá)的miRNA，其中尿液miR-6807-5p 和miR-6856-5p 在胃癌患者中呈高表達(dá)（表1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可單獨(dú)作為診斷標(biāo)志物，其診斷胃癌的AUC分別為0.867、0.707。若聯(lián)合尿液miR-6807-5p、miR-6856-5p水平和幽門螺桿菌感染陽性，其識(shí)別胃癌的AUC為0.885，敏感性、特異性分別為76.9%、88.9%。

2.CircRNA：CircRNA 呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因表達(dá)，可影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，在許多癌癥中均存在差異表達(dá)，有潛力作為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物之一。

①循環(huán)circRNA：Sun 等[27]采用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)檢測血漿circRNA 水平，在45 例胃癌患者和17 名健康對照者中，發(fā)現(xiàn)胃癌患者血漿中circ_0000520 表達(dá)下調(diào)，其診斷胃癌的AUC 為0.8974，敏感性、特異性分別為82.35%、84.44%。Shao 等[28]發(fā)現(xiàn)39 例胃癌患者血漿中circ_0065149 水平顯著低于41 名健康個(gè)體，其診斷胃癌的AUC 為0.64，敏感性、特異性分別為48.7%、90.2%。

②胃液circRNA：胃液中一些circRNA 可作為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。Shao 等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中有308種circRNA較正常組織存在差異表達(dá)，其中107種circRNA 表達(dá)上調(diào)、201種表達(dá)下調(diào)。排名前十位表達(dá)上調(diào)的circRNA分別為hsa_circ_0035445、_0003789、_0063809、_0074362、_0006282、_0011107、_0084606、_0005556、_0050547、_0006470，前十位表達(dá)下調(diào)的為hsa_circ_0007099、_0001897、_0007707、_0008832、_0001546、_0002089、_0004680、_0000154、_0004458、_0008394。此外，hsa_circ_0014717可以穩(wěn)定存在于胃液，便于臨床檢測，在77.2%（74/96）的受檢胃癌組織中均表達(dá)下調(diào)，有望作為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

五、蛋白

蛋白是組成人體細(xì)胞、組織的重要組分。不同于基因組的相對靜態(tài)，蛋白的基因表達(dá)具有一定變化，在生理和腫瘤等病理?xiàng)l件下表達(dá)不同，有潛力作為胃癌篩查的生物學(xué)標(biāo)志物。

1.血漿蛋白：胃癌患者存在血漿蛋白的差異表達(dá)。Zhou等[30]采用液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽法，發(fā)現(xiàn)胃癌患者中存在差異表達(dá)的11 種血漿蛋白（其中P08493、Q9H939、A0A087WTY6、A0A0G2JMC9、P14207、Q86UD1、Q8NBP7 表達(dá)上調(diào)，而P00441、P16157、P62979、A0A2R8Y7X9 表達(dá)下調(diào)；表1），其診斷胃癌的AUC 波動(dòng)于0.573～0.813，敏感性為46.7%～93.3%，特異性為53.3%～100%。若聯(lián)合這11 種血漿蛋白，其診斷胃癌的AUC 為0.711，敏感性和特異性分別為66.7%和86.7%。

此外，研究發(fā)現(xiàn)癌癥患者存在一些特異性血清學(xué)自身抗體，這些抗腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體一般采用血清蛋白質(zhì)組分析法進(jìn)行檢測，也可用于腫瘤篩查[31]。Liu 等[32]發(fā)現(xiàn)胃癌患者自身抗體14-3-3 ζ 陽性率顯著高于健康對照者（17.6%對2.4%），提示14-3-3 ζ 可作為胃癌的血清學(xué)標(biāo)志物。Qin等[33]采用免疫分析法檢測465例胃癌患者和465名健康對照者血清抗14-3-3 ζ 抗體，驗(yàn)證了其在中國人群胃癌患者中陽性率較高，診斷胃癌的AUC為0.627。

Tsunemi等[34]的研究對胃癌患者和健康人群中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose-regulated protein,GRP）78 抗體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)胃癌患者該抗體陽性率為28.3%（17/60），而健康人群中為0，提出GRP78 可作為胃癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。Qin 等[35]以133 例胃癌患者、133 名健康人作為試驗(yàn)組，300 例胃癌患者、300 名健康人為驗(yàn)證組，發(fā)現(xiàn)兩組中國人群中胃癌患者抗GRP78 抗體水平均高于健康個(gè)體，該抗體對診斷胃癌的AUC分別為0.718和0.666。

2.胃液蛋白：Kon等[36]發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃液中60種蛋白分子表達(dá)上調(diào)、46 種蛋白分子表達(dá)下調(diào)，其中胃蛋白酶A 和胃蛋白酶原C活性肽段表達(dá)明顯上調(diào)，抵抗素樣分子-α表達(dá)明顯下調(diào)。Chang 等[37]發(fā)現(xiàn)胃液中5 種蛋白在胃癌患者中存在差異表達(dá)，其中2種胃蛋白酶原片段和亮氨酸拉鏈蛋白片段水平降低，白蛋白和α-1 抗胰蛋白酶片段水平升高（表1）。Hsu等[38]的研究同樣發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃液中α-1抗胰蛋白酶水平升高，其診斷胃癌的AUC 為0.96，敏感性、特異性分別為96%、92%。

3. 唾液蛋白：唾液蛋白也可用于胃癌篩查。Koopaie等[39]研究發(fā)現(xiàn)，與31 名健康人相比，31 例胃癌患者中唾液蛋白胱抑素B 表達(dá)明顯降低、腦惡性腫瘤缺失蛋白1 表達(dá)明顯增高（表1）。若以胱抑素B＜119.06 μg/L作為陽性臨界值，其診斷胃癌的AUC 為0.728，敏感性、特異性分別為83.87%、70.97%。若以腦惡性腫瘤缺失蛋白1>146.33 μg/L 作為陽性臨界值，其診斷胃癌的AUC 為0.741，敏感性、特異性分別為80.65%、64.52%。

4. 尿液蛋白：Shimura 等[40-41]的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，尿液三葉因子1（urinary trefoil factor 1, uTFF1）、尿液解整合素樣金屬蛋白酶12（urinary a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 12,uADAM12）、尿液胃蛋白酶原3（urinary pepsinogen 3,uPGA3）、尿液BRCA1 相關(guān)環(huán)域蛋白1（urinary BRCA1-associated RING domain 1, uBARD1）、尿液基質(zhì)金屬蛋白酶-9/中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白復(fù)合體（urinary matrix metalloproteinase-9/neutrophil gelatinaseassociated lipocalin complex,uMMP-9/NGAL）在胃癌患者中表達(dá)升高（表1）。其中，uTFF1、uADAM12、uMMP-9/NGAL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），uTFF1、uADAM12 診斷胃癌的AUC分別為0.806、0.714，可單獨(dú)作為胃癌診斷生物學(xué)標(biāo)志物。若聯(lián)合uTFF1、uADAM12 診斷胃癌，其AUC 為0.815；聯(lián)合uMMP-9/NGAL、uADAM12，AUC則為0.825。

六、總結(jié)

不同來源的生物學(xué)標(biāo)志物各有優(yōu)缺點(diǎn)。血液采集方法成熟、創(chuàng)傷相對較小、可重復(fù)性較高，但血液中成分相對復(fù)雜，需避免其他物質(zhì)干擾。胃液直接來源于病變區(qū)域，生物學(xué)標(biāo)志物特異性和濃度均較高，但胃液的獲取仍需要依賴胃鏡檢查，限制了其大規(guī)模推廣與應(yīng)用。唾液與尿液方便獲取，但唾液含有DNA、RNA、代謝物和微生物群等多種組分，樣品的純化和避免其他分子的污染仍存在困難[40]；尿液含有多種代謝產(chǎn)物，且濃度會(huì)隨尿量、藥物使用、腎臟病理情況而改變。

胃癌生物學(xué)標(biāo)志物的探索與應(yīng)用有助于胃癌的篩查和早期診斷，有利于疾病的早期管理。期望在不久的將來，無創(chuàng)或微創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)志物可以作為胃癌篩查的常規(guī)手段，廣泛應(yīng)用于大規(guī)模人群中，從而實(shí)現(xiàn)胃癌的早期診斷和治療，提高患者生存率和生命質(zhì)量。