雞PGCs 及基因編輯技術(shù)

趙宗儀，張文慧，聶瑞雪，張 博，張 浩

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

雞是全球飼養(yǎng)數(shù)量最多的畜禽，聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（FAO）表明全世界雞只存欄量超過330 億只，每年出欄660 億只以上，是人類肉、蛋產(chǎn)品的主要供應(yīng)源之一，對全球農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)做出了巨大貢獻(xiàn)。同時，雞在發(fā)育生物學(xué)、免疫研究和生物反應(yīng)器等研究中具有舉足輕重的地位[1]?；蚓庉嬍?1 世紀(jì)最大的生物技術(shù)發(fā)現(xiàn)之一，為人類醫(yī)療與健康、生物育種、環(huán)境生態(tài)修復(fù)等方面帶來了深刻變革。鳥類胚胎在體外發(fā)育，很難對位于蛋殼和卵黃膜內(nèi)的受精卵進(jìn)行基因操作，雞胚中具有獨(dú)特遷移能力的原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells，PGCs），分離和體外培養(yǎng)的PGCs 仍然具有分化配子的能力。因此，PGCs 是對雞進(jìn)行基因編輯的理想材料。本文綜述雞PGCs 的生物學(xué)特性及其基因編輯技術(shù)的應(yīng)用，為禽類基因編輯研究提供參考。

1 雞PGCs 是進(jìn)行基因編輯的理想載體

1.1 雞PGCs 的基本生物學(xué)特性

雞PGCs 最早由1870 年Waldeyer 觀察到[2]，1993 年Kuwana[3]首次采用電子顯微鏡觀察到了雞PGCs 細(xì)胞。雞PGCs 在光學(xué)顯微鏡下一般呈現(xiàn)出飽滿的圓形，細(xì)胞膜呈現(xiàn)清晰的邊緣，可以看到細(xì)胞質(zhì)中的糖原顆粒和細(xì)胞核[4]（圖1）。

圖1 顯微鏡下觀察到的雞PGCs 細(xì)胞形態(tài)

雞PGCs 的形成比哺乳動物更早。雞胚胎的發(fā)育階段主要采用HH（Hamburger Hamilton stages）方法來描述，這種方法將孵化第0～21 天胚胎發(fā)育劃分為HH 1～46 時期[6]。Tsunekawa 等[7]采用PGCs 標(biāo)記蛋白（CVH），證明最早在HH 2～3 階段存在40～60 個PGCs，同時證明了PGCs 中一個被稱為種質(zhì)（germplasm）的結(jié)構(gòu)，不僅可以傳遞遺傳物質(zhì)，還可以被定位于精子細(xì)胞和卵母細(xì)胞，說明PGCs 可以在世代間傳遞遺傳信息。

雞PGCs 具有從血液遷移到生殖嵴的獨(dú)特特性。隨著胚胎發(fā)育，PGCs 逐漸從中心透明區(qū)域轉(zhuǎn)移到生殖新月[8,9]。在HH 12～14 階段，大部分PGCs 軸向集中于血管終竇，并通過前卵黃靜脈軸向轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胚胎循環(huán)系統(tǒng)[10]。在HH 15～18 階段，PGCs 從血管進(jìn)入生殖嵴區(qū)域。對于PGCs 遷移進(jìn)入生殖嵴的過程，研究表明，卵黃前靜脈[10]、多種基因[11]和細(xì)胞因子[12]等在PGCs 正確進(jìn)入生殖嵴的過程中發(fā)揮重要作用。在HH 26～28 階段，PGCs 在生殖嵴中定殖，被稱為性腺生殖細(xì)胞（Gonad germ cells，GGCs）。直到HH 35 開始，PGCs 逐漸分化為其他生殖相關(guān)細(xì)胞（包括精子和卵母細(xì)胞）。根據(jù)PGCs 在不同發(fā)育階段的特點(diǎn)，我們可以針對HH 2～3、HH 13～17 以及HH 26～35 的PGCs 進(jìn)行分離和獲取，并在基因編輯后進(jìn)行植入等相關(guān)操作（圖2）。

圖2 雞PGCs 的遷移特性 [13]

1.2 雞PGCs 作為基因編輯載體的優(yōu)越性

將外源基因直接引入受精卵是一種常規(guī)且成熟的改變遺傳物質(zhì)的方法，但在雞中存在諸多困難。在雞中，Love[14]、Kwon[15]等成功利用了一種與小鼠相似的方法[16]，通過病毒將外部DNA 引入受精卵，從而成功制備了生殖嵌合體雞。但由于鳥類難以單獨(dú)獲取胚胎，并且難以對位于蛋殼和卵黃膜之內(nèi)的受精卵進(jìn)行顯微操作，這種技術(shù)面臨挑戰(zhàn)。特別是雞胚的原核被充滿蛋黃的不透明細(xì)胞質(zhì)所覆蓋，且膜上有大量的精子核[17,18]，使得顯微操作愈發(fā)困難。另外，由于引入的DNA 始終以游離的形式存在，即使利用流式細(xì)胞分選法（FACS）分選的胚盤細(xì)胞進(jìn)行注射也避免不了DNA 在后代中降解[19]。所以直接向受精卵中注射外源DNA 不是一個好的可行方法。通過對精子進(jìn)行基因編輯也是哺乳動物中一個常用的基因編輯方法，但在雞中沒有在附睪中成熟的過程，使得直接編輯精子的機(jī)會窗口大幅縮短[20]，同時存在體外受精困難、效率低等[21]問題，因此，對精子進(jìn)行基因編輯同樣不適用于雞。

對PGCs 起源的研究表明，在雞胚胎早期（HH 1）[22]，胚層中已經(jīng)存在50～100 個雞原始生殖細(xì)胞[23,24]。雞PGCs 中的種質(zhì)（germplasm）區(qū)域可以在世代間傳遞遺傳物質(zhì)[25]。此外，PGCs的獨(dú)特遷移能力也為其分離和體外培養(yǎng)提供了可能性。因此，雞PGCs 是進(jìn)行基因編輯的理想材料，雞的基因編輯研究主要聚焦于PGCs。

1.3 PGC 的獲得和培養(yǎng)面臨的挑戰(zhàn)和解決方案

PGCs 的分離和培養(yǎng)過程充滿了挑戰(zhàn)。在體內(nèi)自然分離所得的PGCs 數(shù)量相對較少。在單個胚胎的HH 1 時期，PGCs 的只有50～100 個。從孵化4.5d 的雞胚中分離出的生殖嵴PGCs 數(shù)量只在2000～5000 個。PGCs 對于滲透壓、生長因子和培養(yǎng)基成分等環(huán)境條件非常敏感[26,27]，難以大量長期培養(yǎng)。血管中的PGCs 是非黏附的，造成了分離PGCs 困難。雌雄PGCs 所需的滲透壓和營養(yǎng)物質(zhì)不同[28-30]，當(dāng)移植的PGCs 與受體雞的性別不一致時，種系嵌合體的成功率可能會降低[31]，這些因素給PGCs 分離培養(yǎng)和后續(xù)基因編輯造成了困難。PGCs 分離方法主要有3 種：①從HH 1時期胚盤中分離；②從第2.5～3 天胚胎血液中分離；③從第5.5～6 天胚胎生殖嵴中分離。

1.3.1 HH1 時期胚盤中PGCs 的分離

由于一個HH 1 時期的雞胚只含有50～100個PGCs，當(dāng)前的主流方法并不對這一早期胚胎的PGCs 進(jìn)行分離。在早期研究中，研究人員利用HH 1 期PGCs 制作嵌合體。Petitte 等[32]將未分期胚胎的中心區(qū)域的胚盤細(xì)胞團(tuán)塊轉(zhuǎn)移到胚盤的中心區(qū)域，產(chǎn)生了體細(xì)胞嵌合體公雞，首次證明了轉(zhuǎn)移的PGCs 在受體雞中能產(chǎn)生功能性精子。

1.3.2 循環(huán)系統(tǒng)中PGCs 的分離

在禽類胚胎中，PGCs 利用血液循環(huán)系統(tǒng)向生殖嵴遷移，HH 12～17 期胚胎成為從血液中采集PGCs 的理想窗口期。Tajima 等[33]研究表明，HH 14 時循環(huán)系統(tǒng)中PGCs 濃度達(dá)到峰值，是采集血液的最佳時期。PGCs 的分離純化方法經(jīng)過多次改進(jìn)已發(fā)展出了多種方法。第1 類為梯度密度離心法：Yasuda 等[34]通過Ficoll 密度梯度離心法成功將血液PGCs 從0.048%提高到3.9%，利用該技術(shù)生產(chǎn)的種系嵌合體雞的平均種系傳遞效率達(dá)到4.3%。Zhao 等[35]利用Nycodenz 梯度密度離心將PGCs 的濃度提高到70%以上。第2 類為基于抗原抗體反應(yīng)的磁珠分選法：Ono 等[36]利用雞PGC 標(biāo)記蛋白QCR1（ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1）的單克隆抗體建立了免疫磁珠分選（MACS）。Mozdziak 等[37]采 用SSEA-1 抗體通過流式細(xì)胞分選法（FACS）將PGCs 濃度提高到92%。第3 類方法為去除血液中的紅細(xì)胞進(jìn)而增加PGCs 的濃度：Yamamoto等[38]建立了一種使用氯化銨鉀緩沖液裂解紅細(xì)胞的試驗(yàn)方法，使全血PGCs 的回收率達(dá)到90.3%。除以上3 種方法外，Jung 等[39]利用血液中PGCs的直徑大于其他細(xì)胞這一特點(diǎn)，開發(fā)了Transwell介導(dǎo)的大小依賴性分離方法，使PGCs 的分離變得更加方便和快速。

1.3.3 生殖嵴中PGCs 的分離

生殖嵴中的PGCs 數(shù)量相比其他時期更多，且分離更加簡單，因此也是運(yùn)用的較為廣泛的一種分離方法。生殖嵴中的PGCs 雖然已經(jīng)過了遷移階段，但仍然具有重新遷移和發(fā)育為配子的能力[40]。Kim 等[41]通過SSEA-1 抗體采用MACS 方法純化生殖嵴PGC 后將其移植到X 期胚胎的皮下腔中，成功培育種系嵌合體雞。同樣，Mozdziak 等[42]采用QCR1 抗體通過FACS 純化生殖嵴PGC，并成功移植到17 期胚胎血液中培育出了種系嵌合體雞。Nakajima 等[43]開發(fā)了一個方便、快捷的方法，從孵化7d 的胚胎中采集的發(fā)育中的性腺在37.8℃的無Ca2+和Mg2+磷酸鹽緩沖鹽水中培養(yǎng)90min 后，PGCs 會從性腺中排出，純度約為50%。

1.3.4 體外PGCs 的長期培養(yǎng)

研究人員對PGCs 的發(fā)育機(jī)制和體外培養(yǎng)進(jìn)行了深入研究，并已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了較長時間的培養(yǎng)，為進(jìn)一步的基因編輯提供了細(xì)胞材料。雖然哺乳動物和雞的PGCs 形成機(jī)制有差異，但脊椎動物（哺乳動物和雞）中控制PGCs 自我更新、生長和分化的機(jī)制相似，因此，許多常見的多能性因子和蛋白（DDX4、DND、PRDM1、OCT4、NANOG和SOX2）可以維持雞PGCs 的多能性和發(fā)育。

哺乳動物PGCs 只能在敲除特定基因并且添加生長因子如BMP4、LIF、SCF 和視黃酸等條件下培養(yǎng)較短的時間，而雞的PGCs 可以培養(yǎng)較長的時間并維持分化能力和種質(zhì)特性。Lavoir 等[44]成功分離了雞生殖嵴PGCs，并證明了PGCs經(jīng)過209d 的培養(yǎng)后進(jìn)行基因修飾后仍然具有干性和分化為配子的能力。后續(xù)研究在提高PGCs培養(yǎng)的數(shù)量和質(zhì)量上取得了許多新的突破：Whyte 等[26]系統(tǒng)研究了PGCs 的培養(yǎng)基，為雞PGCs 的培養(yǎng)提供了重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)；Collarini 等[5]建立了PGCs 分離建系長期培養(yǎng)的體系；Ezaki 等[4]在PGCs 中添加了包括Blebbistatin 在內(nèi)的3 種小分子穩(wěn)定劑，使用Blebbistatin可以在10d 內(nèi)從250 個細(xì)胞中誘導(dǎo)出4.21×105個細(xì)胞，使用H-1152 則誘導(dǎo)出2.68×105個細(xì)胞，使用Z-VAD誘導(dǎo)出2.50×105個細(xì)胞，該方法長期（177d）培養(yǎng)的PGC 獲得的后代雞的效率也很高（93%）。

然而，目前PGCs 培養(yǎng)的雌雄差異問題還需要進(jìn)一步探究。雌雄PGCs 所需的培養(yǎng)條件不同，產(chǎn)出后代雞的能力也存在差異。Whyte 等[26]指出了雌雄PGC 所需滲透壓不同；Ichikawa 等[29]發(fā)現(xiàn)，雌雄PGCs 具有不同的RNA 表達(dá)。事實(shí)上，雄性PGCs 培養(yǎng)為細(xì)胞系的概率在10%～22%[45,46]，而雌性PGCs 培養(yǎng)成為細(xì)胞系的概率則低得多。PGCs 的性別和受體雞的性別不同也會造成種系嵌合體成功率降低[31]。因此，雌雄PGCs 的差異培養(yǎng)問題是一個有趣的方向，弄清楚PGCs 之間的差異問題有助于進(jìn)一步提高基因編輯的效率。

2 基因編輯在PGCs 中的應(yīng)用

2.1 早期基因編輯工具在PGCs 上的嘗試

高效的基因編輯工具是生產(chǎn)基因編輯雞的先決條件。在最開始的嘗試中，Schusser 等[46]在PGCs 中利用同源重組首次靶向敲除了Ig 重鏈，成功培育出基因修飾雞。但PGCs 基因組中的同源重組效率極低（約0.1%），且該方法取決于模板基因的同源性[47]，因此限制了其應(yīng)用。

2.1.1 鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)在PGCs 上的應(yīng)用

隨著對DNA 酶理解的不斷加深，先后出現(xiàn)了鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）等精確基因編輯工具。這2 類工具主要由特異性DNA 結(jié)合模塊與DNA 核酸酶構(gòu)成，它們通過DNA 斷裂誘導(dǎo)基因組修復(fù)，通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）使得目的片段連入基因組中。Fan 等[48]測試了ZFNs 技術(shù)在雞中具有較高的活性。2014 年首次有報(bào)道指出，TALENs 成功介導(dǎo)的雞靶向卵清蛋白缺失，PGCs 的基因組缺失效率高達(dá)33.3%，種系傳遞效率在22.3%～53.2%[49]。相比于同源重組技術(shù)，TALEN 技術(shù)在雞中的成功應(yīng)用大幅提高了基因編輯效率。

2.1.2 CRISPR/Cas9 技術(shù)在PGCs 上的應(yīng)用

自CRISPR/Cas9 技術(shù)問世以來，它憑借其高效和簡潔，為各種生物研究帶來了革命性的突破和改變。利用此技術(shù)能在幾乎任何生物體中引導(dǎo)特定靶DNA 序列的切割，再通過NHEJ 或HDR進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)精確基因編輯[50,51]，且更簡單更快速[13,52]。PGCs 介導(dǎo)的種系傳播系統(tǒng)的成功應(yīng)用為CRISPR/Cas9 技術(shù)的有效應(yīng)用奠定了必要的理論基礎(chǔ)和操作基礎(chǔ)，同時，雞中系統(tǒng)性基因組轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的深入研究也為基因編輯技術(shù)在雞中的應(yīng)用提供了有力支撐[53]。

CRISPR/Cas9 技術(shù)的應(yīng)用大大加快了家禽產(chǎn)業(yè)化和醫(yī)學(xué)科研等領(lǐng)域的速度。在家禽業(yè)中CRISPR/Cas9 技術(shù)可以改良現(xiàn)有性狀產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)價(jià)值。Dimitrov 等[54]利用PGCs 成功對雞蛋中的主要過敏原卵清蛋白（OV）和卵粘蛋白（OVM）進(jìn)行敲除，與傳統(tǒng)的同源重組相比，采用CRISPR/Cas9 技術(shù)的重組效率顯著提高至9%。肌肉質(zhì)量在家禽產(chǎn)業(yè)中是一個重要的經(jīng)濟(jì)性狀，先后有研究編輯出了通過靶向控制組織生長發(fā)育的肌肉生長抑制素（MSTN）基因和調(diào)節(jié)脂肪沉積的G0/G1 開關(guān)基因（G0S2）生產(chǎn)具有更好肌肉質(zhì)量的雞[55,56]。禽類疾病控制和預(yù)防是家禽業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要先決條件，多數(shù)疫苗對禽白血病毒沒有效果，而采用CRISPR/Cas9 技術(shù)產(chǎn)生的ALV-J 抗性雞阻斷和干擾了禽白血病毒的傳播[57]；在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，雞蛋中有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白，是一個理想的生物反應(yīng)系統(tǒng)[58]。人類干擾素β（hIFN-β）可以整合到蛋清中用于生產(chǎn)hIFN-β 的雞卵清蛋白位點(diǎn)中[59]。在免疫學(xué)研究領(lǐng)域，為了探究內(nèi)源性IFAR1 對免疫系統(tǒng)的影響，研究人員成功利用Cas9-HF1 技術(shù)制備了干擾素α 和β 受體亞基（IFAR1）敲除的雞，為研究免疫系統(tǒng)提供了有力支持[60]。

2.1.3 基因編輯工具轉(zhuǎn)染雞PGCs 的挑戰(zhàn)

將基因編輯工具成功引入雞PGCs 中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，這主要是由于雞細(xì)胞與哺乳細(xì)胞在脂質(zhì)[61]和親水特性[62]等方面的差異，盡管如此，研究者已嘗試了多種轉(zhuǎn)染方法。Lavoir 等[44]最早使用電穿孔的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，而Shin 等[63]則采用了慢病毒轉(zhuǎn)染。后來Tyack 等[64]采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法（Lipofectamine 2000）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但這種方法的轉(zhuǎn)染效率僅為23.4%以下[65]，Jiang 等[66]采用病毒轉(zhuǎn)染，效率達(dá)到了50.0%～66.7%。為了進(jìn)一步優(yōu)化，Park 等[67]在雞PGCs 上利用piggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，提高了轉(zhuǎn)染的效率和有效性。Schusser 等[46]采用同源重組介導(dǎo)的CRISPR/Cas9 技術(shù)顯著提高了基因編輯后的精確性和有效性。

2.2 生殖器官嵌合體的生產(chǎn)

在完成PGCs 的基因編輯后，需要選取合適的受體雞進(jìn)行移植。為了使受體雞更好地接受編輯過的PGCs，需要盡可能減少其自身的PGCs 數(shù)量。最早的實(shí)驗(yàn)中采用白消安產(chǎn)生不育雞，消除了大部分受體雞本身的PGCs[68]。Nakamura 等[69]研究證明，向經(jīng)白消安處理的不育雞注射供體PGCs 后，其供體PGC 的占比（98.6%）明顯超過對照組（6.4%）。此外，使HH 1 時期胚盤暴露于60 Co 源產(chǎn)生的500～700 rads 伽馬輻射也可得到不育雞。Trefil 等[70]通過該方法產(chǎn)生的不育雞，經(jīng)過移植生殖細(xì)胞，約有50%的不育雞得以恢復(fù)，這證明了伽馬輻射的有效性。Taylor 等[72]通過TALENs 方法成功敲除DDX4 位點(diǎn)，使得PGC無法形成，最終產(chǎn)生成年雌性不育雞。Ballantyne等[71]采用iCaspase-9 技術(shù)成功制造純種不育雞，徹底消除了內(nèi)源PGCs 對基因編輯后代雞的干擾，為基因編輯雞的發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)。

當(dāng)受體雞準(zhǔn)備好后，選擇恰當(dāng)?shù)臅r機(jī)對其注入已編輯的PGCs 至關(guān)重要。根據(jù)PGCs 在雞中的發(fā)育遷移特點(diǎn)，現(xiàn)有大多數(shù)研究一般選擇在胚胎早期階段（HH 14～16）進(jìn)行注射。通常在雞胚背主動脈進(jìn)行注射，優(yōu)點(diǎn)是入侵性較小，但并非所有的PGCs 都能到達(dá)性腺[28]。也有研究直接將編輯后的PGCs 直接注射到生殖嵴中以生產(chǎn)生殖嵌合體[72]。盡管這種方法可能提高PGCs 的穩(wěn)定定植率（6%），但其侵入性較高，技術(shù)要求也更為嚴(yán)格。

在PGCs 注入受體雞后，選擇正確的孵化方法變得尤為關(guān)鍵。隨著技術(shù)的不斷演進(jìn)，孵化方法也經(jīng)歷了諸多創(chuàng)新。如Lavoir 等[44]選擇先將雞胚倒出進(jìn)行操作，完成后使用塑料膜封住蛋殼。早在1987 年，Perry 等[73]和Rowlett 等[74]對代孕孵化系統(tǒng)進(jìn)行了研究，試圖通過模擬雞蛋外殼結(jié)構(gòu)來孵化雞胚，但為每一個雞蛋提供定制的蛋殼結(jié)構(gòu)費(fèi)時費(fèi)力。Kamihira 等[75]采用了人工容器對雞胚進(jìn)行孵化，并報(bào)道了使用聚四氟乙烯作為胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)。而Tahara 和Obara 等[76]則使用了食品包裝材料——聚甲基戊烯膜作為孵化容器。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，在無蛋殼的孵化系統(tǒng)中添加鈣離子孵化率由19.4%提高到了48.9%，顯著提高孵化效率[77]。

2.3 雞PGCs 基因編輯展望

雞PGCs 和基因編輯技術(shù)仍存在若干問題，需進(jìn)一步研究和解決，但其應(yīng)用具有廣闊的前景。用基因編輯制作雞蛋殼腺生物反應(yīng)器，生產(chǎn)藥用蛋白或人源抗體，對人類疾病治療和疫苗開發(fā)具有深遠(yuǎn)影響。雞PGCs 介導(dǎo)的基因編輯在應(yīng)對禽類疾病也具有重要潛在應(yīng)用價(jià)值，有研究在禽肉瘤和白血病病毒（ASLV）方面已經(jīng)取得了顯著突破[78]。最新的研究表明，使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯宿主蛋白ANP32A 可以阻止禽流感病毒在雞體內(nèi)的復(fù)制。我們可以通過遺傳手段預(yù)防和控制禽類的多種傳染病，為養(yǎng)殖業(yè)帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益。在種質(zhì)資源保護(hù)方面，使用基因組編輯技術(shù)使其不育的雌性雞用作移植冷凍保存生殖細(xì)胞的替代宿主，并且只產(chǎn)下移植的稀有雞品種的雞蛋[79]，這為稀有雞品種的保存和繁殖提供了新的途徑，確保了種質(zhì)資源的長期維護(hù)?？傊?，雞的PGCs和基因編輯技術(shù)為禽業(yè)、醫(yī)藥和種質(zhì)資源保護(hù)等領(lǐng)域帶來了新的機(jī)遇，值得進(jìn)一步研究和探索。