新型大鼠腰部慢性骨骼肌復(fù)合損傷模型的建立

盧晶晶,張弛,張馳名,許鐺瀚,林煜翔,謝煒星

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針推康復(fù)中心,廣州 510000;2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,北京 100105;3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510000;4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷中心,廣州 510000)

在各種類型創(chuàng)傷中,肌肉組織損傷所占的比例相對(duì)最高[1]。 損傷后肌肉組織血腫機(jī)化、瘢痕組織產(chǎn)生,對(duì)活動(dòng)能力、生活質(zhì)量構(gòu)成現(xiàn)實(shí)的威脅[2];因此研究骨骼肌損傷的發(fā)病機(jī)制,了解其病理特點(diǎn)和臨床轉(zhuǎn)歸,探討相關(guān)的預(yù)防、治療和康復(fù)措施等,一直是醫(yī)學(xué)研究的一項(xiàng)重要課題[3]。 慢性骨骼肌損傷是一種常見的運(yùn)動(dòng)損傷,它可以導(dǎo)致肌肉疼痛、功能障礙和活動(dòng)受限[4]。 需要注意的是慢性骨骼肌損傷往往是急性骨骼肌損傷后康復(fù)不徹底,同時(shí)局部再次遭受反復(fù)打擊而成。 長(zhǎng)時(shí)間不活動(dòng)[5]、固定骨骼肌或太空飛行也會(huì)導(dǎo)致肌肉骨骼質(zhì)量、大小和力量的顯著損失,最終導(dǎo)致肌肉萎縮[6]。

檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)在骨骼肌損傷的模型制備方面主要是急性期的模型比較成熟:如垂直打擊造模[7-8]、布比卡因注射造模[9]等。 而在慢性骨骼肌損傷方面?zhèn)鹘y(tǒng)的模型一般采用手術(shù)切除或切割肌肉組織的方式,例如切除肌腱或者神經(jīng)[10]、阻斷血流[11]等方法,以達(dá)到慢性損傷的效果。 有研究者選擇經(jīng)典的大鼠下坡跑離心收縮模型誘導(dǎo)動(dòng)物的慢性骨骼肌損傷模型[12-13],該模型由Schwane 等[14]設(shè)計(jì)建立,然而需要注意的是該文發(fā)表時(shí)間是1983年,距今已40 年。 其只能模擬部分慢性肌肉損傷情況:盡管該方法可以模擬骨骼肌的長(zhǎng)期負(fù)荷和運(yùn)動(dòng)過程,但并不能完全模擬所有慢性肌肉損傷情況,因此需要結(jié)合其他模型和方法進(jìn)行綜合研究。 傳統(tǒng)的慢性骨骼肌損傷模型局限性在于無法模擬真實(shí)的骨骼肌疾病,因?yàn)椴±頇C(jī)制簡(jiǎn)單,與具有持久的肌肉疼痛、功能障礙的原發(fā)病有較大區(qū)別。 此外,傳統(tǒng)的方法還可能導(dǎo)致非特異性的細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng),從而難以評(píng)估慢性肌肉損傷的分子機(jī)制。

另外,骨骼肌損傷模型在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中往往采用的是針對(duì)腓腸肌、股四頭肌進(jìn)行定位打擊,本實(shí)驗(yàn)更換損傷肌群同時(shí)結(jié)合人體工程力學(xué)提出構(gòu)建腰部慢性骨骼肌復(fù)合損傷模型新思路:急性損傷后的大鼠腰部肌肉在長(zhǎng)期過度負(fù)重的條件下不斷缺血、痙攣、機(jī)化等達(dá)到慢性非特異性腰痛的損傷時(shí)間則可以構(gòu)建完整的復(fù)合模型。 2022 年,研究顯示非特異性腰痛是全球最普遍和最致殘的疾病,在慢性患者人群中,較少患者能自行緩解(約30%)[15]。 而其病因常常是因肌肉和韌帶等軟組織在急性損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步慢性勞損(如久坐、久立)而導(dǎo)致病情遷延不愈[15]。 慢性骨骼肌損傷對(duì)肌肉組織的修復(fù)和再生能力有嚴(yán)重影響,而建立新型大鼠腰部慢性骨骼肌復(fù)合損傷模型可以為肌肉組織再生提供更真實(shí)的模型,促進(jìn)肌肉組織的再生和修復(fù)研究;可以更真實(shí)地模擬肌肉長(zhǎng)期受損狀態(tài),有助于深入探究慢性骨骼肌損傷的病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康8 周齡雄性SD 大鼠28 只,體重250 ~ 300 g,購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限責(zé)任公司【SCXK(粵)2022-0063】,動(dòng)物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(粵)2018-0001】,大鼠自由進(jìn)食及飲水,溫度為20 ~ 22℃,濕度50% ~60%,模擬自然光照周期(每日8:30 開燈,每日20:30 關(guān)燈),大鼠按組分籠,定期消毒清理飼養(yǎng)盒,更換墊料。 本實(shí)驗(yàn)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(20220331007)。

1.1.2 主要試劑與儀器

3%戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑采供供應(yīng)站分裝廠,120505);4%多聚甲醛溶液(BL539A)購(gòu)自北京沃格東方科技有限公司,品牌:biosharp。 單鉤砝碼打擊器(500 g):購(gòu)自滄州辰龍精密機(jī)械有限公司。自制固定圓桶杯:定制圓桶PVC(底部直徑12 cm,高度30 cm),購(gòu)自溫州錢森包裝有限共公司;網(wǎng)格卡扣:購(gòu)自河北穩(wěn)固絲網(wǎng)制品有限公司(絲徑0.4 mm 絲網(wǎng)寬90 cm);Slide-Viewer 圖像采集系統(tǒng):應(yīng)用程序,版本:2.5.0.143918。 NovaSeq 6000 測(cè)序平臺(tái):儀器名稱,DNBseq-T7RS,武漢華大智造科技有限公司生產(chǎn)的儀器,儀器編號(hào)R1100600210010。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)思路

為解決上述問題,本文綜合文獻(xiàn)對(duì)方法進(jìn)行了優(yōu)化。 復(fù)合損傷模型組參考垂直打擊模型[7-8],經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)大鼠打擊合理范圍內(nèi)的打擊次數(shù)(連續(xù)2 次),然后采用自制坐位模具,將大鼠固定在各個(gè)鼠格中強(qiáng)迫坐姿制造靜力壓,通過體位及力學(xué)的改變,加重肌肉負(fù)擔(dān)減少肌肉修復(fù),并使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證[16]。 參考文獻(xiàn)[17]記載人類1 h約等同于大鼠生命周期的30 h 以上(不同年齡段有差異),結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)物耐受程度,將強(qiáng)迫坐姿時(shí)間安排在打擊后持續(xù)1 h。 人類慢性非特異性腰痛的發(fā)病時(shí)間,為腰痛急性(6 周內(nèi))、亞急性(6 ~12 周)和慢性(12 周以上)[18],大鼠的發(fā)病時(shí)間則相應(yīng)縮短[17]。 人類的1 h 約等同于成年期大鼠生命周期的34.8 h[16](即大鼠一個(gè)月相當(dāng)于人類的3年,相較人類更快地衰老)。 在60 h 的造模方案中,間歇(打擊+ 強(qiáng)迫坐姿)訓(xùn)練時(shí)間,符合慢性腰肌勞損的要求。 單純打擊傷模型組則符合急性損傷要求:造模時(shí)間約28 h。 靜力壓會(huì)影響足部、尾部等組織的血流及細(xì)胞代謝,要定期檢查相應(yīng)部位,謹(jǐn)慎控制坐位姿勢(shì)時(shí)長(zhǎng),減輕腳部和爪子的壓力,并盡可能減少傷害。

1.2.2 分組造模

在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。 采用隨機(jī)數(shù)字表法將28 只SD 大鼠隨機(jī)分為3 組,分別為對(duì)照組(Control group),單純打擊傷模型組,簡(jiǎn)稱打擊組(HIM group),復(fù)合損傷模型組,簡(jiǎn)稱復(fù)合組(CDM group)。 其中,對(duì)照組10 只,打擊組9 只(行垂直打擊),復(fù)合組9 只(垂直打擊結(jié)合強(qiáng)迫長(zhǎng)時(shí)坐位),標(biāo)記編號(hào)。 用3%戊巴比妥鈉按0.5 mL/100 g 的計(jì)量,腹腔注射麻醉。 本實(shí)驗(yàn)中打擊組參考侯懿烜等[19]垂直下落打擊的造模方法構(gòu)建,而復(fù)合組在打擊后使SD 大鼠強(qiáng)迫持續(xù)坐姿,以模擬人類疾病腰肌勞損。

進(jìn)行分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,剪除大鼠打擊處被毛,打擊組大鼠俯臥位并在打擊點(diǎn)做標(biāo)記同時(shí)打擊器激光錨定打擊部位(見圖1),打擊部位在俯臥位大鼠第五腰椎水平雙側(cè)豎脊肌[10],觸碰局部時(shí)有躲避反射。 每次擊打左右腰部各1 次,垂直打擊標(biāo)記部位(2 d 內(nèi)共打擊3 組),打擊器與損傷處接觸面積約為1 cm × 1 cm,動(dòng)能為2.352 J(打擊器總重量為500 g,由48 cm 處自由落體)。 觀察打擊部位無骨折,表皮無破損,有散在紅色斑點(diǎn),皮下暗紅,不作任何處理,形成背部肌群急性鈍挫傷動(dòng)物模型。 復(fù)合組2 d 內(nèi)共打擊2 組(左右腰肌各1 次為1 組), 隨后使用自制固定圓桶杯及網(wǎng)格卡扣固定大鼠,使其模仿人體坐位姿勢(shì)強(qiáng)迫坐位1 h 造模(見圖2)。 造模成功后將實(shí)驗(yàn)大鼠放回籠中繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng),按實(shí)驗(yàn)時(shí)間表和流程圖進(jìn)行(見圖3)。

圖1 垂直打擊圖Figure 1 Vertical strike diagram

圖2 強(qiáng)迫坐姿模型示意圖Figure 2 Diagram of a forced sitting posture model

圖3 實(shí)驗(yàn)流程圖Note. HIM group was hit 3 times in two days.Figure 3 Experimental flowchart

1.2.3 行為學(xué)——曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)開始之前,先確保實(shí)驗(yàn)箱干凈無味,需要注意清理上一次測(cè)試遺留下來的糞便、尿液等。(2)實(shí)驗(yàn)人員在軟件中設(shè)置好相應(yīng)的參數(shù),記錄好動(dòng)物的編號(hào)、日期、狀態(tài)等信息。 (3)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速放置于實(shí)驗(yàn)箱的中央?yún)^(qū)域,并立即離開。 (4)打開動(dòng)物行為學(xué)分析軟件,自動(dòng)記錄動(dòng)物在箱體內(nèi)的活動(dòng),實(shí)驗(yàn)時(shí)間通常為15 min。 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)完成后處死大鼠。

1.2.4 標(biāo)本準(zhǔn)備

每次取材前,大鼠禁食禁水12 h,分別稱重,大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉,固定后除毛備皮,暴露豎脊肌,銳性切取L4/L5 節(jié)段肌組織,右側(cè)部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,部分切成小塊放入1.5 mL RNase-free 螺紋凍存管中再置于-80℃液氮中冷凍保存用于測(cè)序,左側(cè)置于液氮冷凍后保存于-80℃冰箱,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 組織病理染色

取材固定、修塊、染色、水化、包埋、烤片等處理。 病理觀察:使用Slide-Viewer 圖像采集系統(tǒng)對(duì)腰部的肌肉形態(tài)進(jìn)行觀察與描述。

1.2.6 測(cè)序

從對(duì)照組和復(fù)合組各選取3 只進(jìn)行測(cè)序,按體重分層,隨后按隨機(jī)數(shù)字選擇三層中的任意1 只大鼠進(jìn)行標(biāo)本測(cè)序。 其中根據(jù)體重差值每25 g 為一層,隨機(jī)數(shù)字表法在第一層選擇的大鼠作為對(duì)照組1/復(fù)合組1;第二層作為對(duì)照組2/復(fù)合組2;第三層作為對(duì)照組3/復(fù)合組3。 取新鮮豎脊肌,按照ABclonal mRNA-seq Lib Prep Kit(愛博泰克生物科技有限公司,中國(guó))說明書制備PE 文庫(kù)。 純化PCR產(chǎn)物,并使用Agilent Bioanalyzer 4150 評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量。 最后,使用NovaSeq 6000 測(cè)序平臺(tái)PE150 讀長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA 堿基識(shí)別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(sequenced reads),并經(jīng)測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查評(píng)估樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量,利用FeatureCounts 軟件計(jì)算出每個(gè)基因在各個(gè)樣本中的表達(dá)量每千堿基的片段映射讀取數(shù)(fragments per kilobase per million mapped reads,FPKM)。 運(yùn)用中科新生命云平臺(tái)(網(wǎng)址https:/ /bio-cloud.aptbiotech.com/tool)繪制主成分分析圖(principal component analysis,PCA)、差異基因分布火山圖、差異基因熱圖、功能富集(gene ontology,GO)分析上下調(diào)通路。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般觀察結(jié)果

對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)前觀察發(fā)現(xiàn),各組大鼠均表現(xiàn)為容易受到驚嚇,對(duì)抓取刺激反應(yīng)強(qiáng)烈,放置籠子30 min后各大鼠均活動(dòng)自由,正常飲水進(jìn)食。 隨著造模次數(shù)的增多,模型組大鼠表現(xiàn)為活動(dòng)量、體重、飲食、飲水的減少;造模和干預(yù)過程中有2 只模型組大鼠死亡。 解剖取材時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的大鼠肌肉筋膜是十分平整且呈鮮紅顏色,表明其血液供應(yīng)較充足,筋膜無粘連,觸摸無結(jié)節(jié)。 造模前各組大鼠皮毛光澤度好,正常進(jìn)食飲水和排便,活動(dòng)自如,對(duì)大鼠進(jìn)行體重的稱量(P< 0.05),見圖4A:結(jié)果顯示組間不存在顯著性差異。 隨著造模實(shí)驗(yàn)不斷進(jìn)行, 除對(duì)照組體重基本未見明顯變化外,打擊組及復(fù)合組大鼠體重均有不同程度下降,但是兩組之間下降趨勢(shì)一致。 行為學(xué)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4B,圖4C。

圖4 造模前體重與曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)Note. A. Body weight trend of 3 groups of rats before modeling. B. Distance of rat open field. C. Open field trajectory map.Figure 4 Weight and open field test

2.2 HE 染色

各組大鼠骨骼肌組織HE 染色結(jié)果如圖5 所示,對(duì)照組:骨骼肌組織排列整齊,肌膜結(jié)構(gòu)清晰,肌間隙正常,肌纖維改變未見明顯異常,纖維著色均勻,細(xì)胞分界清楚,走行一致,無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。打擊組:大鼠骨骼肌結(jié)構(gòu)不清,纖維紊亂,可見多處肌纖維斷裂(黑色箭頭),肌纖維著色均勻,細(xì)胞分界清楚,肌間隙明顯增寬,肌核分布不均,可見充血。 復(fù)合組:骨骼肌組織細(xì)胞分界清楚,與對(duì)照組相比,結(jié)構(gòu)紊亂(藍(lán)色箭頭),纖維著色不均,可見肌纖維斷裂,肌間隙稍增寬,肌間可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與打擊組對(duì)比,復(fù)合組在肌纖維斷裂周圍,有肌纖維核聚集(綠色箭頭)。

圖5 造模后三組HE 染色Figure 5 Three groups of HE staining after molding

2.3 復(fù)合組與對(duì)照組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

6 個(gè)樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,錯(cuò)誤率低(見表1)。設(shè)定每千堿基的片段映射讀取數(shù)FPKM 大于10 為高表達(dá),篩選FPKM 大于10 的基因繪制主成分分析圖(Principal Component Analysis, PCA)評(píng)估組間差異對(duì)照組組間差異小,與復(fù)合組有明顯差異,可進(jìn)一步分析差異基因(見圖6)。

表1 各樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量一覽表Table 1 Overview of data quality for each sample

圖6 主成分分析(PCA)Figure 6 Principal component analysis (PCA)

結(jié)合火山圖(見圖7A)與熱圖(見圖7B)篩選差異基因,可得出下調(diào)的差異基因包括:Tob2、Rgcc、Timp4、Ckmt2。 而上調(diào)的差異基因包括:Pf4、Ankrd23。 下調(diào)的Tob2 基因差異最為顯著:其屬于抑制蛋白家族(BTG/TOB 蛋白家族),涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞分化等多個(gè)生物學(xué)過程。BTG/TOB基因家族對(duì)早期肌纖維增殖有顯著影響,BTG1 有刺激成肌細(xì)胞中多種轉(zhuǎn)錄因子的活性的能力[20]。

圖7 差異基因火山圖與熱圖Note. A. Volcano plot of differentially expressed genes between CDM group and control group. B. Heat map of differentially expressed genes between CDM group and control group.Figure 7 Volcano map and heat map of differentially expressed genes

Ckmt2 的下調(diào)影響細(xì)胞能量代謝和線粒體功能。Pf4 是上調(diào)基因中差異最為顯著的基因,是一種由血小板釋放的細(xì)胞因子,參與凝血反應(yīng)和血小板功能,Pf4 可能與損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)[21]。

在GO 分析中(見圖8)下調(diào)通路的前20 包括細(xì)胞外基質(zhì)成分分泌的調(diào)節(jié)、磷酸肌酸合成及代謝過程等(P< 0.05)。 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是由多種蛋白質(zhì)和多糖組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu),為細(xì)胞提供支持和定向,同時(shí)也在信號(hào)傳遞和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用[22]。 ECM 成分的分泌和降解是由多種分子調(diào)節(jié)的,包括生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶[23]、組織因子等。 這些分子在細(xì)胞外環(huán)境中形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),可以通過多種信號(hào)通路調(diào)控ECM 成分的合成和降解,從而影響細(xì)胞的行為和功能。 磷酸肌酸(phosphocreatine, PCr)是肌肉細(xì)胞中的一個(gè)重要能量?jī)?chǔ)備物質(zhì),可以在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)迅速轉(zhuǎn)化為ATP,為肌肉提供能量。 磷酸肌酸代謝過程包括磷酸肌酸的合成和降解,這些過程是由多個(gè)酶催化和調(diào)控的,包括肌酸激酶、磷酸肌酸酶等。 同時(shí),磷酸肌酸的合成和降解也受多種因素的影響,如鍛煉強(qiáng)度、營(yíng)養(yǎng)狀況等。 膠原是ECM 中的主要成分之一,在細(xì)胞外環(huán)境中形成纖維狀結(jié)構(gòu),為組織提供強(qiáng)度和支持。 膠原生物合成過程包括多種酶的催化和調(diào)控,如蛋白多肽前體的加工、膠原纖維的組裝等。 這些過程受多種因素的影響,如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子等,可以通過多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)膠原的生物合成和分解。

圖8 復(fù)合組下調(diào)基因GO 分析Figure 8 Analysis of down-regulated gene GO in CDM group

前10 位的GO 分析上調(diào)通路包括突觸修剪、氧結(jié)合、氧氣輸送、氧載體活性、分子載體活性等(P<0.05)(見圖9)。 突觸修剪是指神經(jīng)元之間的突觸連接在發(fā)育和學(xué)習(xí)過程中會(huì)被調(diào)整和重塑的過程。突觸修剪的異常可能導(dǎo)致神經(jīng)元和肌肉之間的不恰當(dāng)連接,從而導(dǎo)致肌肉的收縮和骨骼肌的受損。而氧氣結(jié)合和氧載體活性的異常側(cè)面反映了本模型中所出現(xiàn)肌肉缺氧和細(xì)胞死亡,這些都是與骨骼肌損傷相關(guān)的生物學(xué)過程。 分子載體活性是指分子(如蛋白質(zhì)和其他生物分子)在細(xì)胞和組織內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和傳遞物質(zhì)的能力。 在骨骼肌損傷過程中,分子載體的異?？赡軐?dǎo)致物質(zhì)的不適當(dāng)運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn),從而導(dǎo)致細(xì)胞和組織的功能受損。

圖9 復(fù)合組上調(diào)基因GO 分析Figure 9 Analysis of up-regulated gene GO in CDM group

3 討論

選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)實(shí)驗(yàn)研究尤為重要。 本研究建立了一種新型大鼠慢性骨骼肌復(fù)合損傷模型:該動(dòng)物模型選擇了SD 大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過打擊損傷的方式模擬了復(fù)合型腰部骨骼肌損傷的病理過程,從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)估等多角度綜合評(píng)估損傷質(zhì)量、模型契合度。 本模型的行為學(xué)改變?yōu)榛顒?dòng)能力下降,病理生理學(xué)變化包括炎癥改變、肌腱斷裂、肌肉萎縮等。 這些變化與人類腰部骨骼肌損傷,如腰肌勞損具有相似性。 本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型采用測(cè)序技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),而Timp4 基因在大鼠肌肉再生過程中的表達(dá)水平下調(diào);Ckmt2 參與肌肉細(xì)胞的能量代謝過程,其變化可能會(huì)影響肌肉損傷后的修復(fù);Pf4 在炎癥反應(yīng)和肌肉修復(fù)過程的啟動(dòng)會(huì)被釋放到血液中,進(jìn)入損傷區(qū)域,并與其他細(xì)胞因子相互作用。 因此本模型測(cè)序結(jié)果中以上基因的變化側(cè)面提示本模型造模成功。

另外本研究也為今后探究骨骼肌損傷和修復(fù)過程中的分子機(jī)制和生物學(xué)過程提供了參考方向:GO 分析提示BP 突觸剪切、氧輸送、蛋白質(zhì)激活級(jí)聯(lián);MF 氧載活性、氧集合、觸珠蛋白結(jié)合;細(xì)胞定位(cellular component,CC)觸珠蛋白血紅蛋白復(fù)合物、細(xì)胞外區(qū)等在總差異通路排序的前15 位。 以上通路有助于理解骨骼肌物理模型基因調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制,推斷肌肉修復(fù)和再生過程中的分子細(xì)節(jié)。

本模型具有以下3 個(gè)方面的優(yōu)勢(shì):(1)創(chuàng)新性:采用的損傷方式包括重物外力打擊造成肌膜撕裂和長(zhǎng)時(shí)靜力壓導(dǎo)致肌肉萎縮等多種方式,盡可能地模擬復(fù)雜的腰部骨骼肌損傷情況。 (2)簡(jiǎn)便性:模型相對(duì)簡(jiǎn)單,通過查閱文獻(xiàn)[16-17]獲得較為精密的計(jì)算模型操作時(shí)間,有序的建立慢性模型,一方面人為外力影響因素較少,具有可復(fù)制性和實(shí)用性。 另一方面,下坡跑離心收縮模型方案需要長(zhǎng)達(dá)5 ~28 d[12,14]的造模時(shí)間,對(duì)比而言本模型方案只需要3 d, 節(jié)省人力物力。 (3)影響因素少:與注射布比卡因[9]等藥物方式造模相比,本復(fù)合模型基于物理造模方式,如該模型用于評(píng)價(jià)新藥治療骨骼肌損傷等疾病,不涉及藥物相互作用及藥物代謝等,干擾因素少,應(yīng)用潛力廣。 當(dāng)然本模型也存在局限性:大鼠強(qiáng)迫坐位固定器的機(jī)械標(biāo)準(zhǔn)化仍需精細(xì),減少誤差因素。

本研究為未來的骨骼肌損傷相關(guān)研究提供了一種新的模型創(chuàng)新方向,期望新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍芴岣呷祟愌抗趋兰p傷的治療效果,大鼠模型骨骼肌肌肉測(cè)序結(jié)果可以為骨骼肌損傷和修復(fù)的分子機(jī)制和生物學(xué)過程研究提供重要信息,并為研究和治療肌肉疾病提供潛在的靶點(diǎn)。