清腎顆粒含藥血清通過miR-23b-5p 靶向Nrf2 通路減輕NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化

劉 敏，金 華，呼 琴，陳 諾，張葉青，王億平

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230000；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，安徽 合肥 230000；3合肥綜合性國(guó)家科學(xué)中心大健康研究院，新安醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究所，安徽 合肥230000

慢性腎臟病（CKD）是全球日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率在逐年增加。腎纖維化被認(rèn)為是所有慢性腎臟病病例最終常見的病理途徑［1］。腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）則是造成腎纖維化的關(guān)鍵因素。有實(shí)驗(yàn)表明，miR-23b不僅在肝纖維化、肺纖維化中發(fā)揮重要作用［2,3］，其在腎纖維化中也發(fā)揮著重要作用，有研究表明miR-23b-3p可通過靶向降低漿細(xì)胞瘤可變易位基因1（PVT1）的表達(dá)，抑制糖尿病腎病和高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞模型中系膜細(xì)胞的增殖和纖維化［4］；也有研究表明，miR-23b-3p的缺失可誘導(dǎo)IgA腎?。?］；但這些研究并沒有進(jìn)一步驗(yàn)證miR-23b是如何參與腎纖維化的發(fā)生發(fā)展，其調(diào)節(jié)腎纖維化的具體通路是什么。Nrf2在炎癥、氧化和代謝應(yīng)激因子的條件下可以迅速被激活，因此Nrf2信號(hào)通路是體內(nèi)一條極為重要的抗氧化應(yīng)激通路［6］，它直接參與腎纖維化發(fā)生、發(fā)展和預(yù)防的進(jìn)程。已有研究證實(shí)，Nrf2是miR-23b潛在的下游靶基因［7］。因此，Nrf2抗氧化通路可能是miR-23b調(diào)節(jié)腎纖維化的通路之一。

前期研究表明，中藥復(fù)方清腎顆粒可通過干預(yù)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟組織及高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來(lái)減輕腎小管損傷及EMT的進(jìn)程［8］，以及清腎顆粒還可通過抑制氧化應(yīng)激NF/kB信號(hào)通路來(lái)改善腎小管EMT［9］。因此清腎顆粒能夠通過抗氧化機(jī)制延緩腎小管EMT 進(jìn)程。本研究實(shí)驗(yàn)選擇TGF-β1作為刺激因子，觀察NRK-52E細(xì)胞在轉(zhuǎn)分化過程中miR-23b是否對(duì)Nrf2通路靶向調(diào)節(jié)，并闡明清腎顆粒含藥血清減輕NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制。本研究證明清腎顆粒含藥血清能通過miR-23b-5p靶向Nrf2通路機(jī)制減輕NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，為中醫(yī)藥防治慢性腎臟病提供新的思路，具有鮮明的中醫(yī)特色和創(chuàng)新性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，2月齡，體質(zhì)量200±20 g，購(gòu)自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司，許可證號(hào)SCXK（蘇）2020-0009。動(dòng)物研究已獲安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批（倫理批號(hào)AHUCM-rats-2022071）。

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：正常大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株（NRK-52E），人胚胎腎細(xì)胞（HEK-293T）（賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 藥物

清腎顆粒由茵陳、丹參、大黃、白花蛇舌草、白術(shù)、豬苓、茯苓、白蔻仁、扁豆、薏苡仁、澤瀉、黃連、益母草、車前草組成。生藥材由安徽省中醫(yī)院的中藥房統(tǒng)一采購(gòu)，并且有中藥質(zhì)控及固定產(chǎn)地。清腎顆粒生產(chǎn)于安徽省中醫(yī)院制劑中心，皖藥制字BZ20080011，批號(hào)20210215，規(guī)格為10 g/袋，約含生藥34 g。

1.3 試劑

重組人TGF-β1細(xì)胞因子（PeproTech）；CCK8檢測(cè)試劑盒（BIOSS）；DMEM（cytiva）；PBS（Hyclone）；Trizol（Life technogies）；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（熒光染料）（novoprotein）；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（反轉(zhuǎn)錄試劑盒）（TaKaRa）；引物合成（SangonBiotech）；RIPA細(xì)胞裂解液（強(qiáng)）（Beyotime）；PVDF膜（Millipore）；Western一抗二抗去除液（Beyotime）；ECL 超敏發(fā)光試劑盒（Thermo）；山羊抗小鼠IgG（Zsbio）；山羊抗兔IgG（Zsbio）；GAPDH（Zsbio）；Nrf2（SantaCruz）；Keap1（bioss）；α-SMA（bioss）。

1.4 儀器

倒置顯微鏡（OLYMPUS）；培養(yǎng)箱（Thermo）；超凈工作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）；普通PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）；低速迷你離心機(jī)（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；高速臺(tái)冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；熒光定量PCR 儀（Thermo Scientific）；PIKO Plate Illuminator（Thermo Scientific）；超微量分光光度計(jì)（南京五義科技有限公司）；自動(dòng)曝光儀（上海培清科技有限公司）。

1.5 含藥血清的制備

將大鼠隨機(jī)分為藥物組和空白組，10只/組。藥物組大鼠給予清腎顆粒20 g/（kg·d）灌胃，連續(xù)給藥10 d后處死動(dòng)物，腹主動(dòng)脈無(wú)菌采血，常溫靜置2 h后，離心后并得到含藥血清，混勻后過濾除菌，56 ℃，30 min水浴滅活，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩？瞻捉M動(dòng)物給予等量生理鹽水灌胃，并如上法制備大鼠空白血清。

1.6 含藥血清和TGF-β1作用于NRK-52E細(xì)胞的刺激濃度和時(shí)間篩選

將NRK-52E 細(xì)胞株置于DMEM/F12 培養(yǎng)液中（DMEM與F12的比例為1∶1，培養(yǎng)液中含有青、鏈霉素各100 U/mL，10%FBS），在無(wú)菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；將細(xì)胞形態(tài)良好的NRK-52E傳代在6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度約50%時(shí)，將培養(yǎng)液更換為無(wú)血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化NRK-52E細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用胎牛血清（FBS）洗1～2遍，用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度，按照每孔5×104個(gè)細(xì)胞數(shù)鋪板到96孔板中。細(xì)胞貼壁后加入適量的TGF-β1，根據(jù)TGF-β1刺激濃度分為6 組（TGF-β1 濃度分別為0、5、7.5、10、12.5、15 ng/mL），放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)到0、24、48和72 h時(shí)取出。細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)法（CCK8法）檢測(cè)細(xì)胞活性：在96孔板中每孔加入10 μL CCK8進(jìn)行檢測(cè)，37 ℃孵育4 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度（A）值并計(jì)算細(xì)胞活性。

另取NRK-52E細(xì)胞，方法同上，待細(xì)胞貼壁后用TGF-β1（10 ng/mL）刺激，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，根據(jù)加入清腎顆粒含藥血清的濃度不同分為5組（分別更換為正常含藥血清、5%含藥血清、10%含藥血清、20%含藥血清、30%含藥血清的培養(yǎng)基）。邊緣孔加PBS緩沖液，分別在培養(yǎng)0、24、48和72 h時(shí)取出，在96孔板中每孔加入10 μL CCK8進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞活性。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)篩選出清腎顆粒含藥血清、TGF-β1刺激的最佳濃度和時(shí)間，再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

NRK-52E細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，用0.25%的胰蛋白酶消化，傳代接種到6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后用TGF-β1刺激，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～90%時(shí)，按照Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，將miR-23b-5p mimic、inhibitor以及陰性對(duì)照（NC）siRNA分別轉(zhuǎn)染到NRK-52E細(xì)胞，分為：模擬物空載對(duì)照組（TGF-β1+miR-23b-5p mimic-NC）；miR-23b-5p模擬物組（TGF-β1+miR-23b-5p mimic）；抑制劑空載對(duì)照組（TGF-β1+miR-23b-5p inhibitor-NC）；miR-23b-5p抑制劑組（TGF-β1+miR-23b-5p inhibitor）。

1.8 清腎顆粒含藥血清干預(yù)實(shí)驗(yàn)及回復(fù)實(shí)驗(yàn)

將清腎顆粒含藥血清作用于NRK-52E細(xì)胞（TGFβ1刺激），并轉(zhuǎn)染miR-23b-5p mimic，分組為：①正常組：NRK-52E+無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；②TGF-β1組（模型組）：DMEM 培養(yǎng)基+10 ng/mL TGF-β1；③清腎顆粒組：DMEM 培養(yǎng)基+10 ng/mL TGF-β1+20%清腎顆粒含藥血清；④miR-23b-mimic-NC組：DMEM 培養(yǎng)基+10 ng/mL TGF-β1+miR-23b-mimic-NC；⑤miR-23bmimic組：DMEM培養(yǎng)基+10 ng/mL TGF-β1+miR-23bmimic；⑥miR-23b-mimic+清腎顆粒組：DMEM 培養(yǎng)基+10 ng/mL TGF-β1+miR-23b-mimic+20%清腎顆粒含藥血清。

1.9 檢測(cè)方法

1.9.1 Western blot法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞中Nrf2通路分子（Keap1、Nrf2）、α-SMA蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白并測(cè)量蛋白濃度。分離總蛋白，電泳并轉(zhuǎn)膜。封閉2 h，TBST洗膜，加入一抗孵育，4 ℃過夜，然后加入二抗孵育1 h后洗膜。使用ECL發(fā)光試劑盒來(lái)檢測(cè)蛋白。使用ImageJ 軟件以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照GAPDH 的灰度值比值做統(tǒng)計(jì)分析。

1.9.2 RT-qPCR 法檢測(cè)NRK-52E 細(xì)胞 中miR-23b、Keap1、Nrf2、α-SMA mRNA的表達(dá) 使用Trizol試劑從NRK-52E細(xì)胞中提取各組細(xì)胞總RNA，按microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為擴(kuò)增模板進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增，qPCR反應(yīng)總體系為10 μL，應(yīng)條件為：95 ℃1 min；95 ℃20 s，60 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt方法分析miR-23b、Keap1、Nrf2、α-SMA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 檢測(cè)指標(biāo)的引物序列Tab.1 Primer sequence used for RT-qPCR

1.9.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-23b-5p 與Nrf2 的靶向關(guān)系 將Nrf2 的3'UTR 全長(zhǎng)克隆到pmirGLO載體中，命名為野生型Nrf2（Nrf2-WT），同時(shí)將Nrf2突變體克隆到pmirGLO載體中獲得Nrf2-MUT報(bào)告載體。隨后將293T細(xì)胞以1×105/孔的密度接種在24 孔板中，并通過lipofectamine 2000 將報(bào)告載體和miR-23b-5p mimics或miRNA陰性對(duì)照miR-NC共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞通過熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。若方差齊，組間比較采用t檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK8法測(cè)定NRK-52E細(xì)胞活性

2.1.1 TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的時(shí)間及濃度篩選 不同濃度TGF-β1 刺激NRK-52 細(xì)胞24 h，與NRK-52E組比較，A值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TGF-β1濃度為10 ng/mL時(shí)，與TGF-β1濃度為7.5 ng/mL及5 ng/mL相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與TGF-β1濃度為12.5 ng/mL及15 ng/mL相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故選擇TGF-β1刺激NRK-52細(xì)胞的最佳濃度為10 ng/mL，時(shí)間為24 h（表2）。

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)間段A值比較Tab.2 Comparison of absorbance values of TGF-β1-treated cells at different time points(Mean±SD,n=3)

2.1.2 清腎顆粒含藥血清作用濃度和時(shí)間的篩選 不同濃度清腎顆粒含藥血清作用時(shí)間為24 h 時(shí)，與正常含藥血清組相比，清腎顆粒含藥血清各組均明顯減少（P＜0.05）。隨著濃度升高，20%含藥血清組A值下降最顯著，其與5%、10%含藥血清組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與30%含藥血清組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。故選擇清腎顆粒含藥血清作用NRK-52細(xì)胞的最佳濃度為20%，時(shí)間為24 h。

表3 各組細(xì)胞不同時(shí)間段A值比較Tab.3 Comparison of absorbance values of the cells treated with TGF-β1 and the medicated serum at different dilutions(Mean±SD,n=3)

2.2 NRK-52E細(xì)胞中miR-23b-5p對(duì)Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

分別將miR-23b-5p mimic、inhibitor轉(zhuǎn)染到NRK-52E細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，miR-23b-5p模擬物組的miR-23b-5p、Nrf2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量高于模擬物空載對(duì)照組（P＜0.05）；miR-23b-5p 抑制劑組的miR-23b-5p、Nrf2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于抑制劑空載對(duì)照組（P＜0.05，表4、圖1）。

圖1 NRK-52E細(xì)胞中miR-23b-5p對(duì)NRF2 mRNA的影響Fig.1 Effect of miR-23b-5p on NRF2 mRNA in NRK-52E cells.A:Relative expression of miR-23b-5p mRNAin NRK-52E cells.B:Relative expression of Nrf2 mRNAin NRK-52E cells.**P＜0.05;##P＜0.05.

表4 NRK-52E細(xì)胞中miR-23b-5p對(duì)Nrf2 mRNA的影響Tab.4 Effect of miR-23b-5p on Nrf2 mRNAin NRK-52E cells(Mean±SD,n=5)

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-23b-5p與Nrf2的靶向關(guān)系

Rno-miR-23b-5p與Rno-Nrf2之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2B），NC mimics+Rno-Nrf2-wt 組、Rno-miR-23b-5p+Rno-Nrf2-wt 組、NC mimics+Rno-Nrf2-mu 組、RnomiR-23b-5p+Rno-Nrf2-mu組的熒光素酶相對(duì)活性分別為1.000±0.024、0.581±0.048、1.000±0.030、0.968±0.024。與NC mimics+Rno-Nrf2-wt組相比，Rno-miR-23b-5p+Rno-Nrf2-wt組的相對(duì)熒光素酶活性降低（P＜0.05）；而當(dāng)Nrf2 基因3'UTR 的潛在結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變后，與NC mimics+Rno-Nrf2-mu組相比，Rno-miR-23b-5p+Rno-Nrf2-mu組的相對(duì)熒光素酶活性差異沒有顯著變化（P＞0.05，圖2）。

圖2 Rno-miR-23b-5p和Rno-Nrf2靶位點(diǎn)結(jié)合示意圖(A)及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)二者之間的相互作用(B)Fig.2 Rno-miR-23b-5p and Rno-Nrf2 target site binding (A)and interaction between Rno-miR-23b-5p and Rno-Nrf2 analyzed by dual luciferase reporter gene assay(B).***P＜0.05.

2.4 清腎顆粒含藥血清對(duì)NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的干預(yù)作用

2.4.1 Western blot法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞中Nrf2通路分子（Keap1、Nrf2）、α-SMA 蛋白表達(dá) 與正常組比較，TGF-β1組細(xì)胞Nrf2表達(dá)降低，Keap1和α-SMA表達(dá)升高（P＜0.05）。與TGF-β1組比較，清腎顆粒組、miR-23bmimic組Nrf2表達(dá)均升高，Keap1和α-SMA表達(dá)均降低（P＜0.05）。與miR-23b-mimic-NC 組比較，miR-23bmimic組Nrf2表達(dá)升高，Keap1和α-SMA表達(dá)降低（P＜0.05）。與miR-23b-mimic組比較，miR-23b-mimic＋清腎顆粒組Nrf2表達(dá)升高，Keap1和α-SMA表達(dá)均降低（P＜0.05，表5、圖3）。

圖3 各組細(xì)胞Nrf2、Keap1、α-SMA蛋白表達(dá)情況比較Fig.3 Comparison of Nrf2,Keap1 and α-SMA protein expression among the group detected by Western blotting.

表5 NRK-52E細(xì)胞中Nrf2、Keap1、α-SMA蛋白表達(dá)比較Tab.5 Comparison of Nrf2,Keap1 and α-SMAprotein expression in NRK-52E cells(Mean±SD,n=3)

2.4.2 RT-qPCR 法 檢測(cè)NRK-52E 細(xì)胞中miR-23b、Keap1、Nrf2、α-SMA mRNA 的表達(dá) 與正常組比較，TGF-β1 組miR-23b-5p、Nrf2 mRNA 表達(dá)量降低，Keap1、α-SMA mRNA表達(dá)量升高（P＜0.05）。與TGF-β 1組比較，清腎顆粒組、miR-23b-mimic組miR-23b-5p、Nrf2 表達(dá)量均升高，Keap1、α-SMA 表達(dá)均水平降低（P＜0.05）。與miR-23b-mimic-NC 組比較，miR-23bmimic組miR-23b-5p、Nrf2表達(dá)量升高，Keap1、α-SMA表達(dá)量降低（P＜0.05）。與miR-23b-mimic比較，miR-23b-mimic+清腎顆粒組miR-23b-5p、Nrf2表達(dá)量明顯升高，Keap1、α-SMA表達(dá)量降低（P＜0.05，表6）。

表6 NRK-52E細(xì)胞miR-23b-5p、Keap1、Nrf2、α-SMAmRNA表達(dá)比較Tab.6 Comparison of miR-23b-5p,Keap1,Nrf2 and α-SMAmRNAexpressions in NRK-52E cells(Mean±SD,n=6)

2.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 與正常組比較，TGF-β1組中ROS熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05）。與TGF-β1組比較，清腎顆粒組、miR-23b-mimic 組ROS 熒光強(qiáng)度均降低（P＜0.05）。與miR-23b-mimic-NC 組比較，miR-23bmimic 組ROS 熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05）。與miR-23bmimic比較，miR-23b-mimic+清腎顆粒組ROS熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05，表7）。

表7 NRK-52E細(xì)胞中ROS平均熒光強(qiáng)度比較Tab.7 Comparison of mean fluorescence intensity of ROS in NRK-52E cells (Mean±SD,n=3)

3 討論

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）通常被認(rèn)為是腎纖維化的主要調(diào)節(jié)因子，因?yàn)樵谀I臟損傷后，受損的腎小管上皮細(xì)胞（TEC）在G2/M期停滯并分泌大量TGF-β1，觸發(fā)鄰近腎成纖維細(xì)胞的活化和轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞［9］。因此其已被廣泛應(yīng)用于腎纖維化研究中的NRK-52E細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化［10］。本研究以此為基礎(chǔ)建立NRK-52E細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化模型。

miRNA作為一種短鏈非編碼小分子RNA，能夠通過在轉(zhuǎn)錄后水平上完全或部分結(jié)合靶蛋白編碼的mRNAs進(jìn)行降解或翻譯抑制，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)［11］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs參與腎纖維化的調(diào)節(jié)過程，成為干預(yù)腎臟纖維化治療的新靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)miR-23b在高糖處理的HK-2（人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞）和DN（糖尿病腎?。┬∈竽I組織中水平顯著降低，miR-23b被確定為糖尿病腎病中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制因子［12］。有研究確認(rèn)糖尿病患者的外周血和1型或2型糖尿病動(dòng)物的腎臟中miR-23b 的水平低于非糖尿病患者，且miR-23b的過度表達(dá)可減輕DN小鼠的高白蛋白尿和腎纖維化［13］。本課題組在前期研究中已通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及尿外泌體Small RNA測(cè)序技術(shù)，篩選出慢性腎衰竭患者體內(nèi)97個(gè)差異miRNA（包含84個(gè)上調(diào)miRNA和13個(gè)下調(diào)miRNA），其中miR-23b-5p在慢性腎衰竭患者體內(nèi)的表達(dá)是顯著下調(diào)的［14］。因此miR-23b-5p參與腎纖維化的發(fā)生發(fā)展已被證實(shí)，且其在腎纖維化中的表達(dá)顯著下調(diào)。已有實(shí)驗(yàn)證明，氧化應(yīng)激是腎纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制氧化應(yīng)激可延緩腎纖維化的進(jìn)程［15-17］。氧化應(yīng)激可直接或間接地引起腎皮質(zhì)固有免疫細(xì)胞活化及周圍組織、血管中大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)［18］，大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)可引起腎皮質(zhì)缺氧加重，進(jìn)而促使腎間質(zhì)纖維化的形成。而Nrf2是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白，其可以通過抑制腎臟中氧化應(yīng)激從而起到對(duì)抗腎纖維化的作用［19,20］。在氧化應(yīng)激環(huán)境中，Nrf2與其主要抑制劑Keap1從細(xì)胞質(zhì)中分離并向核內(nèi)遷移，激活許多保護(hù)基因（如血紅素加氧酶-1、對(duì)氧磷酶（PON）-1等）的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而起到抵御氧化應(yīng)激的作用［21］。而本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，miR-23b-5p過表達(dá)時(shí)，Nrf2 mRNA表達(dá)顯著升高，而miR-23b-5p表達(dá)沉默時(shí)，Nrf2 mRNA表達(dá)顯著降低。此表明Nrf2抗氧化通路極可能是miR-23b-5p參與腎纖維化進(jìn)展的靶向調(diào)節(jié)通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，miR-23b-5p能與Nrf2基因3'UTR結(jié)合，此說(shuō)明Nrf2基因?yàn)閙iR-23b-5p的下游基因。因此miR-23b-5p在腎纖維化中的調(diào)節(jié)通路為Nrf2抗氧化通路。

本課題組團(tuán)隊(duì)立足于“熱能化濕、燥濕為本、化濕攻下、化瘀通絡(luò)”等新安醫(yī)學(xué)理論基礎(chǔ)，研究出慢性腎臟病的基本病機(jī)為“濕熱傷腎、濕熱與瘀交結(jié)”，清腎顆粒由茵陳、丹參、大黃、白花蛇舌草、白術(shù)、豬苓、茯苓、白蔻仁、扁豆、薏苡仁、澤瀉、黃連、益母草、車前草組成，全方共奏清熱化濕，祛瘀泄?jié)嶂?。本課題組進(jìn)一步采用超高效液相色譜-混合四極桿軌道質(zhì)譜（UPLC-Q-orbitrap HRMS）法鑒定出清腎顆粒的42種化合物，在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織中檢測(cè)到清腎顆粒的9、10、11、10和18個(gè)原型組分，這些化合物主要包括黃芩苷、大豆苷元、染料木素、芹菜素、黃連素、鄰苯二酚、龍膽酸、D-（+）-色氨酸、核黃素等［22］。其中黃連素、芹菜素、黃芩苷、染料木素等均有有抗腎臟纖維化、抑制EMT作用［23-26］。

通過多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)證實(shí)清腎顆粒能夠有效改善CKD濕熱證患者的臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延緩腎衰竭進(jìn)展［27］；有效改善腎性貧血、營(yíng)養(yǎng)不良、鈣磷代謝紊亂、胃腸功能紊亂等CKD并發(fā)癥［28］；且安全性良好［29］。前期研究也發(fā)現(xiàn)，清腎顆粒在抗腎纖維化中具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑作用特點(diǎn)［30-32］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，清腎顆粒含藥血清可以升高miR-23b mRNA的表達(dá)，以及升高Nrf2 mRNA及蛋白的表達(dá)，降低Keap1及α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)，以及降低細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。其中Keap1是可以控制Nrf2的激活和穩(wěn)定性［33］，二者為相互抑制狀態(tài)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Keap1失活，Nrf2表達(dá)增多，進(jìn)而起到抗氧化作用。EMT被定義為上皮細(xì)胞標(biāo)志物（如E-cadherin）的大量丟失、間充質(zhì)標(biāo)志物（α-SMA）的獲取、腎小管基底膜的破壞，以及成纖維細(xì)胞侵入伴隨著前纖維化分子的產(chǎn)生［34］。因此本研究通過α-SMA mRNA和蛋白以及ROS的顯著降低證實(shí)清腎顆粒抑制了NRK-52E 細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，通過Keap1的顯著降低和Nrf2的顯著升高證實(shí)清腎顆?？杉せ頝rf2抗氧化通路，通過miR-23b mRNA的顯著升高證實(shí)清腎顆?？缮险{(diào)miR-23b的表達(dá)。綜合以上，本實(shí)驗(yàn)證明了清腎顆粒含藥血清可以通過上調(diào)miR-23b-5p，激活Nrf2抗氧化通路，進(jìn)而抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程，減慢腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-23-5p可通過靶向調(diào)節(jié)Nrf2通路活性進(jìn)而抑制NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；以及清腎顆粒含藥血清可以通過上調(diào)miR-23b-5p的表達(dá)，激活Nrf2抗氧化通路，進(jìn)而減輕腎小管EMT進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了miR-23b-5p在腎纖維化中的具體調(diào)節(jié)通路，為清腎顆粒臨床治療慢性腎臟病患者提供新的理論依據(jù)，再次表明了清腎顆粒在抗腎纖維化方面多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，并為中醫(yī)藥防治腎臟病提供新的思路和方向。