基于Keap1 /Nrf2信號通路探討中藥干預腎纖維化研究進展

陳 曦,董凱旋,周 榮,于小勇

(1. 陜西中醫(yī)藥大學,陜西 咸陽 712046;2. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院,陜西 西安 710003)

慢性腎臟病(CKD)是慢性進行性且嚴重危害人類生命健康的常見病,據(jù)統(tǒng)計全球CKD患病率約為13.4%[1],根據(jù)橫斷面調(diào)查中國患者CKD患病率為10.8%[2],且有日益增高趨勢。腎纖維化是進展至終末期腎臟病主要的病理過程,其發(fā)病機制錯綜復雜,臨床治療上大多用RAAS系統(tǒng)抑制劑以改善癥狀和延緩 CKD發(fā)展,治療方案仍具有局限性。中藥具有相對安全性高、多途徑、多靶點的優(yōu)勢特點,單味中藥及中藥復方有效成分在防治腎纖維化方面具有獨特優(yōu)勢,諸多的學者開始研究以Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)/轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)作為治療腎纖維化的藥理靶點,Keap1/Nrf2通路在抗氧化應激防御系統(tǒng)起關(guān)鍵作用,可通過激活Keap1/Nrf2信號通路誘導抗氧化相關(guān)蛋白的表達以減輕氧化應激和炎癥反應,進而延緩腎纖維化進程[3]。中藥靶向調(diào)控相關(guān)信號通路在防治腎纖維化方面具有重要意義。本文通過閱讀文獻關(guān)于Keap1/Nrf2信號通路在腎纖維化中的調(diào)控作用機制及近年來中藥通過靶向Keap1/Nrf2信號防治腎纖維化研究成果進行綜述,以期為臨床中醫(yī)藥防治腎纖維化提供更多循證依據(jù)。

1 Keap1/Nrf2信號通路概況

Keap1/Nrf2通路作為抗氧化應激信號通路,具有減輕炎癥反應,提高機體組織防御氧化能力的作用[4]。Keap1是氧化應激反應傳感器蛋白,作為負向調(diào)節(jié)因子抑制Nrf2轉(zhuǎn)錄活性。Keap1的5個結(jié)構(gòu)域包括有N 末端區(qū)域、BTB蛋白結(jié)構(gòu)域、IVR干預區(qū)域、雙甘氨酸重復結(jié)構(gòu)域(Kelch區(qū))和C末端區(qū)域。BTB蛋白參與Keap1與Cul3在N末端區(qū)域結(jié)合與Keap1同二聚化,促進Nrf2泛素化和抑制其活性,使Nrf2穩(wěn)定存在細胞質(zhì)中[5]。IVR區(qū)域含有 Keap1 反應性的半胱氨酸殘基,是Nrf2的負向調(diào)節(jié)器,含有相關(guān)序列核輸出信號,在細胞質(zhì)中具有定位作用[6]。Kelch區(qū)包含6個重復Kelch基序,是Keap1與Nrf2結(jié)合的區(qū)域[7]。Nrf2作為抗氧化應激反應的主要轉(zhuǎn)錄蛋白,其轉(zhuǎn)錄活性受Keap1控制,通過上調(diào)細胞抗氧化基因表達發(fā)揮減輕氧化應激作用。Nrf2的7個 Nrf2-ECH 同源結(jié)構(gòu)域(Neh1-7)調(diào)節(jié)Nrf2轉(zhuǎn)錄活性[8]。Neh1結(jié)構(gòu)域是Nrf2結(jié)合小腱膜纖維肉瘤蛋白(Maf)形成異源二聚體,與抗氧化物反應元件(ARE)結(jié)合使Nrf2二聚化產(chǎn)生活性。Neh2結(jié)構(gòu)域含有DLG和ETGE序列,在Kelch區(qū)域與Keap1結(jié)合,調(diào)控Nrf2活性。Neh3是反式激活活性結(jié)構(gòu)域,Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域協(xié)同促進Nrf2與ARE結(jié)合控制下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。Neh5結(jié)構(gòu)域調(diào)控Nrf2細胞定位,Neh6區(qū)域含大量絲氨酸,Nrf2在該區(qū)域降解,在Neh7結(jié)構(gòu)域抑制 Nrf2表達[6,9]。

在正常功能狀態(tài)下,Keap1與Nrf2處于細胞質(zhì)中穩(wěn)定結(jié)合,Keap1在BTB區(qū)與Cul3結(jié)合,與Nrf2在Kelch區(qū)結(jié)合,形成Keap1-Nrf2復合物,Keap1介導Nrf2泛素化,促進蛋白酶體降解Nrf2,Nrf2以低水平狀態(tài)維持其抗氧化效能。氧化應激時,Keap1-Nrf2結(jié)構(gòu)破壞,導致Keap1的BTB和IVR結(jié)構(gòu)域上的半胱氨酸殘基氧化,Keap1構(gòu)像改變以及Keap1-Cul3復合物的分離,抑制Nrf2泛素化。Nrf2的DLR基序從Keap1的DGR結(jié)構(gòu)域分離,Nrf2磷酸化上調(diào)細胞質(zhì)中Nrf2水平,Nrf2與Keap1解離并轉(zhuǎn)移到細胞核中,Nrf2與Maf結(jié)合并識別ARE,促進下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄編譯相關(guān)蛋白,以增強細胞組織抗氧化能力[10-11]。見圖1。

圖1 Keap1-Nrf2信號通路激活機制

2 Keap1 /Nrf2在腎纖維化中的作用

腎纖維化是以成纖維細胞增殖合成細胞外基質(zhì) (ECM) 積聚沉積形成瘢痕組織、破壞腎臟結(jié)構(gòu)功能為特征。在病理條件下,腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞表型和活化的成纖維細胞,發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),最后形成腎間質(zhì)肌纖維母細胞[12],腎纖維化機制與氧化應激損傷、炎細胞浸潤、EMT及ECM積聚有關(guān)。ECM的過度沉積及EMT共同加劇腎損傷的嚴重程度,加快CKD進展[13]。研究表明,氧化應激是腎臟疾病發(fā)病和進展的主要影響因素,在CKD的病理生理及相關(guān)并發(fā)癥中起重要作用。氧化應激狀態(tài)下活性氧(ROS)積聚過多導致氧化還原系統(tǒng)失衡,促進炎性因子浸潤,加劇炎癥反應及細胞損傷,誘導促纖維化細胞因子活化,使腎小球ECM沉積,進而引起系膜增厚,腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化,加重腎臟損傷和腎功能減退,加速腎纖維化進展[14-15],因此調(diào)控氧化應激及炎癥反應是管理CKD的重要舉措。

在缺氧缺血等條件下,細胞線粒體功能失調(diào),產(chǎn)生大量ROS堆積導致DNA損傷,腎臟啟動氧化應激反應,刺激釋放炎性因子,誘導促纖維化細胞因子和ECM蛋白的表達,ECM過度沉積,進一步腎纖維化。Keap1 /Nrf2 與炎癥反應、細胞損傷、細胞凋亡等多種病理生理過程密切相關(guān)[16]。氧化應激促進激活Nrf2并上調(diào)表達,活化的Nrf2抑制炎性因子表達,ROS產(chǎn)生減少,可顯著減輕腎損傷,改善腎臟功能。研究表明,模型大鼠中使用Nrf2激活劑,Nrf2的抗氧化作用能明顯改善腎小管損傷,延緩CKD進程[17],缺血再灌注損傷模型及UUO小鼠模型中小鼠的Nrf2表達明顯上調(diào),有效降低模型小鼠氧化應激損傷和炎癥反應程度,具有保護腎臟的功能[18]。孫德胤等[19]研究發(fā)現(xiàn),通過激活Keap1/Nrf2信號通路作用于NS模型大鼠可抑制炎癥反應,減少生成氧化應激產(chǎn)物,發(fā)揮抗腎纖維化作用。Adelusi等[3]研究發(fā)現(xiàn),糖尿病腎病晚期代謝終產(chǎn)物可能會引發(fā)氧化應激,通過激活Keap1/Nrf2,下調(diào)Keap1,促使Nrf2移位至細胞核,抑制ROS過度產(chǎn)生,下調(diào)纖維連接蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子β1蛋白表達,明顯減緩糖尿病腎病的發(fā)展,研究結(jié)果揭示Keap1下調(diào)在改善腎纖維化中發(fā)揮一定的作用。Aminzadeh等[20]研究發(fā)現(xiàn),Nrf2缺陷會導致老年雌性小鼠發(fā)生狼瘡腎炎,缺乏Nrf2基因小鼠也因易感染鏈脲佐菌素而誘發(fā)糖尿病腎病,這表明通過調(diào)控Nrf2基因水平可以防治腎臟病相關(guān)并發(fā)癥。CKD模型大鼠出現(xiàn)腎小球硬化、炎癥和腎纖維化與Nrf2及靶基因表達下調(diào)相關(guān),Nrf2的抗氧化功效作用被證實對糖尿病腎病、CKD、腎纖維化的病理變化產(chǎn)生重要的影響[21]。雖然Keap1/Nrf2信號與腎纖維化的發(fā)病機制尚未直接關(guān)聯(lián),但通過現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),激活Keap1/Nrf2信號傳導和減少ROS過量產(chǎn)生來改善和緩解氧化應激損傷是保護腎功能和防治腎纖維化的有效策略[22]。

綜上所述,Keap1/Nrf2是通過Nrf2與Keap1解離,促進Nrf2移位入核和Nrf2磷酸化發(fā)出信號,可以減輕氧化應激引起的腎臟相關(guān)疾病。激活Keap1/Nrf2信號通路可轉(zhuǎn)錄表達抗氧化酶基因,清除ROS,延緩腎纖維化進展[23]。因此調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路發(fā)揮抗腎纖維化作用是重要的研究方向。

3 中醫(yī)藥干預Keap1/Nrf2信號治療腎纖維化

現(xiàn)代醫(yī)學研究表明,治療腎臟疾病的中藥具有抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡及防治腎纖維化作用,對于改善腎臟結(jié)構(gòu)功能、延緩腎纖維化進程等方面有重要研究意義。腎纖維化病機總結(jié)為本虛標實,以脾腎虧虛為本,血瘀、濁毒為標[24],在中醫(yī)辨證論治理論指導下應以扶正祛邪、健脾益腎、活血通絡、通腑泄?jié)釣橹畏╗25]。中醫(yī)藥研究單味中藥、中藥提取物及中藥復方中有效成分可調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路治療腎纖維化,有效提高機體抗氧化防御能力,抑制炎癥反應和延緩腎臟纖維化,減輕尿蛋白等臨床癥狀。因此,基于近年來學者們研究單味中藥及中藥復方通過干預Keap1/Nrf2信號通路治療腎纖維化作用機制進行總結(jié)歸類。

3.1單味中藥及其提取物

3.1.1補虛 補虛類藥物具有扶正祛邪作用,可增強免疫力、抗氧化、抗應激,促進核酸代謝及蛋白合成[26]。黃芪功效為補氣升陽、排毒生肌,其有效成分黃芪甲苷具有抗炎、抑制纖維化的作用[27],可抑制氧化反應、提高抗氧化能力,相應地減少ROS堆積。徐進等[28]研究總結(jié)黃芪甲苷具有抗炎性蛋白、清除氧自由基的作用,通過下調(diào)纖維化因子表達,逆轉(zhuǎn)EMT進而延緩腎纖維化進展。還有研究顯示,黃芪多糖通過激活Nrf2-Keap1信號通路發(fā)揮抗炎反應效能[29]。這表明黃芪有效成分可通過激活Keap1/Nrf2防治腎纖維。當歸功效為補血活血,黃芪和當歸藥對能夠改善DM小鼠腎臟損傷,減少蛋白尿、改善腎功能、抑制高血糖相關(guān)氧化應激反應,提高抗氧化能力,作用機制可能與激活Nrf2/HO-1通路關(guān)聯(lián)[30]。淫羊藿功效為補腎助陽,牟俊杰等[31]對腎缺血再灌注大鼠模型分別以25,50,100 mg/kg灌胃淫羊藿苷7 d,結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可有效減輕模型大鼠腎缺血和氧化應激狀態(tài),改善腎功能,量效關(guān)系成正比,與上調(diào)Nrf2水平,介導Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)。人參功效為補脾益腎、生津養(yǎng)血。Guo等[32]通過動物研究發(fā)現(xiàn),人參酚通過激活 Keap1/Nrf2傳導抑制氧化應激,發(fā)揮抗纖維化作用。杜仲功效為補益肝腎,現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)杜仲具有強抗氧化活性、降血糖等功效,許碧琪等[33]分別以80,160 mg/(kg·d)杜仲黃酮給糖尿病腎病模型小鼠灌胃給藥共60 d,結(jié)果發(fā)現(xiàn)杜仲黃銅可降低模型小鼠血糖和改善腎功能,通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路,抑制腎臟組織氧化應激狀態(tài),降低腎臟組織氧化損傷程度,保護腎臟結(jié)構(gòu)功能。山藥補脾益腎,研究顯示,山藥可通過上調(diào)Nrf2、HO-l蛋白的表達,提高組織抗氧化功能減少大鼠病理損傷[34]。

3.1.2活血化瘀 活血祛瘀類中藥具有提高細胞組織代謝,改善毛細血管通透性,減輕炎癥反應等作用[35]。丹參活血祛瘀、涼血消癰。吳平亞等[36]用5,10,20 mg/(kg·d)丹參素給糖尿病腎病小鼠灌胃42 d,結(jié)果表明丹參素可抑制MEK、ERK蛋白磷酸化,上調(diào)Nrf2蛋白表達,改善DN模型大鼠腎功能及腎臟纖維化。川芎功效為活血行氣。研究發(fā)現(xiàn)川芎提取物可促進Nrf2表達, 激活下游抗氧化相關(guān)基因的表達,從而減輕氧化應激對腎臟的損傷[37]。姜黃功效為破血行氣、通絡止痛。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可上調(diào)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子以減緩炎癥和氧化應激反應,從而改善腎小球ECM過度沉積,減輕腎臟損傷[38],還可啟動Nrf2/HO-1發(fā)揮抗氧化效能,改善足細胞損傷[39],可見姜黃可通過調(diào)控Nrf2信號通路發(fā)揮抗腎纖維作用。三七功效為祛瘀消腫。董蘇敏等[40]通過藥理研究發(fā)現(xiàn),三七總皂苷能有效改善糖尿病小鼠腎臟病理損傷,與激活Nrf2/HO-1信號傳導減輕氧化應激及炎癥反應有關(guān)。紅景天具有益氣活血功效。紅景天苷是紅景天中提取的有效成分,可減輕腎臟細胞損傷,延緩糖尿病腎病腎纖維化進展[41]。研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷通過上調(diào)Nrf2的表達,減少高級糖基終產(chǎn)物引起的細胞凋亡并改善腎臟組織損傷,這說明紅景天有效成分能抑制腎纖維化,與其激活體內(nèi)Nrf2信號以減輕炎癥和抑制細胞凋亡相關(guān)[42]。

3.1.3通腑泄?jié)?腎絡受損使得水液代謝失調(diào),津液不化,氣血運行不暢,久聚生成瘀毒,濁毒久郁體內(nèi)損傷腎臟,因此中醫(yī)以通腑泄?jié)釣榉ㄖ委熌I纖維化。大黃具有瀉下攻積、涼血解毒功效。賈合磊等[43]研究發(fā)現(xiàn)大黃提取物能改善腎損傷模型大鼠腎臟結(jié)構(gòu)功能,且腎損傷大鼠的細胞凋亡率下降,Keap1、HO-1與Nrf2和p-Nrf2蛋白水平比值顯著升高,這表明大黃提取物可介導Keap1/Nrf2通路抑制釋放炎性因子和腎組織細胞凋亡,發(fā)揮抗腎纖維化作用。茯苓功效為利水、滲濕、健脾。陳丹倩[44]研究發(fā)現(xiàn)茯苓的有效成茯苓酸可通過調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路減輕氧化應激與炎癥反應,抑制成纖維化因子活化,減少EMT積聚和ECM沉積,抑制腎纖維形成?；⒄裙π榍鍩崂麧窠舛尽；⒄溶帐腔⒄鹊闹饕煞?又稱白藜蘆醇苷,藥理研究表明其具有抗炎、抗氧化等多藥理作用,白藜蘆醇苷可通過激活Keap1-Nrf2信號通路抑制腎纖維化,減緩CKD進展[45]。黃連功效為清熱燥濕、瀉火解毒。劉月等[46]研究發(fā)現(xiàn),黃連激活Nrf2/HO-1信號通路可減輕糖耐量異常模型大鼠腎損傷,黃連素具有改善小鼠糖尿病腎病腎臟損害作用,可能與調(diào)控Keap1-Nrf2信號通路改善氧化應激相關(guān)[47]。黃連主要成分小檗堿是一種天然化合物,通過上調(diào) Nrf2表達抑制氧化反應及發(fā)揮抗炎作用[48]。這些研究均表明黃連可通過調(diào)控Keap1-Nrf2信號通路防治腎纖維化。

3.2中藥復方 腎纖維化病機虛實夾雜,錯綜復雜,中藥復方基于“辨證論治”“整體觀念”的中醫(yī)理論特點指導,現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)中藥通過多組分、多靶點協(xié)同調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路改善腎纖維化,獲得良好的臨床療效。蟲草益腎方由冬蟲夏草菌絲粉、黃芪、熟大黃、水蛭等組成,具有清化濁毒之效。羅珊[49]研究發(fā)現(xiàn),蟲草益腎方能抑制Keap1蛋白表達,上調(diào)Nrf2表達,促進Nrf2抗氧化信號通路激活,保護輸尿管梗阻大鼠腎臟功能,發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用。益氣化濕通絡方由黃芪、當歸、川芎、紅花、地龍、水蛭、仙茅等中藥組成,具有益氣、化濕、通絡功效,通過調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路維持炎癥與抗氧化反應平衡,影響促纖維化蛋白表達,抑制腎切除大鼠腎纖維化[50]。金匱腎氣丸具有溫補腎陽、行氣化水功效,通過激活Keap1/Nrf2信號通路,抑制Keap1蛋白表達,增加Nrf2表達,改善慢性腎衰竭大鼠受損的腎臟功能[51]。芪精益腎湯由黃芪、黃精、川芎、人參葉四味藥組成,具有益氣活血功效。陶春鶴等[52]研究發(fā)現(xiàn),芪精益腎湯通過促進Nrf2/HO-1信號傳導,提高DN大鼠腎組織抗氧化應激能力,減輕腎臟組織損傷,下調(diào)FN的表達,這表明芪精益腎湯可以抑制ECM沉積,改善腎臟結(jié)構(gòu)功能,能有效延緩腎纖維化進展。綜上所述,體現(xiàn)了中藥復方具有多靶點多效應調(diào)控的特點,因此研究以Keap1/Nrf2信號通路為切入點作為臨床中藥及中藥復方改善腎臟纖維化新的方向,值得進一步深入探討。

4 小 結(jié)

腎纖維化是一個多機制、多因素參與的動態(tài)的過程,其形成發(fā)展與多種細胞因子和信號通路異常表達調(diào)控相關(guān),氧化應激是CKD進展的各個階段的共同特征,因此,干預相關(guān)信號通路控制氧化應激以延緩腎纖維化進程是重要的研究方向。隨著中醫(yī)藥不斷發(fā)展以及中藥在臨床上治療腎纖維化廣泛應用,諸多研究人員們從細胞分子微觀角度研究了中藥單體及中藥復方干預腎纖維化信號通路的作用機制。Keap1/Nrf2信號通路作為抗氧化應激的經(jīng)典信號通路之一,研究已被證實通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2信號通路,Nrf2可作為治療腎纖維化的藥物靶點,通過抑制Keap1表達,上調(diào)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子表達,調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路發(fā)揮抗氧化應激作用,為臨床防治腎纖維化提供新途徑。中藥具有多成分、多途徑、多靶點、多系統(tǒng)且毒副作用小等優(yōu)點,中醫(yī)角度認為腎纖維化是病邪入侵腎絡,久積腎絡瘀阻,繼而形成微型癥積, 與西醫(yī)損傷因子致成纖維細胞增生,微循環(huán)持續(xù)受損,進而形成腎纖維化的過程極為相似[53]。上述研究的單味中藥及中藥復方具有扶正祛邪、活血通絡、通腑泄?jié)岬裙π?通過激活Keap1/Nrf2信號通路可減少ECM沉積、下調(diào)成纖維因子表達,保護腎功能,延緩減輕腎纖維化進展。因此,基于Keap1/Nrf2信號通路靶向中藥防治腎纖維化有望成為新的治療策略,中藥在防治腎纖維化方面發(fā)揮獨特優(yōu)勢,能有效延緩CKD進展,且在治療上取得了良好的臨床療效,具有廣闊的研究前景。但目前研究單味中藥及中藥復方通過調(diào)控Keap1/Nrf2通路發(fā)揮抗氧化抑制纖維化的臨床及動物研究均較少,現(xiàn)有研究是關(guān)于通過干預Keap1/Nrf2信號通路與治療腎纖維化的相關(guān)研究,還尚未有直接明確中醫(yī)藥調(diào)控Keap1/Nrf2信號抗腎纖維化的研究報道,日后仍需要更加深入系統(tǒng)的研究。不論是動物研究還是臨床研究,對Keap1/Nrf2信號通路大多研究調(diào)控Nrf2靶點發(fā)揮效能,但對上游及下游基因靶點作用仍缺乏大量的相關(guān)研究。Keap1/Nrf2信號通路是否與其他信號靶點串擾協(xié)同發(fā)揮抗纖維化作用未來也需進一步挖掘探究。未來對Keap1-Nrf2信號通路不斷深入探索,將會全方位、多角度認識Keap1 /Nrf2信號通路調(diào)控氧化應激及炎癥反應發(fā)揮抗腎纖維化作用,為開發(fā)新的藥物防治腎纖維化提供新的策略,以期為更好地防治腎纖維化提供參考依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。