基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討土茯苓治療痛風(fēng)的機(jī)制研究

胡文仲,樊一樺,許 云,梅 曼,呂 柳

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū),北京 102600;2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都 610072;3. 北京市大興區(qū)人民醫(yī)院,北京 102600;4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700)

痛風(fēng)是一種嘌呤代謝紊亂引起尿酸生成增多和/或尿酸排泄減少導(dǎo)致的代謝性疾病,已成為慢性腎病、冠心病、糖尿病、腦卒中等疾病的獨(dú)立危險因素[1]。西醫(yī)促進(jìn)尿酸排泄、抑制尿酸生成等治療雖有靶點(diǎn)精準(zhǔn)、起效快速的優(yōu)勢,但對不同階段病理改變的治療針對性不強(qiáng),且長期服用易發(fā)生嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)、胃腸道損害、肝腎功能損害和心血管疾病風(fēng)險,增加了臨床用藥的風(fēng)險[2-4]。土茯苓(百合科植物)是一種傳統(tǒng)中藥,《本草綱目》記載其具有“除濕、解毒、通腑”的功效,土茯苓主要含有黃酮類成分,具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抑制腎間質(zhì)纖維化的作用[5-6]。與非甾體抗炎藥相比,黃酮類藥物毒性較小或無毒,有證據(jù)支持黃酮類藥物的安全性[7-8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是結(jié)合醫(yī)學(xué)和計算機(jī)網(wǎng)絡(luò),基于網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)對復(fù)雜的生物系統(tǒng)進(jìn)行檢測和分析,篩選出潛在的活性成分,并預(yù)測相關(guān)疾病的作用靶點(diǎn)[9],通過構(gòu)建中醫(yī)藥“化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)-PPI網(wǎng)絡(luò)”多維網(wǎng)絡(luò),從分子水平解釋中醫(yī)藥的作用原理,為中醫(yī)藥治療各種疾病的生物學(xué)靶點(diǎn)和潛在作用機(jī)制提供了有力的證據(jù)[10-11],分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進(jìn)行藥物設(shè)計的方法,主要研究分子間的相互作用,預(yù)測分子間的結(jié)合方式和親和力[12]。本研究試圖利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接來闡明土茯苓在痛風(fēng)治療中的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

1 方 法

1.1活性成分的篩選 從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP)中檢索到土茯苓的主要化學(xué)成分(https://tcmspw.com/index.php)。TCMSP數(shù)據(jù)庫是一個獨(dú)特的平臺,用于分析中草藥的活性成分及其在特定疾病中的相互作用[13],并提供每種成分的藥代動力學(xué)信息,如藥物相似性(DL)和口服生物利用度(OB)。OB是口服藥物進(jìn)入血液循環(huán)的相對數(shù)量和速率。當(dāng)OB值低于30%時,中藥的大部分成分很難到達(dá)特定組織并發(fā)揮相應(yīng)的藥理作用[14]。DL是一個基于現(xiàn)有藥物的物理化學(xué)性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)的概念。它被用來評價一種成分是否有資格成為新藥。因此,OB和DL是鑒定和評價藥物活性成分的重要藥代動力學(xué)參數(shù)。TCMSP數(shù)據(jù)庫推薦的OB≥30%和DL≥0.18的成分被認(rèn)為是有效的。以土茯苓根狀莖為檢索詞,獲得活性成分的藥代動力學(xué)信息。

1.2篩選蛋白質(zhì)靶點(diǎn) TCMSP數(shù)據(jù)庫不僅可以讓用戶分析和鑒定草藥中的活性成分,還可以搜索活性成分的相關(guān)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。將這些蛋白質(zhì)靶點(diǎn)輸入UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org),這是一個蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,包含了豐富的信息,包括基因名稱、基因ID和基因符號。筆者將物種限制在“人類”身上,并將他們轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因簡稱,從UniProtKB中提取到相應(yīng)的基因名。

1.3痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)及土茯苓對痛風(fēng)的潛在靶點(diǎn)預(yù)測 從Genecards、OMIM、PharmGKB、Drugbank和TTD 5個數(shù)據(jù)庫中獲得痛風(fēng)的靶點(diǎn)。在5個數(shù)據(jù)庫中搜索關(guān)鍵詞“Gout”獲得疾病靶點(diǎn),將活性成分靶點(diǎn)與潛在的疾病相關(guān)靶點(diǎn)交叉,得到土茯苓的潛在抗痛風(fēng)靶點(diǎn)。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?PPI數(shù)據(jù)庫用于PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(https://string-db.org/),將UniProt轉(zhuǎn)換后的潛在靶基因名輸入,生物種屬僅限于“人”,去除離散基因后提取PPI網(wǎng)絡(luò),筆者將相關(guān)度設(shè)置為大于或等于0.400。利用Cytoscape軟件(版本3.8.0)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化,完成拓?fù)浞治?有助于識別土茯苓的關(guān)鍵靶點(diǎn),突出土茯苓抗痛風(fēng)的核心基因。

1.5GO與KEGG分析 在成功構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)后導(dǎo)入R軟件,利用生物導(dǎo)體包c(diǎn)lusterprofile進(jìn)行GO和KEGG富集分析,獲得生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)、分子功能(MF)和關(guān)鍵信號通路,設(shè)置閾值校正P<0.05。KEGG富集結(jié)果篩選出核心途徑,并對疾病途徑進(jìn)行了定位。

1.6分子對接驗(yàn)證組分-靶相互作用 分子對接技術(shù)是基于“鍵鎖原理”來反映小分子配體與蛋白質(zhì)受體之間的結(jié)合。小分子配體的結(jié)構(gòu)來源于PubChem(https://publichem.ncbi.nlm.nih.gov/)。數(shù)據(jù)庫并保存為mol2格式。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/,最后訪問日期:2021年12月28日)下載蛋白質(zhì)受體的晶體結(jié)構(gòu)。在PyMOL軟件中將受體去除水分子,制備和能量最小化有關(guān)的受體蛋白網(wǎng)格。

2 結(jié) 果

2.1活性成分 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中輸入中藥名稱,檢索土茯苓的433個成分。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的篩選標(biāo)準(zhǔn),得到槲皮素、紫杉醇、薯蕷皂苷、落新婦苷、β-谷甾醇、槲皮素等15種有效成分。見表1。

表1 土茯苓活性成分基本情況

2.2土茯苓作用靶點(diǎn) 本研究共發(fā)現(xiàn)904個土茯苓預(yù)測靶點(diǎn),刪除重復(fù)后最終獲得203個土茯苓作用靶點(diǎn)。

2.3痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)及土茯苓對痛風(fēng)的潛在靶點(diǎn)從GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank和TTD數(shù)據(jù)庫中檢索到891個痛風(fēng)相關(guān)基因靶點(diǎn)。此外,將土茯苓的預(yù)測靶點(diǎn)與痛風(fēng)基因靶點(diǎn)結(jié)合,獲得57個預(yù)測靶點(diǎn)(見圖1)。例如,IL1B、CXCL8、PPARG和CCL2是土茯苓和痛風(fēng)之間密切相關(guān)的靶點(diǎn)(見表2)。

圖1 痛風(fēng)基因靶點(diǎn)和土茯苓預(yù)測靶點(diǎn)的交集圖

表2 土茯苓抗痛風(fēng)的潛在目標(biāo)

2.4網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

2.4.1中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含13個組分,調(diào)控57個靶點(diǎn)(70個節(jié)點(diǎn),107個邊緣)。在組分靶網(wǎng)絡(luò)中可以看到一些組分可以作用于多個假定的靶點(diǎn)(如槲皮素作用于48個潛在靶點(diǎn),柚皮素作用于14個潛在靶點(diǎn),β-谷甾醇作用于9個靶點(diǎn)等)。有些成分只作用于少數(shù)靶點(diǎn),如neostilbin 和TOP2B,也可以從網(wǎng)絡(luò)中看出,有些靶點(diǎn)可以被多種成分調(diào)控,可能在疾病的治療中發(fā)揮重要作用。例如:前列腺素內(nèi)過氧化物酶(PTGS)又稱環(huán)氧合酶,是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶,發(fā)現(xiàn)PTGS1和PTGS2分別受84.6%和69.2%的土茯苓成分調(diào)控。有些靶點(diǎn)只受一種成分的調(diào)控,如ABCC1、CCL2、XDH等。見圖2。

圖2 土茯苓復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)與潛在靶點(diǎn)

2.4.2PPI網(wǎng)絡(luò)建設(shè) 將57個核心基因靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),最終得到包含57個節(jié)點(diǎn)和530條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)?；赟TRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件,獲得了一個包含17個核心基因靶點(diǎn)的核心網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。本研究中獲得的核心基因靶點(diǎn)包括VEGFA,ICAM1,BCL2L1,MAPK3,CRP,STAT1,IL10,CCL2,IL6,FOS,EGF,IL1B,RELA,JUN,PPARG,PTGS2和CXCL8。

2.5富集分析 采用GO和KEGG富集分析(P<0.05),GO分析結(jié)果顯示前10個相關(guān)信息(見圖4)。KEGG富集分析顯示,抗痛風(fēng)的土茯苓可能參與糖尿病并發(fā)癥中的年齡信號通路(BCL2/JUN/PRKCA/TGFB1/RELA/MAPK3/ICAM1/VEGFA/IL-6/STAT1/IL1B/CCL2/VCAM1/CXCL8/THBD/IL1A,計數(shù)16),類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(JUN/TGFB1/IFNG/ICAM1/VEGFA/MMP3/FOS/IL6/MMP1/IL1B/CCL-2/CXCL8/IL1A/CXCL2,計數(shù)14),IL-17信號通路(PTGS2/JUN/RELA/MAPK3/IFNG/MMP3/FOS/M-MP9/IL6/MMP1/IL1B/CCL2/CXCL8/CXCL2,計數(shù)14),TNF信號通路(PTGS2/JUN/RELA/MAPK3/ICAM1/MMP3/FOS/MMP9/IL6/IL1B/CCL2/VCAM1/CXCL2,計數(shù)13)和流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(BCL2/JUN/RELA/IFNG/ICAM1/VEGFA/FOS/MMP9/IL1B/CCL2/VCAM1/THBD/IL1A,計數(shù)13)等(見圖5)。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG富集分析

2.6目標(biāo)和成分之間的分子對接 槲皮素活性最好,與痛風(fēng)的7個核心靶點(diǎn)對接良好。親和力越低,結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。其親和力為:槲皮素和IL1B(-6.8 kcal/mol)、槲皮素和CXCL8(-6.8 kcal/mol)、槲皮素和PPARG(-8.6 kcal/mol)、槲皮素和CCL2(-6.4 kcal/mol),槲皮素與PTGS2(-9.2 kcal/mol)、槲皮素與IL6(-7.8 kcal/mol)、槲皮素與STAT1(-7.3 kcal/mol),筆者將上述7對基因組分放入PyMOL(版本3.8.0)進(jìn)行可視化(見圖6)。

(a) 槲皮素和IL1B;(b)槲皮素和CXCL8;(c)槲皮素和PPARG;(d)槲皮素和CCL2;(e)槲皮素和PTGS2;(f)槲皮素和IL6;(g)槲皮素和STAT1圖6 目標(biāo)和成分之間的分子對接

3 討 論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是分析中醫(yī)藥治療和預(yù)防各種疾病的潛在生物學(xué)機(jī)制的合理方法[15]。已有研究證實(shí)土茯苓在痛風(fēng)的治療中起重要作用[16],但其作用機(jī)制尚不完全清楚。因此,筆者首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合分子對接技術(shù)系統(tǒng)地揭示了土茯苓抗痛風(fēng)的作用機(jī)制。

槲皮素、柚皮素和β-谷甾醇是土茯苓治療痛風(fēng)的重要活性成分。槲皮素是一種生物類黃酮,能有效抑制單鈉尿酸鹽(MSU)誘導(dǎo)的痛風(fēng)模型小鼠滑膜炎,減輕關(guān)節(jié)水腫[17],研究人員證實(shí)槲皮素通過阻止MSU晶體激活NLRP3炎性體,降低IL-1β水平,從而減少炎性細(xì)胞浸潤[18],此外,槲皮素還可以直接抑制炎癥細(xì)胞浸潤,抑制環(huán)氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)的產(chǎn)生以達(dá)到抗炎作用[19-20],可以降低正常和高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平,并且降低能力與血尿酸水平成正比[21]。

柚皮素具有破壞MSU誘導(dǎo)的促炎癥/毒性細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力,能抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10的產(chǎn)生和NF-κB的活化,對痛風(fēng)具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化作用,不會引起肝腎損害[22]。Domiciano等[23]認(rèn)為柚皮素是MSU相關(guān)吞噬誘導(dǎo)的NLRP3炎癥體激活/IL-1β釋放的選擇性抑制劑,中性粒細(xì)胞募集在炎癥關(guān)節(jié)產(chǎn)生大量的氧和氮活性物質(zhì),攻擊和損傷關(guān)節(jié)[24-25],柚皮素能誘導(dǎo)結(jié)締組織結(jié)構(gòu)的降解,促進(jìn)關(guān)節(jié)退行性變[26],一方面能減少超氧陰離子和亞硝酸鹽的產(chǎn)生,另一方面也能促進(jìn)關(guān)節(jié)退行性變,它可以通過增加內(nèi)源性抗氧化劑GSH的抗氧化活性來抑制MSU誘導(dǎo)的組織氧化[27]。

β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一,前期的研究表明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、防治前列腺肥大、抗氧化、抗高血脂、促進(jìn)傷口愈合等廣泛的藥理活性[28-29]。在這里要特別提到β-谷甾醇的另一個重要特性--抗?jié)?、保護(hù)胃黏膜,有研究證明β-谷甾醇抗胃潰瘍的特性不依賴于前列腺素,可能是通過降低 TNF-α水平(巨噬細(xì)胞一旦激活,組織中就分泌大量的TNF-α),即降低了胃黏膜組織中炎性因子的釋放與聚集,減緩了受損胃黏膜組織的進(jìn)一步惡化,提高受損胃黏膜的修復(fù)能力。同時提高了大鼠體內(nèi)氧自由基(OFR)的清除能力,從而降低了OFR對胃黏膜的損傷作用。這一特點(diǎn)無疑是痛風(fēng)患者的福音,這似乎可以解釋為什么土茯苓可以更加安全地用于痛風(fēng)患者。

CXCL8是CXC亞族的典型趨化因子[30-32]。研究已發(fā)現(xiàn)在痛風(fēng)急性和亞急性階段CXCL8的水平增加,但并不是通過激活I(lǐng)L-1β途徑,這可能與巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞激活產(chǎn)生CXCL8直接相關(guān)[33-34]。越來越多的證據(jù)表明CXCL8是心腦血管、糖尿病、腎臟等疾病的獨(dú)立預(yù)測因子[35-36],因此CXCL8已逐漸被認(rèn)為是肥胖和代謝并發(fā)癥的標(biāo)志物。近年來,越來越多的研究表明CXCL8的參與對于土茯苓改善痛風(fēng)患者病情,降低尿酸水平、關(guān)節(jié)炎癥、改善內(nèi)環(huán)境、降低心腦血管風(fēng)險等方面具有重要的作用[33,37-38]。

KEGG富集分析表明,土茯苓可能參與IL-17信號通路、TNF信號通路、體液剪切應(yīng)力和痛風(fēng)的AGE-RAGE信號通路。痛風(fēng)急性發(fā)作依賴于單鈉誘導(dǎo)的多種炎癥途徑的激活尿酸鹽晶體(MSU)和巨噬細(xì)胞參與的NF-κB等炎癥小體相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[39-40]。最后,激活的IL-1β被釋放,以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集和釋放更多的炎癥介質(zhì),導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)[41-42]。從這個意義上說,靶向與NF-κB炎癥體相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號通路可能是控制痛風(fēng)的一種潛在形式。通過KEGG富集分析,筆者選擇IL-17信號通路來定位疾病通路(見圖7),其中紅色標(biāo)記的基因或蛋白與土茯苓有效成分的抗痛風(fēng)核心靶點(diǎn)相關(guān),涉及靶點(diǎn)包括NF-κB、CXCL8、COX2(PTGS2)、IL1B等。圖6提出了槲皮素作為最具活性的組分,并將其與潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了分子對接。良好的對接靶點(diǎn)是IL1B、CXCL8、PPARG、CCL2、PTGS2、IL6、STAT1。細(xì)胞因子,特別是IL-1B、IL-6和PTGS2的表達(dá)已被廣泛認(rèn)為是痛風(fēng)的主要致病因素。通過分子對接,筆者發(fā)現(xiàn)土茯苓能與這3個基因靶點(diǎn)有效對接,形成不同數(shù)量的H-鍵復(fù)合物,從而在抗炎和疾病進(jìn)展中發(fā)揮穩(wěn)定的作用。與槲皮素對接的另一個好靶點(diǎn)是C-C基序趨化因子配體2(CCL2),CCL2由滑膜細(xì)胞產(chǎn)生,它是單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞募集的關(guān)鍵局部趨化劑,與尿酸水平成正比[43-46]。一項(xiàng)涉及中國沿海地區(qū)二千多名男性的研究發(fā)現(xiàn),CCL2-2518 A/g基因型分布與痛風(fēng)相關(guān),A/g等位基因具有更高的痛風(fēng)風(fēng)險[47]。因此,有理由推測土茯苓的抗痛風(fēng)機(jī)制是通過槲皮素、柚皮素和β-谷甾醇等主要成分,作用于IL1B、CXCL8、PPARG、CCL2、PTGS2、IL6、STAT1靶點(diǎn)和多種途徑(糖尿病并發(fā)癥中的年齡-年齡信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化)。

中醫(yī)藥對痛風(fēng)的認(rèn)識已有數(shù)千年的歷史,土茯苓是百合科植物光葉土茯苓的干燥根莖,是一種具有代表性的多途徑抗痛風(fēng)的藥物,臨床應(yīng)用十分廣泛。本研究首次運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)構(gòu)建了一個綜合分析平臺,包括靶點(diǎn)預(yù)測、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)、拓?fù)浞治?、基因富集分析和分子對接。利用這個平臺,本研究揭示了土茯苓抗痛風(fēng)的潛在機(jī)制,并探討了槲皮素在痛風(fēng)防治中的應(yīng)用可能。此外,通過分子對接對結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證和評價。本研究證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接技術(shù)對理解中醫(yī)藥的整體觀念、中藥藥理學(xué)以及探索中醫(yī)藥的多適應(yīng)證特性有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。