夾脊穴埋線對(duì)大鼠脊髓損傷后自噬及BDNF/TrkB通路的調(diào)控作用

王 鐫,李 玥,蔣 偉

(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000)

脊髓損傷是一種由外傷、高處墜落等原因?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重創(chuàng)傷,致殘率極高,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。脊髓損傷原發(fā)創(chuàng)傷常導(dǎo)致被膜破壞,神經(jīng)纖維斷裂,組織挫裂或出血性壞死,造成缺血、缺氧和炎癥環(huán)境,繼而持續(xù)損傷局部殘存神經(jīng)元,引起運(yùn)動(dòng)與感覺功能喪失[1]。脊髓神經(jīng)元再生困難,損傷后難以恢復(fù),因此促進(jìn)殘余神經(jīng)元生長存活,防止其繼發(fā)性死亡為脊髓損傷后神經(jīng)功能修復(fù)的關(guān)鍵[2]。以甲基潑尼松龍為主的糖皮質(zhì)激素為目前臨床治療繼發(fā)性脊髓損傷的一線藥物,但存在不良反應(yīng)明顯、并發(fā)癥較多等問題,可能增加脊髓損傷后感染、糖尿病、肺栓塞等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),在近年引起了許多質(zhì)疑[3]。穴位埋線作為一種不良反應(yīng)較小的傳統(tǒng)外治法,通過將羊腸線埋入腧穴發(fā)揮長效刺激作用,在脊髓損傷的恢復(fù)治療中受到廣泛關(guān)注[4]。夾脊穴位于督脈與足太陽經(jīng)之間,可通過督脈之別絡(luò)調(diào)理二經(jīng)經(jīng)氣,針刺該穴可改善脊髓損傷后神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能[5]。有研究表明,脊髓神經(jīng)元自噬水平與脊髓損傷后繼發(fā)性損傷程度關(guān)系密切,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)/原肌球蛋白受體激酶B(TrkB)信號(hào)通路的激活在其中發(fā)揮重要調(diào)控作用[6]。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制脊髓損傷大鼠模型,探討了夾脊穴埋線是否可通過BDNF/TrkB信號(hào)通路調(diào)節(jié)脊髓損傷自噬對(duì)神經(jīng)損傷發(fā)揮修復(fù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只,體重180～220 g,由新疆醫(yī)科大學(xué)提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(新)2023-0002。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,保持室溫20～22 ℃,濕度50%～60%,自由進(jìn)食飲水,于12 h光照與黑暗循環(huán)的SPF級(jí)動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 醫(yī)用羊腸線,上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司;無菌埋線針,鎮(zhèn)江高冠醫(yī)療器械有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)大鼠ELISA試劑盒,深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;BDNF抗體試劑盒、DAB顯色劑,武漢博士德公司;RIPA裂解液,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,Sigama公司;Beclin-1、LC3-B、BDNF、TrkB、p-TrkB鼠單克隆抗體及兔GAPDH多克隆抗體,CST公司;RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒,TaKaRa公司;RT-PCR引物,上海生工生物工程股份有限公司提供。RM 2235切片機(jī)、DFC365FX相機(jī),德國Leica公司;Mirofuge 20 R低溫高速離心機(jī),美國Thermo Fisher公司;Tekx 808多功能酶標(biāo)儀、Mini-protean電泳儀,美國Bio-Rad公司;9700 PCR擴(kuò)增儀,美國ABI公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和穴位埋線組,每組10只。模型組和穴位埋線組大鼠采用改良式Allen’s重物墜落法[7]建立脊髓損傷模型:腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠后,將其俯臥固定于手術(shù)臺(tái)中心,以T8椎板和棘突為中心做背側(cè)切口,鈍性分離背部筋膜組織,常規(guī)消毒后顯露T7～T9椎板棘突,咬除T8段棘突椎板,顯露相應(yīng)硬脊膜為損傷區(qū),于損傷區(qū)上方放置Allen’s WD裝置,將5 g沖擊棒由10 cm高度自由落下,定量打擊脊髓致脊髓損傷,打擊后硬脊膜見充血水腫,大鼠雙下肢回縮、尾部痙攣性擺動(dòng),Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分1～3分提示脊髓損傷模型成功;假手術(shù)組僅切除T8段椎板,不損傷脊髓硬膜。各組大鼠手術(shù)完成后消毒傷口,逐層縫合,無法自主排尿的大鼠給予膀胱按壓(2次/d)以恢復(fù)排尿,造模不成功者隨機(jī)補(bǔ)充大鼠,并重新造模。造模完成后,穴位埋線組給予夾脊穴簡(jiǎn)易埋線:大鼠俯臥位固定,參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]定位損傷區(qū)上下兩端的2段椎體旁夾脊穴,將0.5 cm長的羊腸線預(yù)先置入7號(hào)無菌埋線針頭,推注入上述雙側(cè)夾脊穴,將羊腸線完全埋入腧穴內(nèi)后退出針管,無菌藥棉按壓1 min,每7 d埋線1次;假手術(shù)組、模型組大鼠正常飼養(yǎng),不予處理。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1下肢運(yùn)動(dòng)功能 在實(shí)驗(yàn)第7天、第28天,采用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠綜合運(yùn)動(dòng)功能:將大鼠分別放置于觀察盤中,觀察大鼠下肢關(guān)節(jié)協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)情況,分值范圍為0～21分,運(yùn)動(dòng)功能正常為21分,下肢全癱為0分,由2名觀察員評(píng)分以減少主觀影響。

1.4.2平衡能力 在實(shí)驗(yàn)第7天、第28天,采用斜坡實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠身體平衡功能:將大鼠置于40°光滑斜面,適應(yīng)1 min后逐漸升高斜面角度,記錄大鼠保持其自身平衡5 s以上時(shí)的最大角度,即為斜坡實(shí)驗(yàn)角度。

1.4.3血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 分別于實(shí)驗(yàn)第7天、第28天經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈采血,離心取上清,按ELISA操作步驟檢測(cè):稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣品,加入40 μL標(biāo)準(zhǔn)品、100 μL HRP標(biāo)記的二抗和10 μL待測(cè)樣品,于37 ℃溫育60 min,洗滌劑洗滌后拍干孔板,每孔加顯色劑A、B各50 μL,37 ℃避光顯色10 min,于終止液終止反應(yīng)10 min內(nèi)檢測(cè)450 nm波長下吸光度值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.4.4脊髓組織BDNF陽性表達(dá)情況 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè):取部分損傷區(qū)組織(假手術(shù)組取相同部位脊髓組織)放入4%多聚甲醛中固定24 h,放入包埋盒中依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟包埋和切片,組織切片室溫脫蠟、水化,加入0.3%的H2O2滅活內(nèi)源酶活性,蒸餾水水洗后進(jìn)行熱抗原修復(fù),加入5%BSA封閉液20 min,滴加預(yù)先稀釋的一抗蓋住組織,4 ℃孵育過夜,滴加二抗和SABC分別37 ℃溫育20 min,滴加100 μL DAB溶液,顯微鏡下顯色3～10 min后終止,再經(jīng)蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化、脫水、透明后中性樹膠封片,于光學(xué)正置顯微鏡下觀察,隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野計(jì)數(shù)BDNF陽性染色細(xì)胞數(shù)。

1.4.5脊髓組織自噬蛋白及BDNF/TrkB通路蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取部分損傷區(qū)組織(假手術(shù)組取相同部位脊髓組織),充分勻漿后加入RIPA裂解液提取組織蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度,100 ℃加熱5 min使蛋白變性,根據(jù)分子量大小制備凝膠,取30 μg蛋白樣品上樣,采用SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,滴加一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,滴加二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液,反應(yīng)1 min后曝光成像,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,分別計(jì)算Beclin-1、LC3-B、BDNF與GAPDH的比值及p-TrkB與TrkB的比值。

1.4.6脊髓組織BDNF/TrkB通路因子mRNA表達(dá)情況 采用RT-PCR法檢測(cè):取部分損傷區(qū)組織(假手術(shù)組取相同部位脊髓組織),充分研磨后,采用Trizol一步法提取總RNA,紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度,取2 μg組織反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA,按PCR試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,BDNF上游引物:5’-GGGGTTAGGAGAAGTCAAGC-3’,下游引物:5’-GGACAGCCACTTTGTTTCA-3’;p-TrkB上游引物:5’-GGTTGAGTGACCTTGGTGA-3’,下游引物:5’-AAGTGGACCTATGACCCCTCTA-3’。反應(yīng)程序:95 ℃ 10 min預(yù)變性,變性、退火、延伸各為95 ℃ 1 min,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán),2-△△CT法分析BDNF、p-TrkB的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組BBB評(píng)分、斜坡實(shí)驗(yàn)角度比較 實(shí)驗(yàn)第7天、第28天,模型組大鼠BBB評(píng)分及斜坡實(shí)驗(yàn)角度均明顯低于同期假手術(shù)組(P均<0.05),穴位埋線組大鼠BBB評(píng)分及斜坡實(shí)驗(yàn)角度均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 假手術(shù)組和脊髓損傷各組大鼠BBB評(píng)分、斜坡實(shí)驗(yàn)角度比較

2.2各組血清炎癥細(xì)胞因子水平比較 實(shí)驗(yàn)第7天、第28天,模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯高于同期假手術(shù)組(P均<0.05),穴位埋線組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯低于同期模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和脊髓損傷各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

2.3各組脊髓組織中BDNF陽性表達(dá)情況比較BDNF陽性表達(dá)分布于細(xì)胞質(zhì),呈棕黃或棕褐色。假手術(shù)組脊髓組織見少量BDNF陽性染色;模型組見較多BDNF陽性染色,陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于假手術(shù)組(P<0.05);穴位埋線組BDNF陽性細(xì)胞數(shù)較模型組進(jìn)一步增多(P<0.05)。見圖1及圖2。

圖1 假手術(shù)組和脊髓損傷各組大鼠脊髓組織中BDNF陽性表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色,×400)

圖2 假手術(shù)組和脊髓損傷各組大鼠脊髓組織中BDNF陽性細(xì)胞數(shù)

2.4各組脊髓組織中Beclin-1、LC3-B、BDNF、p-TrkB蛋白表達(dá)情況比較 實(shí)驗(yàn)第7天、第28天,模型組大鼠脊髓組織中Beclin-1、LC3-B、BDNF、p-TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于同期假手術(shù)組(P均<0.05),且穴位埋線組大鼠脊髓組織中Beclin-1、LC3-B、BDNF、p-TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見圖3及圖4。

圖3 假手術(shù)組和脊髓損傷各組大鼠脊髓組織中Beclin-1、LC3-B蛋白表達(dá)情況

圖4 假手術(shù)組和脊髓損傷各組大鼠脊髓組織中BDNF、p-TrkB蛋白表達(dá)情況

2.5各組脊髓組織中BDNF、TrkB mRNA表達(dá)情況比較 實(shí)驗(yàn)第7天、第28天,模型組大鼠脊髓組織中BDNF、p-TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于同期假手術(shù)組(P均<0.05),且穴位埋線組大鼠脊髓組織中BDNF、p-TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 假手術(shù)組和脊髓損傷各組大鼠脊髓組織中BDNF、p-TrkB mRNA表達(dá)情況

3 討 論

穴位埋線以羊腸線機(jī)械性刺激體表穴位,可通過對(duì)腧穴的持續(xù)刺激和異物蛋白的液化、吸收過程激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣,調(diào)節(jié)臟腑生理功能,調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)在的應(yīng)激和抗病免疫功能,同時(shí)發(fā)揮抗炎、促進(jìn)微循環(huán)等一系列功效,對(duì)于繼發(fā)性脊髓損傷的防治具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[9-10]。中醫(yī)學(xué)將脊髓損傷歸屬于“截癱”“痿病”范疇,認(rèn)為本病病因?yàn)槎矫}受損,瘀血留滯太陽,致三陽經(jīng)經(jīng)氣不通,氣血阻滯,肢體筋脈失于濡養(yǎng),而見麻木、懈惰不用等征象,治療多以疏通督脈和足太陽經(jīng)氣血為主[11]。督脈解剖位置與脊髓重疊,其別絡(luò)“別走太陽”,使兩經(jīng)脈氣相通,華佗夾脊穴挾脊行于此兩經(jīng)之間,可通過督脈之別絡(luò)調(diào)理二經(jīng)經(jīng)氣,振奮一身陽氣。從現(xiàn)代解剖學(xué)分析,夾脊穴附近有脊神經(jīng)后支通行,交感神經(jīng)纖維通過交通支與脊神經(jīng)聯(lián)系,針灸夾脊可促進(jìn)脊神經(jīng)功能恢復(fù),調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性,維持脊柱內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[12]。

本實(shí)驗(yàn)采用Allen’s 改良式重物墜落法建立脊髓損傷模型,結(jié)果顯示大鼠造模后均出現(xiàn)后肢癱瘓表現(xiàn),穴位埋線組大鼠埋線第7天、第28天的BBB評(píng)分及斜坡實(shí)驗(yàn)角度均明顯升高,大鼠后肢逐漸有力,提示夾脊穴埋線可促進(jìn)脊髓損傷后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)。

脊髓損傷后損傷區(qū)微環(huán)境的改變可引起免疫炎癥反應(yīng),通過釋放過量炎癥細(xì)胞因子進(jìn)一步加重組織損傷[13]。研究發(fā)現(xiàn),脊髓損傷早期即可見TNF-α、IL-6水平明顯升高,TNF-α可促進(jìn)IL-6及IL-1β自身的分泌,放大炎癥反應(yīng),損傷脊髓神經(jīng)元[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中,大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平在脊髓損傷后急劇升高,給予夾脊穴埋線后,隨著干預(yù)時(shí)間的推移,上述炎性細(xì)胞因子水平均明顯降低,表明夾脊穴埋線具有明顯的抑炎效果。

自噬為細(xì)胞在應(yīng)激條件下為實(shí)現(xiàn)自身的代謝與更新需要,通過自我吞噬的方式降解過多蛋白,清除受損細(xì)胞器的過程[16]。在脊髓損傷病理進(jìn)程中,缺血、缺氧環(huán)境可激活神經(jīng)細(xì)胞自噬,對(duì)損傷局部起到保護(hù)作用[17]。BDNF是在脊髓生理、病理狀態(tài)下發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的重要信號(hào)分子,脊髓損傷后脊髓前角細(xì)胞中BDNF的表達(dá)短暫減少,隨后逐漸增多,促使其受體TrkB磷酸化,觸發(fā)下游自噬相關(guān)通路以促進(jìn)神經(jīng)元自噬和存活[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中,模型組脊髓組織中BDNF陽性細(xì)胞數(shù)和Beclin-1、LC3-B 、BDNF、p-TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及BDNF、p-TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯增加,提示脊髓損傷早期細(xì)胞自噬應(yīng)激性激活,為損傷區(qū)的修復(fù)建立了良好微環(huán)境;經(jīng)夾脊穴埋線干預(yù)后,脊髓組織中BDNF陽性細(xì)胞數(shù)和Beclin-1、LC3-B 、BDNF、p-TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量及BDNF、p-TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步增加,表明夾脊穴埋線可通過激發(fā)神經(jīng)元自噬活動(dòng)促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)。此外,自噬與炎癥關(guān)系十分密切,通過誘導(dǎo)自噬體形成,促進(jìn)細(xì)胞自噬可下調(diào)促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá),調(diào)節(jié)脊髓損傷炎癥過程[20-21]。本實(shí)驗(yàn)表明夾脊穴埋線能增強(qiáng)脊髓損傷區(qū)自噬并抑制機(jī)體炎癥反應(yīng),而其是否通過促進(jìn)自噬來發(fā)揮抑炎作用尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述,夾脊穴埋線可作為外源性刺激上調(diào)脊髓損傷區(qū)BDNF活性和TrkB磷酸化水平,可促進(jìn)細(xì)胞自噬活動(dòng)、減輕炎癥反應(yīng)以修復(fù)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能損傷。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。