蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼通過RhoA/ROCK/HIF1α通路抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的機制

王一同,尹 玲,勾春燕,張麗麗,汪曉軍

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京 100069;2. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053)

原發(fā)性肝癌起病隱匿,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率和病死率高。2020年GLOBOCAN數(shù)據(jù)顯示,原發(fā)性肝癌發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第6位,是第3大癌癥死亡原因[1]。索拉非尼為一種小分子多激酶抑制劑,是第一個批準(zhǔn)用于治療晚期肝細(xì)胞癌的靶向藥物,其作用靶點為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體、血小板衍生生長因子受體等,通過直接抑制腫瘤生長和腫瘤血管新生達(dá)到抗腫瘤的作用。盡管索拉非尼可使晚期肝癌患者生存獲益,但在臨床實踐中,耐藥及病情進(jìn)展仍不可避免[2]。因此,尋求靶向藥物的聯(lián)合治療方案,延緩病情進(jìn)展是臨床工作的重中之重。蟾毒靈是中藥蟾酥的提取物,具有清熱解毒、化瘀潰堅、利水消腫等作用,對肝癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤具有顯著抗癌作用[3]。目前研究發(fā)現(xiàn), Ras同源基因蛋白A(RhoA)/含Rho關(guān)聯(lián)卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)/缺氧誘導(dǎo)因子1α (HIF1α)信號通路是腫瘤缺氧微環(huán)境激活的關(guān)鍵通路,該通路的激活可促進(jìn)肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移[4-7]。而華蟾素注射液可通過抑制 HIF1α 的表達(dá)逆轉(zhuǎn)腫瘤缺氧微環(huán)境[8],蟾毒靈作為華蟾素注射液中的主要抗腫瘤活性成分,結(jié)構(gòu)明確,更利于研究開發(fā)。故本研究基于Rho/ROCK/HIF1α信號通路探討了蟾毒靈與索拉非尼對肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的協(xié)同抑制作用及機制,以期優(yōu)化中晚期肝癌聯(lián)合治療方案,提高臨床療效。

1 實驗材料與方法

1.1細(xì)胞株 人肝癌HepG2細(xì)胞株,購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源庫。

1.2藥品與主要試劑 蟾毒靈,AbMole公司,貨號:M11138;索拉非尼,AbMole公司,貨號:BAY 43-9006。H-DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗,美國Hyclone公司;胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶消化液(0.25%),美國Gibco公司;CCK-8試劑盒,日本同仁化工有限公司;RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL超敏發(fā)光試劑盒,北京普利萊基因技術(shù)有限公司;兔抗一抗RhoA、ROCK1、ROCK2、HIF1α,Proteintech公司。

1.3常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法 肝癌HepG2細(xì)胞接種于H-DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素),37 ℃、5% CO2體積分?jǐn)?shù)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長,每2d傳代1次。

1.4CCK-8細(xì)胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,消化、重懸,以1×104/孔濃度將細(xì)胞接種于96孔板中;設(shè)置調(diào)零組、空白對照組、不同濃度給藥組(蟾毒靈1,2,4,8,16 μg/mL;索拉非尼1,5,10,20,40 μmol/L),板四周的孔不種細(xì)胞,加入PBS減少培養(yǎng)液揮發(fā);96孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜,待細(xì)胞貼壁,分別向各組細(xì)胞加入相應(yīng)培養(yǎng)基200 μL,培養(yǎng)24 h,棄掉各組培養(yǎng)液上清,重新加入100 μL含有10% CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2 h后,酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度(OD值),繪制增殖曲線。

1.5Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實驗

1.5.1細(xì)胞遷移實驗 將肝癌HepG2細(xì)胞分為空白對照組(不進(jìn)行任何處理)、蟾毒靈組、索拉非尼組、蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼組,按實驗分組每瓶細(xì)胞加入5 mL含蟾毒靈、索拉非尼、蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。棄去無血清培養(yǎng)基,消化、離心,重懸細(xì)胞;取上述細(xì)胞懸液200 μL(約含5×104細(xì)胞)逐滴加入小室,另取200 μL富含血清的培養(yǎng)基沿孔壁的空隙處加入到孔中,勿誤加入小室內(nèi)。將接種好的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h。將小室取出,棄去孔中培養(yǎng)基,上室中加入200 μL 4%多聚甲醛細(xì)胞固定液,將小室置于已加入500 μL 0.1%結(jié)晶紫染色液的培養(yǎng)孔中,染色20 min。將小室移入新的培養(yǎng)孔,PBS洗3次,濕棉簽擦去小室內(nèi)部未穿過上室膜的細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察穿過上室膜的細(xì)胞數(shù),光鏡下計數(shù)3個視野的細(xì)胞數(shù),取平均值。

1.5.2細(xì)胞侵襲實驗 將Matrigel基質(zhì)膠與DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1∶8比例混勻,吸取50 μL,平鋪于Transwell小室底部聚碳酸酯膜上,小室放入37 ℃培養(yǎng)箱2 h待基質(zhì)膠凝固。余步驟同細(xì)胞遷移實驗。

1.6RhoA/ROCK /HIF1α通路相關(guān)蛋白表達(dá)Western blot檢測 將肝癌HepG2細(xì)胞分為空白對照組(不進(jìn)行任何處理)、蟾毒靈組、索拉非尼組、蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼組,按實驗分組每瓶細(xì)胞加入5 mL含蟾毒靈、索拉非尼、蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,收集各組細(xì)胞,加入RIPA細(xì)胞裂解液(內(nèi)含蛋白酶抑制劑)冰上裂解;BCA蛋白濃度測定;取總蛋白量相等的樣品進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳;PVD膜電轉(zhuǎn);5%脫脂牛奶室溫封閉1 h;稀釋一抗( HIF1α 1∶81 000,RhoA 1∶81 000,ROCK1 1∶85 000,ROCK2 1∶82 000),孵育一抗4 ℃過夜;TBST緩沖液室溫清洗3次;加入二抗(稀釋比例1∶810 000)室溫孵育1 h,TBST室溫清洗3次;ECL試劑盒顯色;Image J軟件進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用Shapiro-Wilks(W)方法進(jìn)行正態(tài)分布檢驗,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩多重比較采用LSD-t方法;不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間差異采用對應(yīng)的非參數(shù)檢驗;檢驗水準(zhǔn)α=0.05(雙尾)。

2 結(jié) 果

2.1肝癌HepG2細(xì)胞增殖情況 蟾毒靈及索拉非尼單藥均可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖。蟾毒靈作用24 h的IC50為3.866 μg/mL,索拉非尼作用24 h的IC50為20.173 μmol/L。為避免藥物濃度過高對細(xì)胞活力的影響,后續(xù)實驗干預(yù)濃度蟾毒靈為4 μg/mL、索拉非尼為20 μmol/L。見圖1。

圖1 蟾毒靈及索拉非尼對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

2.2肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲情況 培養(yǎng)24 h后,蟾毒靈組、索拉非尼組及蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼組肝癌HepG2細(xì)胞的遷移與侵襲率均明顯低于空白對照組(P均<0.05),且蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼組肝癌HepG2細(xì)胞的遷移與侵襲率均明顯低于蟾毒靈組和索拉非尼組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 空白對照組和各藥物干預(yù)組肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲情況

2.3RhoA/ROCK /HIF1α通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況培養(yǎng)24 h后,索拉非尼組和蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼組肝癌HepG2細(xì)胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、HIF1α蛋白相對表達(dá)量均明顯低于空白對照組(P均<0.05),且蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼組各蛋白相對表達(dá)量均明顯低于蟾毒靈組和索拉非尼組(P均<0.05);蟾毒靈組各蛋白相對表達(dá)量與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

3 討 論

蟾毒靈是從中藥蟾酥中提取的主要活性單體之一。《本草綱目》記載:“蟾酥治發(fā)背疔瘡,一切惡腫?！薄侗静輩R言》記載:“蟾酥療疳積,消臌脹,解疔毒之藥也,能化解一切瘀郁壅滯諸疾,如積毒、積塊、積膿、內(nèi)疔癰腫之證,有攻毒拔毒之功也?！笨梢娫诠艜r人們就意識到蟾酥抗惡性瘡瘍、癌腫的作用?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),蟾毒靈可抑制雞胚尿囊膜模型的血管生成,抑制內(nèi)皮細(xì)胞參與的芽生性血管新生[9]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn),蟾毒靈能夠通過調(diào)控Akt/VEGF信號增強索拉非尼的抗內(nèi)皮細(xì)胞參與的血管生成?？梢?抗血管生成是蟾毒靈與索拉非尼發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用的重要機制。

腫瘤缺氧微環(huán)境是促進(jìn)腫瘤血管新生的重要激發(fā)因素,HIF1α在腫瘤細(xì)胞對缺氧微環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)中起到重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn),缺氧環(huán)境培養(yǎng)顯著增強了HepG2細(xì)胞的成管能力,同時增加了Notch1和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的表達(dá),還可誘導(dǎo) Bcl-2和Twist1共表達(dá),在體外和體內(nèi)均能增強肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程和促進(jìn)血管新生[11-12]。任光明[13]研究發(fā)現(xiàn),華蟾素聯(lián)合放化療治療晚期肺癌患者,可顯著降低血清HIF1α水平,抑制腫瘤血管新生。本研究發(fā)現(xiàn),蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼對HIF1α的表達(dá)亦有明顯抑制作用,逆轉(zhuǎn)腫瘤缺氧微環(huán)境可能是蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的機制之一。

ROCK1、ROCK2是RhoA的下游靶點,ROCK是腫瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成的關(guān)鍵因子[14]。楊錦秀[15]研究發(fā)現(xiàn),RhoA/ROCK信號通路能通過干預(yù)AngⅡ的表達(dá)發(fā)揮對體外血管形成的抑制作用;奚嬌嬌[16]報道,黃酮類化合物能通過抑制RhoA/ROCK信號通路改善腦缺氧缺血損傷;梅曉峰[17]研究發(fā)現(xiàn),麝香烏龍丸能通過干預(yù)RhoA/ROCK信號通路,減輕機體微血管屏障的損傷。ROCK2作為HIF1α的上游,參與HIF1α在缺氧條件下的調(diào)控,RhoA/ROCK2信號通路通過HIF1α穩(wěn)定和EMT激活p-Vimentin (Ser72和56)參與缺氧誘導(dǎo)的肝癌血管新生[4],抑制RhoA/ROCK信號通路,能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移及血管生成擬態(tài)的形成[18-19]。本實驗結(jié)果顯示,蟾毒靈單獨用藥時并未表現(xiàn)出對RhoA/ROCK/HIF1α通路相關(guān)靶點的抑制作用,聯(lián)合索拉非尼后則表現(xiàn)出顯著的抑制作用,且比索拉非尼單藥用藥抑制作用增強。提示蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的機制可能為通過下調(diào)RhoA、ROCK1、ROCK2表達(dá),抑制HIF1α的激活,從而逆轉(zhuǎn)腫瘤缺氧微環(huán)境對肝癌細(xì)胞的影響,最終抑制肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

綜上所述,蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼抗肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用與調(diào)控RhoA/ROCK/HIF1α信號通路有關(guān),為中晚期肝癌聯(lián)合診療提供了基礎(chǔ)研究依據(jù),然而尚需開展體內(nèi)實驗研究,對蟾毒靈聯(lián)合索拉非尼抑制肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機制進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。