腸道菌群代謝產(chǎn)物氧化三甲胺與急性缺血性腦卒中的臨床特征及預(yù)后相關(guān)性分析

丁勝，趙寧軍，許鐵，燕憲亮

腦卒中俗稱“中風(fēng)”,是我國成人致死、致殘的首位病因，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高和致殘率高的特點[1]。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中2 類。在所有腦卒中患者中，缺血性腦卒中的發(fā)生更為常見，約占腦卒中發(fā)生率的80%[2]。缺血性腦卒中的危險因素眾多。近年來，隨著人們對腸道菌群及其產(chǎn)物的認(rèn)識，不少新的危險因素進入大眾的視野。“微生物-腸-腦軸”、“微生物-腸-心軸”的提出更是讓我們對心腦血管疾病的認(rèn)識進入一個新的層面。鑒于腸道菌群及其產(chǎn)物對急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS）的諸多相關(guān)危險因素存在極其重要的促進作用，特別是腸道菌群代謝產(chǎn)物氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的促進作用，更多的焦點聚集在人類腸道菌群及其代謝產(chǎn)物上。本研究旨在探討TMAO與AIS的臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

AIS 組為2019 年8 月至9 月發(fā)病24 h 內(nèi)因AIS急診入住徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急救中心的患者100 例，年齡32～97 歲，平均（64.89±11.84）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2018年中國急性缺血性腦卒中診治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；②年齡≥18歲；③入院時急性腦梗死發(fā)作≤24 h；④簽署知情同意書并接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個月使用過廣譜抗生素；②合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙；③發(fā)病后7 d內(nèi)出院或因AIS 昏迷無法完成問卷調(diào)查者；④患者或其家屬拒絕參加此研究。

對照組為同期非心腦血管疾病入住徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的患者100例，年齡34～90歲，平均（66.85±11.18）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②此次為非心腦血管疾病入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3 個月使用過廣譜抗生素；②合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙；③此次因急性應(yīng)激性事件入院；④患者或其家屬拒絕參加此研究。

本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理號：XYFY2019-KL162-01。

1.2 方法

1.2.1 信息采集 采集2 組患者入院時基線資料，包括年齡、性別、體重指數(shù)（BMI）、吸煙史、飲酒史、高血壓病病史、糖尿病病史、冠心病病史、腦梗死病史、高膽固醇血癥病史、高甘油三酯血癥病史。AIS組收集的入院時及卒中后90 d電話隨訪的臨床資料還包括入院時高同型半胱氨酸（HCY）血癥、高D-二聚體（急診）、左側(cè)/右側(cè)頸動脈斑塊形成情況、房顫病及病史、溶/取栓治療、美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(national institute of health stroke scale,NIHSS)評分，卒中后90 d 生存情況、再發(fā)腦梗死、改良Rankin量表（modified Rankin scale,mRS）評分等。

1.2.2 樣本采集與測定 用EDTA 作為抗凝劑采集標(biāo)本，AIS組留取入院時空腹血樣2 mL；對照組利用其檢驗中心剩余的血樣。所有樣本均于采集后6 h內(nèi)4℃下離心20 min（2500轉(zhuǎn)/分），留取血漿適量-80℃保存。樣本收集完后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行TMAO濃度檢測。

1.2.3 AIS組亞組分組 AIS組患者根據(jù)入院時血漿TMAO濃度由低到高排序，根據(jù)四分位數(shù)等分成第一、第二、第三、第四四分位數(shù)亞組4 個亞組(n=25)。根據(jù)AIS組患者卒中后90 d神經(jīng)功能預(yù)后（mRS 評分表示），分為預(yù)后良好亞組（mRS 評分≤1分）和預(yù)后不良亞組（mRS評分≥2分）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，對計量資料進行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗，對非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)及四分位間距描述，多組比較采用H檢驗；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，若不滿足χ2檢驗條件，采用Fisher 確切概率法。采用Spearman 方法分析AIS 組入院時血漿TMAO 濃度與不服從正態(tài)分布的研究指標(biāo)之間的相關(guān)性。對AIS組患者90 d神經(jīng)功能預(yù)后的影響因素進行單因素及多因素Logistic回歸分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者基線資料比較

2組患者基線資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。AIS 組患者入院時血漿TMAO 濃度明顯高于對照組[(3.94±0.42)μmol/L，（3.38±0.56）μmol/L，P＜0.05）]。

表1 2 組患者基線資料比較

2.2 AIS組患者各亞組基線資料比較

AIS組患者各亞組基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 AIS 組患者各亞組基線資料比較

2.3 AIS組患者各亞組觀察指標(biāo)比較

第四四分位數(shù)亞組入院時NIHSS 評分高于第二四分位數(shù)亞組(P＜0.05)；4 亞組間卒中后90 d 內(nèi)再發(fā)腦梗死存在差異（P＜0.05）；第四四分位數(shù)亞組卒中后90 d 時mRS 評分高于第一、二、三四分位數(shù)亞組(均P＜0.05)；4 亞組間卒中后90 d 內(nèi)生存情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 AIS 組患者各亞組觀察指標(biāo)比較

2.4 AIS組患者入院時血漿TMAO濃度與觀察指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

AIS 組患者入院時血漿TMAO 濃度與入院時NIHSS 評分（r=0.321,P=0.001）、卒中后90 d 內(nèi)再發(fā)腦梗死(r=0.328,P=0.001)、卒中后90 d時mRS評分（r=0.475,P=0.000）呈正相關(guān)。

2.5 AIS 組患者卒中后90 d 神經(jīng)功能預(yù)后的單因素及多因素Logistic回歸分析

單因素Logistic回歸分析顯示高膽固醇血癥和入院時血漿TMAO濃度、入院時NIHSS評分是AIS患者90 d神經(jīng)功能預(yù)后的危險因素，見表4。對年齡、BMI、糖尿病、高血壓、冠心病等因素進行校正后，多因素Logistic 回歸分析提示入院時血漿TMAO 濃度和入院時NIHSS 評分是AIS 患者卒中后90 d 神經(jīng)功能預(yù)后不良的獨立危險因素，見表5。

表4 AIS 組患者卒中后90 d 神經(jīng)功能預(yù)后單因素Logistic 回歸分析

表5 AIS 組患者卒中后90 d 神經(jīng)功能預(yù)后多因素Logistic回歸分析

3 討論

AIS是由多種危險因素作用于腦血管導(dǎo)致以神經(jīng)功能缺損或神經(jīng)系統(tǒng)損傷為表現(xiàn)的腦血管疾病。在世界范圍內(nèi)，AIS 是致殘的首要原因。盡管AIS的預(yù)防、診斷和治療較前有所進展，但人口老齡化加劇、腦卒中發(fā)病年輕化，AIS所帶來的負(fù)擔(dān)仍然很大，這將是這個時代的新挑戰(zhàn)[4]。AIS的發(fā)生與動脈粥樣硬化密切相關(guān)，動脈粥樣硬化是腦血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，是AIS的重要危險因素。研究顯示動脈粥樣硬化的發(fā)生與血漿TMAO 水平呈正相關(guān)，其面積隨血漿TMAO 水平增加而增加[5]。TMAO的來源包括外源性和內(nèi)源性2 種。但在人類中，絕大多數(shù)TMAO來源于腸道菌群產(chǎn)生的TMAO[6]。研究表明TMAO促進動脈粥樣硬化的機制主要有:①通過2 種信號通路共同增強血管內(nèi)膜炎癥反應(yīng)[7]，改變細(xì)胞間粘附分子ICAM-1活性，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成[8]；②通過增加巨噬細(xì)胞表面CD36和清道夫受體A數(shù)目，引起膽固醇堆積，加速泡沫細(xì)胞形成[9]；③作用于合成膽汁酸的關(guān)鍵酶干擾膽固醇的逆轉(zhuǎn)運，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生[10]。TMAO不僅增加動脈粥樣硬化的發(fā)生，還可通過影響血小板功能，增加粥樣斑塊破裂后血栓形成的風(fēng)險[11]?？傊琓MAO可通過多種機制促進機體的慢性持續(xù)性炎性反應(yīng)，干擾膽固醇代謝通路、促進血小板聚集等，導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊、血栓的形成，進而導(dǎo)致AIS的發(fā)生。

有關(guān)TMAO與AIS的研究相對較少，有研究顯示TMAO可增加首次腦卒中事件在高血壓患者的發(fā)生率[12]，Liang等[13]實驗顯示TMAO是缺血性腦卒中的獨立預(yù)測因子。但另一項研究顯示無癥狀動脈粥樣硬化患者腸道微生物和TMAO水平無明顯變化，但腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作患者因腸道微生物失調(diào)，血TMAO水平降低[14]。這使得TMAO與AIS的相關(guān)性存在爭議。

本實驗納入的AIS患者血漿TMAO濃度存在較大懸殊，入院時血漿TMAO濃度中值是3.95（2.95～4.68）μmol/L，與美國克利夫蘭臨床中心的檢測結(jié)果3.7(2.4～6.2)μmol/L 相比較低[15]，這可能是東西方飲食習(xí)慣、生活方式的差距造成的。

研究發(fā)現(xiàn)與對照組比較，AIS 組患者入院血漿TMAO 濃度高（P＜0.05）。其原因大致有2種可能：一是長期高水平TMAO促進動脈粥樣硬化的發(fā)生而導(dǎo)致AIS，后者的出現(xiàn)又使腸道通透性增加，進一步增加血漿TMAO 濃度；二是AIS 患者血漿TMAO 水平在發(fā)病前與對照組患者無明顯差異，因AIS 事件的發(fā)生導(dǎo)致腸道通透性增加，菌群轉(zhuǎn)移、菌群失調(diào)、血漿TMAO水平升高。這與劉振東等[16]的研究結(jié)果相似，但與Yin等[14]的實驗結(jié)果不同，他們的解釋是AIS 事件或卒中后的治療藥物可能降低了血漿TMAO的水平。

AIS 組4 亞組間基線資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。相關(guān)性分析顯示AIS 組患者入院時血漿TMAO 濃度與入院時NIHSS 評分、卒中后90 d 時mRS 評分、卒中后90 d 內(nèi)再發(fā)腦梗死事件呈正相關(guān)關(guān)系。表明入院時血漿TMAO濃度越高AIS 患者病情往往越重，卒中后90 d時mRS評分高,且卒中后90 d內(nèi)再發(fā)腦梗死的風(fēng)險也較大，預(yù)后不佳。

根據(jù)AIS患者的預(yù)后（預(yù)后良好和預(yù)后不良）進行的單因素Logistic回歸分析顯示，高膽固醇血癥、入院時血漿TMAO濃度及入院時NIHSS 評分是AIS 患者卒中后90 d 神經(jīng)功能預(yù)后的危險因素。對年齡、BMI、糖尿病、高血壓、冠心病等因素進行校正后，多因素Logistic回歸分析提示入院時血漿TMAO濃度、入院時NIHSS 評分是AIS 患者卒中后90 d 神經(jīng)功能預(yù)后不良的獨立危險因素。

本實驗通過前瞻性觀察發(fā)現(xiàn)腸道菌群代謝產(chǎn)物TMAO 與AIS的病情評估及預(yù)后密切相關(guān)，特別是對AIS預(yù)后的判斷上有重要參考價值。盡管我們對AIS組患者進行嚴(yán)格篩選，對對照組患者入組進行嚴(yán)格限制，使其更具代表性，但仍避免不了存在一定的偏倚。本實驗結(jié)論仍需大樣本、多中心的實驗進行驗證。

TMAO在心血管事件上的重要意義已得到廣泛認(rèn)可，但在AIS中的意義和價值仍有所爭議。本研究通過觀察、評估、隨訪急診入院的AIS患者，獲得第一手且較為及時患者病情資料，具有很好的代表性，這對腦卒中的發(fā)病機制研究、預(yù)防及治療有一定臨床價值。