Maresin1通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)炎癥反應(yīng)

張博，李鳳君，劉學(xué)政，左中夫

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）主要由血管系統(tǒng)改變和炎癥引起[1]。炎癥的重要過程之一是細(xì)胞的快速遷移[2]。Müller 細(xì)胞是視網(wǎng)膜內(nèi)主要的膠質(zhì)細(xì)胞，其在糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）病理生理過程中能被激活[3]。Müller細(xì)胞在DR中被激活的最顯著跡象之一是膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)的增加[4]。Müller 細(xì)胞激活能促進(jìn)炎性因子分泌，引發(fā)強(qiáng)烈的內(nèi)源性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起DR的發(fā)生和發(fā)展[5]。

JAK/STAT 通路參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)效應(yīng)[6]。JAK/STAT 通路激活能促進(jìn)炎癥，誘導(dǎo)多種反應(yīng)[7]。研究表明，JAK/STAT 通路在DM 中被激活，其中JAK2/STAT3 亞型是目前研究最廣泛和深入的一種[8]。但JAK2/STAT3通路對(duì)DR的影響尚不清楚。

Maresin1（MaR1）是從omega-3脂肪酸中提取的一種生物活性分子[9]，是一種在炎癥緩解過程中活躍的脂質(zhì)介質(zhì)，在多種疾病中有抗炎效果。MaR1已被證明可通過對(duì)抗淀粉樣β蛋白介導(dǎo)的炎癥沉積，減緩慢性退行性疾病阿爾茨海默病的進(jìn)展[10]。但MaR1是否參與DR炎癥反應(yīng)有待探討。本實(shí)驗(yàn)擬探討MaR1 及JAK2/STAT3通路是否參與DR的形成發(fā)展及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(遼)2019-003]，體質(zhì)量180～200 g。將大鼠置于溫度22～24 ℃、濕度50%～60%、12 h光/12 h暗循環(huán)的環(huán)境中，自由食水。實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 主要試劑與儀器 Maresin1購(gòu)于Cayman公司；鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)于Sigma 公司；JAK2/STAT3 通路激活劑colivelin 購(gòu)于吉爾生化公司；JAK2、STAT3、p-JAK2、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1 β 抗體購(gòu)于Abcam 公司；p-STAT3、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α抗體購(gòu)于Affinity公司；HE染色試劑盒和Western blot 二抗購(gòu)于Solarbio 公司；SP、DAB 試劑盒購(gòu)于中杉金橋公司；ELISA 試劑盒購(gòu)于MLBIO公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)于Beyotime公司；倒置顯微鏡購(gòu)于Olympus公司；石蠟切片機(jī)購(gòu)于SLEE公司；水平電泳儀購(gòu)于BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 DM大鼠模型建立及分組給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)數(shù)天，禁食水12 h，采用腹腔注射STZ（50 mg/kg）制備DM 大鼠模型[11]。3 d 后血糖≥16.7 mmol/L 的大鼠為造模成功，納入后續(xù)研究。入組大鼠隨機(jī)分為4組，每組10 只：對(duì)照組（Con 組）、糖尿病組（DM 組）、Maresin1預(yù)處理組（MaR1組）和Maresin1+colivelin組（colivelin 組）。DM 成模后，給與MaR1 組大鼠MaR1（4 ng/g）腹腔注射，2 次/周；Con 組和DM 組給予等量PBS注射[12]；colivelin組大鼠在MaR1組給藥的基礎(chǔ)上，將大鼠麻醉后用微量進(jìn)樣器向玻璃體內(nèi)一次性注射colivelin 5 μL（10－4μmoL/L）[13]。12周后取材。

1.2.2 標(biāo)本收集 采用戊巴比妥鈉（10 g/L）腹腔注射麻醉大鼠。一部分大鼠用4%多聚甲醛灌流1.5～2 h，取眼球放至固定液中，置于－4 ℃冰箱48 h，將組織轉(zhuǎn)移到蔗糖溶液中脫水后，石蠟包埋，備于HE 和免疫組化染色；一部分大鼠取新鮮視網(wǎng)膜組織進(jìn)行ELISA 檢測(cè)和Western blotting檢測(cè)。

1.2.3 視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè) 采用HE 檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）數(shù)量。眼球石蠟切片脫水后蘇木素溶液染色5 min，鹽酸乙醇分化30 s，伊紅染色2 min，流水沖洗5 min，酒精和二甲苯溶液脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá) 眼球石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水合。抗原修復(fù)待恢復(fù)室溫，3%H2O2避光反應(yīng)10 min。PBS 清洗3 次。滴加山羊血清工作液30 min。用抗GFAP 抗體（1∶300）4 ℃孵育過夜（＞18 h）。次日復(fù)溫1 h，二抗孵育1 h，PBS 清洗，鏈霉素親和素孵育1 h。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。酒精和二甲苯溶液脫水透明。中性樹膠封片。

1.2.5 ELISA 法測(cè)定視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β和TNF-α含量 向新鮮視網(wǎng)膜中加入RIPA 裂解液，收集上清，于4 ℃、12000 rpm 離心20 min。按照說明書加液后37 ℃水浴60 min。棄去液體，每孔加入A 液B 液混勻后反應(yīng)15 min。加入終止液，以450 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。

1.2.6 Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α、p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 蛋白表達(dá)水平收集上清同ELISA法。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜?？笽L-6抗體（1∶1000）、抗IL-1β抗體（1∶2000）、抗TNF-α抗體（1∶1000）、抗p-JAK2抗體（1∶4000）、抗JAK2抗體（1∶5000）、抗p-STAT3 抗體（1∶4000）、抗STAT3 抗體（1∶5000）以及β-actin和GAPDH內(nèi)參（1∶4000）在4 ℃孵育過夜（＞18 h）。次日用TBST洗膜，二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，ECL顯影。用ImageJ軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，多組比較方法采用單因素方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MaR1改善了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)

HE染色顯示，Con組視網(wǎng)膜平整，RGC密集。DM組RGC 數(shù)量明顯減少。與DM 組相比，MaR1 組RGC數(shù)量增多。colivelin 組較MaR1 組RGC 數(shù)量明顯減少，見圖1。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜HE染色

2.2 MaR1抑制了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜GFAP的表達(dá)

免疫組織化學(xué)和Western blot 結(jié)果顯示，DM 組大鼠的視網(wǎng)膜中，Müller 細(xì)胞大量被激活，GFAP 表達(dá)增多（P＜0.01）；MaR1 組大鼠視網(wǎng)膜GFAP 表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；Colivelin 組較MaR1 組GFAP 表達(dá)增多（P＜0.01），見圖2、圖3。

圖2 免疫組化檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜GFAP表達(dá)

2.3 MaR1 抑制了糖尿病視大鼠網(wǎng)膜炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)

ELISA和Western blot結(jié)果顯示DM組IL-6、IL-1β、TNF-α的水平增高（P＜0.01）；MaR1 組IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）；與MaR1 組相比，colivelin組IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平上升（P＜0.01），見圖4、圖5。

圖4 ELISA檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-6、IL-1β、TNF-α因子的表達(dá)

圖5 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平

2.4 MaR1 抑制了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)水平

Western blot 結(jié)果顯示DM 組JAK2 和STAT3 磷酸化增加，p-JAK2 和p-STAT3 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。MaR1 治療12 周后，p-JAK2 和p-STAT3 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）。在MaR1 組基礎(chǔ)上給予JAK2/STAT3 通路激活劑colivelin 后，MaR1 的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)（P＜0.01）。4組的JAK2、STAT3 總表達(dá)無改變。提示DM 大鼠的JAK2/STAT3 通路被激活，磷酸化增加，而MaR1 能有效抑制JAK2和STAT3磷酸化，見圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的表達(dá)水平

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)Müller 細(xì)胞參與了DR 的發(fā)病機(jī)制，被認(rèn)為是神經(jīng)血管功能障礙的一種形式[14,15]。炎癥激活Müller 細(xì)胞并破壞組織穩(wěn)態(tài)。在DR 的持續(xù)過程中，Müller 細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和消除之間的微妙平衡被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和疾病惡化[16]。在DR中，RGC 數(shù)量減少，同時(shí)GFAP 上調(diào)，視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)性增強(qiáng)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生。MaR1 在DM 大鼠模型中抑制Müller 細(xì)胞炎癥反應(yīng)。因此，控制炎癥反應(yīng)可能對(duì)DM 患者預(yù)防或減輕視網(wǎng)膜損傷起到重要作用。

MaR1 是由巨噬細(xì)胞通過人12-脂氧合酶從二十二碳六烯酸中產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的促分解和組織穩(wěn)態(tài)作用[17]。文獻(xiàn)報(bào)道促分解介質(zhì)可以減輕DM 的疾病變化，包括炎癥[18]。研究表明，MaR1 具有強(qiáng)大的抗炎和促解毒活性，包括抑制Müller 細(xì)胞的活化[19]。視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活與缺血、神經(jīng)損傷、炎性因子等視網(wǎng)膜疾病引起的神經(jīng)元損傷有關(guān)。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)MaR1 顯著改善節(jié)細(xì)胞排列紊亂，抑制STZ 誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)，并有助于DR的治療。

炎癥是Müller細(xì)胞激活和膠質(zhì)細(xì)胞增生的首要反應(yīng)，釋放的大量因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等，引起炎癥反應(yīng)[3]。在DR 中，我們發(fā)現(xiàn)MaR1 可以降低GFAP的上調(diào)。但是MaR1 和JAK2/STAT3 通路激活劑colivelin 聯(lián)合用藥后，與MaR1 組相比，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞GFAP升高。免疫組化發(fā)現(xiàn)MaR1組較DM組的GFAP表達(dá)降低，而colivelin組較MaR1 組的GFAP 表達(dá)水平增加，所以MaR1可能是通過降低DR的Müller細(xì)胞激活減輕炎癥。Müller 細(xì)胞是IL-1β產(chǎn)生的關(guān)鍵來源。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)IL-1β極其敏感，并在這種促炎細(xì)胞因子的作用下迅速發(fā)展為細(xì)胞死亡。除了IL-1β，Müller細(xì)胞還產(chǎn)生其他促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6[20]。本研究以MaR1 處理DR 大鼠，降低了視網(wǎng)膜組織中IL-6、IL-1 β 和TNF-α 蛋白表達(dá)。然而，以MaR1 和JAK2/STAT3 通路激活劑colivelin 聯(lián)合處理DR 大鼠，可增強(qiáng)IL-6、IL-1β和TNF-α炎癥因子的釋放，表明MaR1 抑制DR 大鼠炎癥反應(yīng)，是下調(diào)JAK2/STAT3 通路的因素。

JAK2/STAT3 信號(hào)通路的激活作為炎癥中的一個(gè)重要信號(hào)，可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化，在嚙齒動(dòng)物DR模型的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。但目前MaR1通過JAK2/STAT3 信號(hào)通路對(duì)DR 保護(hù)作用的影響尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)表明，DR 中p-JAK2 和p-STAT3 表達(dá)上調(diào)。在MaR1 治療后，p-JAK2 和p-STAT3 表達(dá)下調(diào)。MaR1 和通路激活劑colivelin 聯(lián)合干預(yù)后，p-JAK2 和p-STAT3蛋白表達(dá)較MaR1組明顯下調(diào)，說明MaR1可能通過抑制JAK2 和STAT3 的磷酸化，下調(diào)JAK2/STAT3通路活性。

綜上所述，本研究證實(shí)MaR1可抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，減少GFAP和促炎因子的表達(dá)，有助于減輕DM 大鼠的視網(wǎng)膜損傷。MaR1 可能有助于減輕DM炎癥的進(jìn)展，是緩解DR的一種潛在新方法。