熱休克蛋白70結(jié)合蛋白1誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)源性突變亨廷頓蛋白積聚

彭希，覃禹森，嚴(yán)麗，靜亮

亨廷頓?。℉untington’s disease，HD）中，選擇性神經(jīng)元丟失首先發(fā)生于紋狀體的棘狀神經(jīng)元，然后隨疾病的進展波及其他腦區(qū)[1]。棘狀神經(jīng)元受皮質(zhì)神經(jīng)元的谷氨酸能軸突支配，因此易受到谷氨酸介導(dǎo)興奮性毒性影響[2]。神經(jīng)系統(tǒng)的大多數(shù)細胞是支持神經(jīng)元生存的膠質(zhì)細胞，其中星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的主要類型[3]。星形膠質(zhì)細胞能夠表達谷氨酸轉(zhuǎn)運體，主動攝取細胞外和突觸間隙的谷氨酸以防止其神經(jīng)毒性[4,5]。生理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細胞能夠從神經(jīng)內(nèi)分泌角度維持正常的神經(jīng)元功能。HD 中，突變亨廷頓蛋白（mutant Huntingtin，mHTT）過表達于神經(jīng)元并產(chǎn)生年齡依賴的神經(jīng)病理性損傷[6]。以上現(xiàn)象引出一個關(guān)鍵問題，即星形膠質(zhì)細胞內(nèi)源性表達mHTT 是否產(chǎn)生病理性損傷。

當(dāng)前HD 小鼠模型在研究星形膠質(zhì)細胞內(nèi)源性mHTT作用方面存在局限性，多為mHTT選擇性在神經(jīng)元中過表達，或在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達[7]。我們在前期研究中構(gòu)建了星形膠質(zhì)細胞中特異性表達mHTT N’端片段的轉(zhuǎn)基因小鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）-HD[8]。盡管該小鼠mHTT的表達水平較低，但依然可以表現(xiàn)出年齡依賴的HD病理特點。本研究選用該模型探討星形膠質(zhì)細胞在HD病理性進展中的作用。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白70結(jié)合蛋白1（heat shock protein 70 binding protein 1，HspBP1）通過抑制神經(jīng)元泛素化功能誘導(dǎo)mHTT 積聚。同時，HspBP1 在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中存在差異性表達[9]。該發(fā)現(xiàn)引出新的假設(shè)，即星形膠質(zhì)細胞中HspBP1的低水平表達能否解釋其較少出現(xiàn)mHTT 積聚和功能障礙。因此，我們利用腺相關(guān)病毒（Adeno associated virus，AAV）轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)在4 月齡GFAP-HD 小鼠紋狀體星形膠質(zhì)細胞中過表達HspBP1，結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細胞短期內(nèi)即出現(xiàn)mHTT 積聚以及年齡依賴的運動功能障礙。因此HspBP1誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞中mHTT增加可能是HD病理性損傷的關(guān)鍵因素。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 主要試劑 小鼠抗亨廷頓蛋白抗體（mEM48）由本實驗室制備并保存。兔抗NeuN（ABN78）、兔抗GFAP（AB5804）購于Millipore 公司，兔抗HspBP1（HPA071444）、小鼠抗 Vinculin（V9131）購于Sigma-Aldrich公司；HRP和AlexaFluor 488/594標(biāo)記的抗鼠、抗兔IgG 購于Jackson 實驗室；DAPI、DAB 試劑盒（D4418）購于Sigma-Aldrich公司；

1.1.2 質(zhì)粒、病毒 我們在pAAV-GFAP104-mCherry載體（Addgene）的EcoRI 和XbaI 克隆位點中插入HspBP1 cDNA 以獲得pAAV-GFAP-HspBP1 質(zhì)粒。同時利用相同的方法插入GFP cDNA 以獲得對照組pAAV-GFAP-GFP 質(zhì)粒。以上2 種AAV 克隆均通過AAV9 包裝載體制備，并由Emory 大學(xué)病毒載體中心（Virus Vector Core）制備和擴增。AAV-GFAP-HspBP1和AAV-GFAP-GFP的滴度分別為8.8×1013vg/mL、2.8×1014vg/mL。

1.1.3 實驗動物 GFAP-HD 轉(zhuǎn)基因小鼠在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)特異性表達mHTT。C57BL/6J（野生型）小鼠由本實驗室保存。實驗小鼠均保存于Emory大學(xué)無菌級動物實驗中心，并根據(jù)Emory 大學(xué)動物管理委員會指南飼養(yǎng)和維護。本研究中全部動物實驗均由Emory大學(xué)動物資源部批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 立體定位注射 實驗用小鼠經(jīng)2.5%異氟醚麻醉后，將頭部固定在Kopf立體定位框架（1900型）中，該框架配有數(shù)字機械手、UMP3-1型注射泵和10-μL漢密爾頓微量注射器，使用33 G針頭進行注射。手術(shù)過程中給予美洛昔康（5 mg/kg）鎮(zhèn)痛。以前囟設(shè)置為坐標(biāo)0點；選取以下坐標(biāo)定位胼胝體：X=±1.5 mm、Y=－0.55 mm、Z=－1.0 mm；紋狀體：X=±2.0 mm、Y=－0.55 mm、Z=－3.5 mm。注射前使用PBS 將病毒滴度校正為1.0×1014vg/mL，病毒溶液的注射速度為0.2 μL/min，每次注射后留針5 min 以減少提針后病毒溶液沿針道擴散。手術(shù)結(jié)束后，將小鼠轉(zhuǎn)移到37 ℃溫控加熱墊上，每隔15 分鐘監(jiān)測1 次，直到完全蘇醒。注射完畢后每日檢測小鼠狀態(tài)，必要時給予美洛昔康（5 mg/kg/d）鎮(zhèn)痛。注射4周后，腹腔注射戊巴比妥（200 mg/kg）處死小鼠，分離腦組織進行后續(xù)實驗。

1.2.2 免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色 取小鼠新鮮腦組織，4%多聚甲醛4 ℃固定過夜后，使用30%蔗糖4 ℃脫水48 h。－20 ℃將腦組織切片成20 μm。漂片法使用0.3%Triton X-100 在37 ℃破膜15 min，用0.01 M 的檸檬酸鈉在95 ℃孵育15 min行抗原修復(fù)。4%胎牛血清37 ℃封閉抗原1 h，PBS 振蕩洗滌3 次后，4 ℃孵育一抗過夜。37 ℃孵育二抗1 h。免疫組織化學(xué)染色通過DAB 試劑盒顯色。免疫熒光染色37 ℃DAPI 染色10 min。以上結(jié)果均使用Zeiss Axiovert 200 MOT顯微鏡進行觀察。

1.2.3 Western Blot 取新鮮小鼠腦組織，RIPA 裂解30 min。期間超聲處理3 次，30 s/次。經(jīng)BCA 法滴定蛋白質(zhì)含量。將等量蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜后，4 ℃一抗孵育過夜。PBS洗滌3次后，二抗37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次后，用ECL溶液（KwikQuant）顯色。以上圖像使用KwikQuant軟件采集。

1.2.4 行為學(xué)實驗 隨機選擇2 月齡的野生型和GFAP-HD 小鼠，每種基因型使用12 只小鼠（雌雄各半）。每種基因型小鼠隨機分為AAV-GFAP-GFP 和AAV-GFAP-HspBP1 組后分別于雙側(cè)紋狀體立體定位注射AAV-GFAP-GFP 或AAV-GFAP-HspBP1。注射2周后開始行為學(xué)實驗準(zhǔn)備。實驗動物連續(xù)訓(xùn)練3天后開始正式測試。每次測試均重復(fù)3 次，取平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。分別進行旋轉(zhuǎn)桿、平衡木和握力實驗檢測小鼠運動功能。旋轉(zhuǎn)桿實驗中，小鼠連續(xù)3 天在旋轉(zhuǎn)棒（Rotamex 4/8，Columbus Instruments International）上以5 rpm 的速度進行預(yù)訓(xùn)練，10 min/次。實驗小鼠訓(xùn)練3 d 后開始正式測試：將旋轉(zhuǎn)桿的速度設(shè)置為5 rpm，以0.1 rpm/s 的速度遞增，記錄3 次小鼠落地時間。平衡木測試中，平衡木為長1 m，寬6 mm的木條，置于距離桌面上方50 cm 處的2 根木桿上。平衡木的一側(cè)放置黑盒用作測量終點。如前所述，3 次預(yù)訓(xùn)練后，正式實驗中通過計時器測量小鼠穿過平衡木中點所需的時間[10]。握力測試通過握力測量儀（Ametek Chatillon）直接測量。每次行為學(xué)實驗前測量小鼠體質(zhì)量。每隔1月進行1次上述檢測。所有行為學(xué)實驗均按照美國國立衛(wèi)生研究院的指南進行，并得到Emory大學(xué)動物管理委員會批準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism7 軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GFAP-HD小鼠星形膠質(zhì)細胞中表達mHTT

前期研究發(fā)現(xiàn)，mHTT在HD小鼠星形膠質(zhì)細胞中表達時較少出現(xiàn)神經(jīng)元特異性積聚現(xiàn)象[11,12]。GFAP-HD 轉(zhuǎn)基因小鼠模型為本實驗室前期構(gòu)建的特異性在GFAP 啟動子控制下表達mHTT 的動物模型。GFAP啟動子是一種星形膠質(zhì)細胞特異性啟動子，能夠驅(qū)動星形膠質(zhì)細胞表達各種基因[13,14]。本模型中使用的mHTT基因為編碼N’端208個氨基酸且攜帶160個谷氨酰胺（Q）的cDNA片段，該片段已被證實具有較強毒性[15]。為驗證轉(zhuǎn)基因mHTT-160Q 在星形膠質(zhì)細胞中的表達，我們采用4月齡GFAP-HD小鼠進行立體定位注射，注射4周后紋狀體區(qū)腦片進行免疫組化染色，結(jié)果提示GFAP-HD 轉(zhuǎn)基因小鼠的紋狀體中mHTT 表達水平極低，且未見到mHTT 的積聚，見圖1。該結(jié)果反映了mHTT在星形膠質(zhì)細胞中的表達和積聚受到限制。

圖1 HspBP1增加紋狀體星形膠質(zhì)細胞中mHTT表達和積聚

2.2 GFAP-HD小鼠星形膠質(zhì)細胞中過表達HspBP1誘導(dǎo)mHTT積聚

為了檢測HspBP1 過表達的體內(nèi)效應(yīng)，我們在GFAP-HD小鼠的右側(cè)紋狀體進行AAV-GFAP-HspBP1的立體定位注射。作為對照，AAV-GFAP-GFP被注射到左側(cè)紋狀體（圖2A）。Western blotting顯示AAV病毒能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)HspBP1（圖2B）。免疫組化染色顯示注射的腦區(qū)（皮質(zhì)、胼胝體和紋狀體）均顯示出明顯的HspBP1抗體染色（圖2A）。更重要的是，免疫熒光染色顯示AAV-GFAP-HspBP1 感染后，紋狀體星形膠質(zhì)細胞中mHTT的表達明顯增加并且出現(xiàn)核內(nèi)積聚（圖1）。前期研究中，我們從GFAP-HD小鼠腦組織中分離星形膠質(zhì)細胞進行原代培養(yǎng)，感染AAV-GFAP-HspBP1后，GFAP和mHTT的免疫熒光共染色證實mHTT在星形膠質(zhì)細胞中的積聚[16]。以上現(xiàn)象在皮質(zhì)和胼胝體內(nèi)得到證實（圖3）。同時，GFAP-HD 小鼠在AAV-GFAP-HspBP1注射后沒有出現(xiàn)NeuN 及GFAP 的變化（圖2C）。該結(jié)果提示，神經(jīng)元內(nèi)不表達mHTT時，僅增加mHTT在星形膠質(zhì)細胞中的積聚并不會產(chǎn)生嚴(yán)重的星形膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)元損傷。

圖2 星形膠質(zhì)細胞中過表達HspBP1

圖3 HspBP1增加皮質(zhì)和胼胝體星形膠質(zhì)細胞中mHTT表達和積聚

2.3 GFAP-HD小鼠星形膠質(zhì)細胞中過表達HspBP1誘導(dǎo)神經(jīng)病理性改變

前期研究表明，GFAP-HD 小鼠在沒有神經(jīng)元內(nèi)mHTT積聚的情況下依然能夠出現(xiàn)年齡依賴性運動功能障礙，但該現(xiàn)象在小鼠13 個月大之前并不明顯[8]。因此，GFAP-HD小鼠的運動障礙表型可能是由星形膠質(zhì)細胞內(nèi)mHTT積聚引起的。為了探討增加星形膠質(zhì)細胞中HspBP1 表達能否加速GFAP-HD 小鼠表型，我們將AAV-GFAP-HspBP1注入2月齡GFAP-HD和野生型小鼠的雙側(cè)紋狀體后監(jiān)測其運動功能，對照組為AAV-GFAP-GFP 注射的GFAP-HD 和野生型小鼠。紋狀體對于運動協(xié)調(diào)功能非常重要，改變mHTT 在紋狀體中的表達可以影響HD 小鼠的運動功能[17]。我們觀察到與注射AAV-GFAP-GFP 的對照組相比，注射AAV-GFAP-HspBP1的GFAP-HD小鼠出現(xiàn)更早（5-6月齡）的轉(zhuǎn)桿和平衡木以及握力下降。同時，注射AAVGFAP-HspBP1 的GFAP-HD 和野生型小鼠之間無明顯差異。不同小鼠組間體質(zhì)量未見明顯差異，見圖4。

圖4 HspBP1誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)病理性損傷，導(dǎo)致運動功能障礙

3 討論

早期研究表明，星形膠質(zhì)細胞攝取谷氨酸的能力對于防治谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性起重要作用。HD 中星形膠質(zhì)細胞過表達mHTT 可以影響多種細胞功能，如基因轉(zhuǎn)錄、神經(jīng)遞質(zhì)重攝取、膜通道活性和神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放[18,19]，進而誘導(dǎo)嚴(yán)重的病理性損傷[20,21]。我們早期的研究表明，mHTT 可以影響星形膠質(zhì)細胞對谷氨酸的攝取。然而，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)源性mHTT 過表達能否直接誘導(dǎo)神經(jīng)病理性表型目前仍有待研究。這對于驗證星形膠質(zhì)細胞在HD 中的致病作用尤為重要。

前期研究發(fā)現(xiàn)，mHTT在HD小鼠星形膠質(zhì)細胞中較少出現(xiàn)過表達或積聚[7,11]。GFAP-HD 轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在星形膠質(zhì)細胞中特異性表達mHTT，但mHTT 陽性細胞數(shù)目較少提示mHTT在星形膠質(zhì)細胞中的表達受到限制。前期研究中我們同時比較了不同年齡階段GFAP-HD小鼠星形膠質(zhì)細胞mHTT表達水平，結(jié)果顯示隨年齡增加，mHTT 在星形膠質(zhì)細胞的細胞質(zhì)和細胞核中分布并形成聚集體，該現(xiàn)象在野生型小鼠星形膠質(zhì)細胞中未見。因此，我們推測調(diào)控HD 星形膠質(zhì)細胞過表達mHTT可能加速病理性損傷。

HspBP1 在星形膠質(zhì)細胞表達水平遠低于神經(jīng)元，使其可能成為星形膠質(zhì)細胞清除mHTT 的關(guān)鍵因素[9,22]。本研究的結(jié)果證實了以上假設(shè)。GFAP-HD 星形膠質(zhì)細胞中HspBP1 的過表達加速了mHTT 的積聚。GFAP-HD 小鼠的年齡依賴性神經(jīng)表型為體重減輕、運動功能障礙和駝背外觀[8]。一旦GFAP-HD 小鼠表現(xiàn)出明顯的運動缺陷，它們的行為表型就會逐漸惡化，并通常在出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀后1～2 周死亡。我們在2月齡時將AAV-GFAP-HspBP1 或AAV-GFAP-GFP 病毒注入野生型和GFAP-HD 小鼠的兩側(cè)紋狀體后監(jiān)測其運動功能。結(jié)果顯示過表達GFAP-HspBP1 的GFAP-HD 小鼠出現(xiàn)更早的運動協(xié)調(diào)能力（轉(zhuǎn)桿、平衡木和握力）下降，但是并未觀察到體重減輕。同時免疫染色未見明顯的神經(jīng)元損傷或星形膠質(zhì)細胞活化。該結(jié)果提示過表達HspBP1 能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞mHTT 積聚加速年齡依賴性運動功能障礙；但mHTT在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中共同表達是神經(jīng)元顯著變性的必需條件。

本研究首次證實HspBP1 能夠通過促進星形膠質(zhì)細胞內(nèi)源性mHTT積聚介導(dǎo)HD 病理性損傷。該結(jié)果提示維持星形膠質(zhì)細胞正常功能對于治療HD具有重要意義。

致謝：本文部分工作在美國Emory大學(xué)李曉江教授實驗室完成。