魚鱗膏調(diào)節(jié)IL-6/STAT3信號通路對難愈性皮膚潰瘍模型大鼠創(chuàng)面愈合的影響

王晉軍,王品一,黃賢明,張中旺,陳嘯,李強(qiáng)

(青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院,山東 青島 266033)

體表慢性難愈合創(chuàng)面是臨床的常見病、多發(fā)病,多由糖尿病、意外創(chuàng)傷、燒傷、癰疽破潰等疾病引起,因其反復(fù)發(fā)作、長期不愈,易形成頑固性及難愈性潰瘍,屬于臨床難治性疾病之一[1-2]。近年來對難愈性潰瘍治療多采用抗生素和植皮療法,但治療效果并不理想,而且給患者帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此,研究難愈性潰瘍創(chuàng)面愈合的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的治療方法具有重要意義。魚鱗膏為本院制劑,由魚鱗膠、麻油、凡士林等制備而成,具有清熱祛腐、生肌長皮之功效,但目前對于其治療難愈性潰瘍的作用機(jī)制的研究相對匱乏。白細(xì)胞介素-6(interleukine-6,IL-6)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and transcriptional activator 3,STAT3)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在皮膚潰瘍愈合中發(fā)揮重要作用。研究表明,IL-6在糖尿病外周血和傷口組織中高表達(dá),并可驅(qū)動STAT3激活,促進(jìn)糖尿病傷口處的炎癥反應(yīng),從而延緩傷口愈合[4]。但魚鱗膏通過調(diào)節(jié)IL-6/STAT3信號通路對難愈性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合的影響尚不清楚,因此,本研究構(gòu)建糖尿病難愈性皮膚潰瘍大鼠模型,旨在探討魚鱗膏對難愈性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合的影響及潛在的作用機(jī)制,為臨床治療難愈性皮膚潰瘍提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司,生產(chǎn)許可編號：SCXK(魯) 2019-0003,8～10周齡,體重范圍在250～320 g之間,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,飼養(yǎng)溫度22～25 ℃,濕度55%～60%,12 h光暗循環(huán),不禁水食。實驗動物使用許可證：SYXK(魯) 20220014。

1.2 藥品與試劑藥膏制備：魚鱗膠240 g、凡士林300 g、麻油2 000 g,將生石膏、爐甘石分別研成細(xì)粉,當(dāng)歸、土鱉蟲、生地黃、龜板去凈雜質(zhì),處理干凈,飲片投料。將麻油加熱至200 ℃左右煉油1 h分次加入龜板、當(dāng)歸、生地黃、土鱉蟲至炸枯,藥渣棄去,藥油濾過。藥油繼續(xù)加熱并分次加入生石膏、爐甘石加熱10 min。將蜂蠟加熱融化,濾過,與藥油合并,冷卻。待藥油冷卻至80 ℃時,加入魚鱗膠攪拌成膏。

HE染色試劑盒(批號：G1120-100)、鏈脲佐菌素(STZ,批號：S8050)購自北京索萊寶科技有限公司;白細(xì)胞介素-6、-1β(IL-6、IL-1β,批號：E-EL-R0015c、E-EL-R0012c)、腫瘤壞死因子α(TNF-α,批號：E-EL-R2856c)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);重組大鼠IL-6蛋白(IL-6/STAT3通路激活劑,批號：SHR-388,南京賽泓瑞生物科技有限公司);兔抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF,批號：ab32152)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1,批號：ab215715)、IL-6(批號：ab259341)、STAT3(批號：ab68153)、p-STAT3(批號：ab30647)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF,批號：ab208687)、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(CD31,批號：ab281583)、GAPDH(批號：ab9485)一抗抗體以及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(批號：ab6721)均購于美國Abcam公司;IL-6、STAT3(引物購于北京擎科生物科技股份有限公司);TRIZol 試劑(批號：15596018,Invitrogen公司)。

1.3 主要儀器設(shè)備Mx3000P實時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司);CX31光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物造模、分組和給藥對照組用普通飼料喂養(yǎng),建模組參考小劑量鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高脂高糖飲食建立2型糖尿病大鼠模型的方法[5],高脂高糖喂養(yǎng)4周后,一次性腹腔注射STZ(35 mg·kg-1,0.3%),對照組注射等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(10 mL·kg-1)。注射后3、7、10 d取尾靜脈血測量大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),連續(xù)3次測得FBG均≥16.7 mmol·L-1,則為糖尿病造模成功。造模成功后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、魚鱗膏組、激活劑組,每組12只。普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)28 d,腹腔注射戊巴比妥鈉(3%,30 mg·kg-1)麻醉大鼠后,背部去毛,用蘸龍膽紫標(biāo)記背部造模面積,無菌條件下剪去造模區(qū)皮膚,深達(dá)筋膜,無菌紗布包扎,魚鱗膏組造模第2天開始給藥(0.5 g·d-1),用醫(yī)用紗布和橡皮膏固定,激活劑組大鼠用魚鱗膏干預(yù)(0.5 g·d-1)+腹腔注射0.05 mg·kg-1IL-6/STAT3通路激活劑rIL-6[6],每天給藥1次,連續(xù)給藥21 d,對照組、模型組腹腔注射等量的生理鹽水,傷口處用生理鹽水干預(yù)后無菌紗布包扎。

1.4.2 測量大鼠創(chuàng)面愈合情況在建模及給藥期間對大鼠創(chuàng)面邊緣進(jìn)行測量并拍照,采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對創(chuàng)面面積進(jìn)行測定,并計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(給藥前創(chuàng)面面積-給藥后創(chuàng)面面積)/給藥前創(chuàng)面面積×100%。

1.4.3 HE染色麻醉大鼠后,分離創(chuàng)面組織及創(chuàng)面周邊肉芽組織,部分創(chuàng)面及創(chuàng)面周邊肉芽組織經(jīng)固定、脫水、包埋后切片及脫蠟和水化,隨后進(jìn)行HE染色,最后在顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照,錄入MPIAS-400彩色病理圖圖文分析系統(tǒng),觀察新生毛細(xì)血管數(shù)。

1.4.4 大鼠創(chuàng)面組織中炎性因子的檢測創(chuàng)面組織及創(chuàng)面周邊肉芽組織經(jīng)研磨充分后,離心取上清、嚴(yán)格根據(jù)ELISA試劑盒檢測大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.4.5 免疫組化檢測bFGF、CD31的表達(dá)創(chuàng)面組織切片經(jīng)脫蠟和水化、過氧化氫處理后,滴加山羊血清封閉35 min,bFGF、CD31一抗(1∶1 000)在4 ℃孵育過夜,加入二抗(1∶2 000)在37 ℃孵育60 min、經(jīng)DAB、蘇木精染色,最后在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取6個視野觀察,并使用Image-Pro Plus 6.0分析bFGF、CD31陽性細(xì)胞率。

1.4.6 qRT-PCR檢測IL-6、STAT3 mRNA表達(dá)TRIZol試劑提取創(chuàng)面組織的總RNA、利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,并以cDNA為模板配置qRT-PCR反應(yīng)體系。IL-6上游引物：5′-CATCCAGTTGCCTTCTTG-3′和下游引物：5′-TATCCAGTTTGGTAGCATCC-3′;STAT3上游引物：5′-TGTTGGAGCAGCATTCTTC-3′和下游引物：5′-GGTCACAGACTGGTTGTTTC-3′;GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′和下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′;IL-6、STAT3以GAPDH為內(nèi)參,以2-ΔΔCT法計算各組組織中相對表達(dá)量。

1.4.7 Western blotting法檢測大鼠創(chuàng)面組織中IL-6/STAT3通路蛋白表達(dá)提取創(chuàng)面組織總蛋白,對蛋白進(jìn)行定量、電泳分離、轉(zhuǎn)膜,最后再分別加VEGF(1∶2 000、TGF-β1(1∶2 000)、IL-6(1∶2 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)一抗4 ℃孵育過夜,加入二抗(1∶1 000)在37 ℃孵育90 min。Image J軟件分析蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 魚鱗膏對大鼠創(chuàng)面愈合的影響與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著降低(P<0.05);與模型組比較,魚鱗膏組大鼠創(chuàng)面愈合率升高(P<0.05);與魚鱗膏組比較,激活劑組大鼠創(chuàng)面愈合率降低(P<0.05),結(jié)果見圖1和表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率的比較

圖1 第0、3、7和14天每組傷口表面愈合情況

2.2 魚鱗膏對大鼠創(chuàng)面組織損傷的影響對照組大鼠創(chuàng)面上皮細(xì)胞排列有序、成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管數(shù)量較多;與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)不完整,有大量炎癥細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管數(shù)量減少;與模型組比較,魚鱗膏組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)稍顯完整,炎癥細(xì)胞浸潤減少、成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管數(shù)量增加;與魚鱗膏組比較,激活劑組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重,炎癥細(xì)胞浸潤增加、成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管數(shù)量降低,結(jié)果見圖2和表2。

表2 各組大鼠新生血管數(shù)的比較

圖2 各組大鼠創(chuàng)面組織HE染色圖(×100)

2.3 魚鱗膏對大鼠創(chuàng)面組織中炎性因子水平的影響與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05);與模型組比較,魚鱗膏組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05);與魚鱗膏組比較,激活劑組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05),結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白水平比較

2.4 魚鱗膏對大鼠創(chuàng)面組織中bFGF、CD31表達(dá)的影響與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織中bFGF、CD31表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,魚鱗膏組大鼠創(chuàng)面組織中bFGF、CD31表達(dá)水平升高(P<0.05);與魚鱗膏組比較,激活劑組大鼠創(chuàng)面組織中bFGF、CD31表達(dá)水平降低(P<0.05),結(jié)果見圖3和表4。

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織中bFGF、CD31表達(dá)比較

圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織CD31、bFGF免疫組化染色

2.5 魚鱗膏對大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、STAT3 mRNA表達(dá)的影響與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、STAT3 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,魚鱗膏組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、STAT3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);與魚鱗膏組比較,激活劑組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、STAT3 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05),結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、STAT3 mRNA表達(dá)比較

A.對照組;B.模型組;C.魚鱗膏組;D.激活劑組圖4 Western blotting檢測各組創(chuàng)面組織中VEGF、TGF-β1及IL-6/STAT3通路蛋白表達(dá)

2.6 魚鱗膏對大鼠創(chuàng)面組織中VEGF、TGF-β1及IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF、TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低,IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,魚鱗膏組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF、TGF-β1蛋白表達(dá)水平升高,IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與魚鱗膏組比較,激活劑組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF、TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低,IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),結(jié)果見圖4和表6。

表6 各組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF、TGF-β1及IL-6/STAT3通路蛋白表達(dá)比較

3 討論

難愈性皮膚潰瘍是一種病理反復(fù)性炎癥反應(yīng),導(dǎo)致長期不愈,具有發(fā)病率高,病程長,預(yù)后較差的特點[7]。目前,難愈性皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合是臨床創(chuàng)面修復(fù)的一大難題,如創(chuàng)面得不到及時清理和治療,容易伴發(fā)感染,形成壞疽,導(dǎo)致截趾、截肢;若病情發(fā)展迅速,甚至?xí){生命[8-9]。

中醫(yī)認(rèn)為,難愈性皮膚潰瘍歸屬于“席瘡”“頑瘡”“脫疽”等病證范疇,其中醫(yī)致病機(jī)理為氣陰虛引起血瘀,局部脈絡(luò)失暢且伴濕熱,進(jìn)而導(dǎo)致血肉腐敗,臟腑失調(diào)[10]。中醫(yī)藥治療難愈性皮膚潰瘍有著悠久的歷史,而且療效確切[11]。魚鱗膏由魚鱗膠、麻油、凡士林等制備而成,其中魚鱗膠為主要成分,具有潤膚止血、斂瘡生肌之功效,為君藥。魚鱗膠性溫,味咸,有祛瘀生新、斂瘡生肌之功效?，F(xiàn)代研究也表明,魚鱗富含膠質(zhì)蛋白,具有保護(hù)創(chuàng)面、止血、抗炎、鎮(zhèn)痛的作用,能促進(jìn)組織細(xì)胞生長[12-13]。血管生成在整個傷口修復(fù)過程中至關(guān)重要,血管提供祖細(xì)胞、氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),以維持傷口部位的增殖和重塑。bFGF、VEGF和TGF-β1被認(rèn)為是皮膚傷口修復(fù)的重要生長因子。研究表明,bFGF可促進(jìn)新的血管形成和創(chuàng)傷組織內(nèi)的細(xì)胞增殖進(jìn)而加速創(chuàng)傷的愈合[14]。CD31是一種內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,可以反映血管生成程度[15]。在組織修復(fù)過程中,VEGF被認(rèn)為是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子,已被證明可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和血管生成、誘導(dǎo)肉芽組織的形成,從而促進(jìn)傷口修復(fù)[16]。TGF-β1參與成纖維細(xì)胞增殖,膠原蛋白合成和細(xì)胞外基質(zhì)重塑、血管生成和傷口愈合等多種生物學(xué)過程[17]。本研究發(fā)現(xiàn),魚鱗膏可促進(jìn)創(chuàng)面組織中bFGF、CD31、VEGF、TGF-β1蛋白表達(dá),促進(jìn)新生毛細(xì)血管形成、減少炎性浸潤、有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合。提示魚鱗膏可作為難愈性皮膚潰瘍的潛在治療藥物。

現(xiàn)代研究表明皮膚潰瘍愈合是一個動態(tài)的過程,可分為連續(xù)而又相互重疊的3個階段：炎癥反應(yīng)期、肉芽組織形成期(包括血管生成和上皮化)及基質(zhì)形成和重塑期[18]。炎癥反應(yīng)期是創(chuàng)面愈合的第一個階段,也是十分重要的階段。過度和持續(xù)的炎癥會產(chǎn)生不利于傷口愈合的環(huán)境,傷口愈合緩慢或無法愈合的風(fēng)險更大。已發(fā)現(xiàn)難愈性皮膚潰瘍患者血液中IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子顯著水平升高[19]。IL-6是一種多效性細(xì)胞因子,在免疫、組織再生和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,從局部病變向全身發(fā)送炎癥信號,它刺激免疫細(xì)胞募集單核/巨噬細(xì)胞,反過來,這些免疫細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥因子來募集更多的巨噬細(xì)胞,驅(qū)動炎癥級聯(lián)反應(yīng),引起持續(xù)的組織損傷,STAT3可以介導(dǎo)響應(yīng)IL-6細(xì)胞因子家族的基因轉(zhuǎn)錄[20]。STAT3參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡及血管生成。研究發(fā)現(xiàn),抑制IL-6/STAT3信號通路,可減少IL-6/STING通路引起的持續(xù)炎癥,并改善糖尿病傷口修復(fù),是糖尿病組織損傷的可行治療策略[4]。本研究還發(fā)現(xiàn),魚鱗膏可降低大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子的水平、IL-6、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)水平。而使用IL-6/STAT3通路激活劑后,IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子水平明顯升高,而血管生成和創(chuàng)面愈合相關(guān)蛋白bFGF、CD31、VEGF、TGF-β1表達(dá)水平則明顯降低。提示魚鱗膏可能通過抑制IL-6/STAT3信號通路,抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)難愈性皮膚潰瘍大鼠血管形成及創(chuàng)面愈合。

綜上所述,魚鱗膏具有抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)難愈性皮膚潰瘍大鼠血管形成及創(chuàng)面愈合的作用,其作用機(jī)制可能與抑制IL-6/STAT3信號通路有關(guān)。本研究為難愈性皮膚潰瘍的臨床治療提供了實驗依據(jù)。但魚鱗膏促進(jìn)難愈性皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合其他分子機(jī)制及通路仍需進(jìn)一步的研究。