3D結(jié)核球模型的構(gòu)建及特性驗證：基于人髓系THP-1細胞與卡介苗

郭佳俊，邱 燕，胡 璨，李岱容，杜永洪

重慶醫(yī)科大學1生物醫(yī)學工程學院，2 超聲醫(yī)學工程國家重點實驗室，3附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，重慶400016

結(jié)核?。═B）是由結(jié)核分枝桿菌（MTB）引起的一種慢性傳染病，是世界上最致命的傳染病之一［1,2］。其發(fā)病過程中形成的結(jié)核性肉芽腫是結(jié)核病灶的中心和關(guān)鍵病理結(jié)構(gòu)。肉芽腫為研究對MTB感染的免疫反應(yīng)和拓寬我們對其的理解提供了完美的環(huán)境；然而，人類肉芽腫難以獲得，體內(nèi)動物模型成本高昂，并不能完全地模擬人類免疫［3］。因此，體外構(gòu)建肉芽腫模型的方法需要開發(fā)和驗證。

結(jié)核性肉芽腫主要以成熟的巨噬細胞為核心，是一個有組織且含有多種細胞的細胞聚集體［4］。由于細胞堆積所形成三維結(jié)構(gòu)限制了氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)等不能有效運輸?shù)饺庋磕[內(nèi)部，造成了肉芽腫內(nèi)部的缺氧和壞死等一系列病變。過去文獻報道的體外構(gòu)建人結(jié)核性肉芽腫模型的方法主要在二維平面進行，如以MTB感染人外周血單個核細胞（PBMC）［5］，形成的體外模型由于缺乏三維結(jié)構(gòu)和擴散限制不能反應(yīng)體內(nèi)肉芽腫真實情況。三維模型培養(yǎng)揭示了單層模型所缺乏的特征，例如隨著PH值、氧氣和代謝梯度的發(fā)展，細胞與細胞之間復雜性的高級網(wǎng)絡(luò)分層——成熟球體以及形成的次級壞死核心和增殖區(qū)［6］。近年來，器官芯片、類器官、細胞球等三維細胞模型技術(shù)的發(fā)展為體外構(gòu)建3D模型提供了便利條件［7-9］。最新有研究報道了在3D細胞培養(yǎng)板中模擬肉芽腫建立了體外結(jié)核球模型，其建立簡單、可擴展、單孔內(nèi)形成大量球體，超過了當前體外TB模型的產(chǎn)量［10］。但尚未有研究探索有關(guān)結(jié)核球在三維空間形成后在微環(huán)境、藥物滲透等一系列與肉芽腫相關(guān)特性方面報道。

牛減毒分枝桿菌-卡介苗（BCG）具有與MTB相似的生長特性和高度的基因同源性，同時具有很高的生物安全性，因此常常代替MTB被用于實驗研究中［11］。本研究利用BCG感染人單核-巨噬細胞在3D細胞培養(yǎng)板中建立體外3D模型，旨在確定其在三維空間形成后的系列特征。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人髓系白血病單核細胞THP-1購自上海富衡生物科技公司，BCG購自成都生物產(chǎn)品研究所（S20013057）。

1.1.2 主要試劑和儀器RPMI 1640 培養(yǎng)基，胎牛血清（富衡生物）；PBS 緩沖液，青霉素-鏈霉素溶液（BioChannel）；H2O2檢測試劑盒（碧云天生物）；防水型PH計（阿拉?。?H9肉湯培養(yǎng)基，吐溫-80，甘油，OADC增菌液（Sigma）；3D 細胞培養(yǎng)平板和抗黏附?jīng)_洗液（STEMCELL科技）；PMA，利福平（陶術(shù)）；IBA-1抗體（NOVUS）；二級抗體FITC 標記山羊抗兔IgG（H+L）（EARTHOX）；SYTO 9/PI 熒光染色試劑盒BacLight Bacterial Viability Kit（L7012）（賽默飛）；Image-iT?紅色缺氧監(jiān)測試劑（Thermofisher）；鈣黃綠素（Calcein-AM）/碘化丙啶（PI）溶液，Triton X-100（碧云天生物）；左氧氟沙星（索萊寶）；Middlebrok 7H10瓊脂（海博生物）；多功能酶標記儀器（ThermoFisher），激光共聚焦顯微鏡（Nikon）；透射電鏡（基因有限公司）；ImageJ軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) THP-1細胞使用含10%胎牛血清和1%鏈霉素/青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞到對數(shù)生長期進行實驗。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 將凍存的BCG 菌液接種于含10%OADC 增菌液，0.2%甘油及0.05%吐溫-80的7H9 肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床中以180 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)至BCG 菌液的OD600=1.0 后進行實驗。

1.2.3 3D結(jié)核球模型的構(gòu)建 THP-1細胞通過血球計數(shù)法調(diào)整細胞濃度，BCG菌通過平板菌落計數(shù)法調(diào)整其濃度?？桂じ?jīng)_洗液處理3D細胞平板后，將細胞和細菌以感染復數(shù)（MOI）5混合后以細胞1×106每孔加入到3D細胞培養(yǎng)板，然后將細菌-細胞懸浮液（總體積為1000μL/孔）在1000 r/min下離心5 min后在100 ng/mL佛波酯（PMA）下培養(yǎng)24 h，然后更換到不含PMA的標準RPMI培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d，每天用標準的培養(yǎng)基進行半換液，以維持結(jié)核球的生長。3 d后將培養(yǎng)基溶液輕輕地移出孔中，用移液槍緩慢將球體從微孔中移出，然后用移液管取出收集到1.5 mL EP管中。在重力作用下使球體沉降30 min，輕輕移除培養(yǎng)基，并將球體用PBS洗滌兩次，將球體進行熒光染色觀察。

單純不含BCG菌的細胞球的培養(yǎng)除不加入BCG菌外其余操作同上。

1.2.4 觀察3D結(jié)核球內(nèi)BCG菌分布 首先用SYTO 9染液對BCG進行染色。從-20 ℃冰箱取出BCG菌，菌液在10 000 r/min下離心5 min，棄去上清液，加入1 mL PBS和10 μL SYTO 9 染液，與細菌混勻，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min，使得細菌標記為綠色。然后離心，將細菌沉淀重懸到1 mL標準RPMI中，后續(xù)建模時加入經(jīng)SYTO 9染液標記的BCG以形成結(jié)核球，利用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)核球的大小形態(tài)和內(nèi)部BCG菌的分布情況。

1.2.5 3D結(jié)核球內(nèi)細胞活性檢測 在BCG與THP-1細胞共培養(yǎng)的第3天，吸出培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)基，加入PBS洗滌2次后將結(jié)核球體轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)皿中，加入Calcein-AM/PI 染液，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min后用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)核球內(nèi)細胞存活情況。

1.2.6 結(jié)核球內(nèi)單核細胞轉(zhuǎn)變巨噬細胞檢測 單核細胞不能表達IBA-1抗體而巨噬細胞表達，我們使用IBA-1抗體檢測結(jié)核球內(nèi)單核細胞向巨噬細胞轉(zhuǎn)變情況。首先吸出3D培養(yǎng)板中培養(yǎng)基用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定30 min后PBS洗滌2次，用0.1%Triton X-100 孵育30 min 后加入1%山羊血清封閉1 h 后加入IBA-1抗體孵育2 h，PBS洗滌3次后加入FITC標記二級抗體孵育1 h，PBS洗滌2次后加入DAPI染色15 min后收集結(jié)核球到細胞培養(yǎng)皿中用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 結(jié)核球內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)觀察 將培養(yǎng)好的結(jié)核球收集到1.5 mL EP管，1500 r/min離心10 min將懸浮球體聚集后，棄去上清液，加入4%戊二醛4 ℃固定2 h，進行常規(guī)電鏡樣品固定、脫水和包埋，超薄切片后用于透射電鏡觀察。

1.2.8 結(jié)核球與細胞球微環(huán)境檢測 使用Image-iT?紅色缺氧探針、H2O2檢測試劑盒和防水筆形PH計檢測3D結(jié)核球和細胞球分別在缺氧程度，H2O2含量以及酸堿度的差異。將5μmol/LImage-iT?紅色缺氧探針添加到生長培養(yǎng)基中，并在37 ℃下孵育60 min將樣品用PBS洗滌3次后用激光共聚焦顯微鏡觀察，同時使用Image J軟件來分析和測量各實驗組的熒光強度。按照H2O2檢測試劑盒說明先使用H2O2檢測裂解液將球體進行裂解后加入H2O2檢測液反應(yīng)30 min后使用酶標儀檢測560 nm處的吸光度，通過H2O2標準曲線計算出其濃度。防水PH筆按照制造商說明先使用PH 7和PH 4標準液進行校正后，將電極置入結(jié)核球與細胞球培養(yǎng)基中并攪拌，使顯示值穩(wěn)定后記錄其數(shù)值此即為檢測液的酸堿值。

1.2.9 結(jié)核球與細胞球藥物滲透檢測 使用紅色熒光標記的納米粒檢測3D結(jié)核球與細胞球在藥物滲透情況上的差異。在實驗中，待結(jié)核球和細胞球發(fā)育成形后，加入等量的紅色熒光標記的納米粒共孵育2 h，然后用PBS洗滌3次后，將球體收集到細胞培養(yǎng)皿中，利用激光共聚焦顯微鏡觀察球體內(nèi)納米粒的滲透情況，并使用Image J軟件來分析和測量各實驗組中紅色熒光強度。

1.2.10 菌落計數(shù)檢測結(jié)核球評估抗菌藥物抑菌能力結(jié)核球成形后加入4 μg/mL 的左氧氟沙星或利福平反應(yīng)24 h后將結(jié)核球懸浮在0.05%Triton X-100裂解溶液中并在37 ℃下孵育5 min后將懸液收集在離心管中。然后將懸液在室溫下以10 000 r/min離心5 min，并將其沉淀重懸在1 mL PBS中。在PBS中進行連續(xù)稀釋，并在Middlebrok 7H10瓊脂平板上一式3份點樣100μL樣品。在37 ℃恒溫箱中孵育待其菌落生成后進行計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用t檢驗。P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體外3D結(jié)核球模型形成過程觀察

利用倒置熒光顯微鏡每天觀察結(jié)核球的形成情況，在混合接種后立刻觀察到微孔中大量細胞開始聚集（圖1 A），隨著培養(yǎng)時間延長到24 h時細胞開始聚集形成球樣結(jié)構(gòu)（圖1B），繼續(xù)延長培養(yǎng)時間到48 h時形成的球體更加緊密但球體邊緣還能觀察到少量散在細胞（圖1C），隨著培養(yǎng)時間延長到72 h時觀察到緊密的球體，球體邊緣未見散在細胞（圖1D）。

2.2 3D結(jié)核球內(nèi)BCG分布情況

CLSM觀察顯示明場條件下能觀察到由細胞堆積形成的結(jié)核球呈類圓形散分布，直徑大小在50～200 μm（圖2A），經(jīng)SYTO 9染色后的BCG感染整個結(jié)核球，分布于細胞內(nèi)部（圖2B）。

圖2 3D結(jié)核球內(nèi)BCG菌分布Fig.2 Distribution of BCG in 3D tuberculous spheroids.A: Diagram of a bright field of 3D tuberculous spheroids.B: Distribution of BCG in 3D tuberculous spheroids stained with SYTO 9 (laser confocal microscopy).C:Merged image ofA and B.Scale bar:100 μm.

2.3 結(jié)核球細胞活性染色觀察

CLSM觀察可見由于BCG感染和三維培養(yǎng)的限制球體內(nèi)部部分細胞出現(xiàn)壞死顯示紅色熒光（圖3B），另一部分細胞仍然存活顯示綠色熒光（圖3A），兩者緊密黏附形成3D結(jié)核球。

圖3 3D結(jié)核球內(nèi)細胞活性Fig.3 Cell viability in 3D tuberculous spheroids.A:Living Cells in 3D tuberculous spheroids.B:Dead cells in 3D tuberculous spheroids.C:Merged image ofAand B.Scale bar:100 μm.

2.4 DAPI/IBA-1免疫熒光染色觀察3D結(jié)核球內(nèi)單核細胞向巨噬細胞轉(zhuǎn)變情況

CLSM觀察顯示細胞聚集形成球體，DAPI染色細胞核顯示藍色熒光（圖4A），其內(nèi)大部分單核細胞分化為巨噬細胞表達IBA-1抗體顯示綠色熒光（圖4B）。結(jié)核球模型和體內(nèi)肉芽腫一致，都是以巨噬細胞為中心的細胞聚集體。

圖4 3D結(jié)核球內(nèi)單核細胞向巨噬細胞轉(zhuǎn)變Fig.4 Transformation of monocytes into macrophages in 3D tuberculous spheroids.A: Graph of DAPI labelled cells in TB spheres.B:IBA-1 staining of macrophages in 3D TB spheroids.C:Merged image of A and B.Scale bar:100 μm.

2.5 透射電鏡觀察3D結(jié)核球微觀結(jié)構(gòu)

在透射電子顯微鏡下觀察，細胞出現(xiàn)不同程度的壞死，如圖5A紅色箭頭所指正在壞死的巨噬細胞，細胞內(nèi)部大量細胞器被破壞，細胞膜開始逐漸溶解，圖5A黃色箭頭所指為被巨噬細胞吞噬的BCG，藍色線框內(nèi)為細胞核。圖5B黑色箭頭所指為嚴重壞死的巨噬細胞，綠色箭頭所指為完全壞死的巨噬細胞，細胞完全壞死后出現(xiàn)大量脂滴（藍色箭頭），紅色線框內(nèi)是被破壞的細胞核。

2.6 3D結(jié)核球與細胞球微環(huán)境檢測

CLSM觀察顯示，對比未受BCG感染細胞球，在結(jié)核球內(nèi)Image-iT?缺氧探針顯示更加強烈的紅色熒光且以中心區(qū)域為主（圖6A）。通過Image J軟件半定量分析細胞球和結(jié)核球內(nèi)紅色熒光強度，結(jié)核球內(nèi)中心區(qū)域紅色熒光強度顯著增加（P＜0.01）。過氧化氫檢測試劑盒，防水性PH計檢測結(jié)果顯示，結(jié)核球內(nèi)H2O2含量顯著高于細胞球（P＜0.01），PH值有明顯下降（P＜0.05）。

圖6 3D細胞球與3D結(jié)核球內(nèi)微環(huán)境Fig.6 Microenvironment within 3D cell spheroids and 3D tuberculous spheroids.A: Image-iTTM hypoxia probe detected hypoxia in 3D cell spheroids and 3D TB spheroids.Scale bar:100 μm.B:Image J Semi-quantitative analysis of the intensity of red fluorescence within 3D cell spheroids and 3D TB spheroids.C: Detection of hydrogen peroxide in 3D cell spheroids and 3D tuberculous spheroids.D:PH of 3D cell spheroids and 3D tuberculous spheroids,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.7 3D結(jié)核球與細胞球藥物滲透檢測

CLSM觀察顯示在細胞球中間層面有較強的紅色熒光，被紅色熒光標記納米粒難以滲透到達結(jié)核球內(nèi)部（圖7A）。通過Image J軟件半定量分析細胞球和結(jié)核球中間層面內(nèi)紅色熒光強度，細胞球明顯高于結(jié)核球（P＜0.05，圖7B）。

圖7 3D細胞球與3D結(jié)核球內(nèi)藥物滲透Fig.7 Drug penetration in the 3D cell spheroids and 3D tuberculous spheroids.A: Distribution of red fluorescencelabeled nanoparticles at different levels of 3D cell spheroids and 3D tuberculous spheroids observed by laser confocal microscopy(Scale bar:100 μm).B:ImageJ semi-quantitative analysis of the intensity of red fluorescence in the middle of 3D cell spheroids and 3D tuberculous spheroids.*P＜0.05.

2.8 結(jié)核球評估不同抗菌藥物抑菌能力

菌落計數(shù)結(jié)果顯示與未加藥物組相比加入抗菌藥物組菌落計數(shù)有明顯差異（圖8A～C）。即使在同一低濃度條件下一線抗結(jié)核藥物利福平也顯示更強抑菌效果，涂平板生長菌落數(shù)明顯少于左氧氟沙星組（P＜0.05，圖8D）。

圖8 平板菌落計數(shù)檢測抗菌藥物對3D結(jié)核球抑菌能力Fig.8 Detection of antimicrobial ability of the drugs to inhibit 3D tuberculous spheroids by plate colony counting,in which the 3D tuberculous spheroids were incubated with coated plates in the presence of RMPI medium(A),levofloxacin(B),and rifampicin(C)for 24 h.D:Plate colony count statistics,*P＜0.05.

3 討論

結(jié)核性肉芽腫是宿主免疫細胞和MTB相互作用最直接和最集中的部位，從一定程度上講，結(jié)核性肉芽腫的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸決定著TB的病程和感染結(jié)果［12,13］。由于TB的高傳染性和難以獲得新鮮的人類結(jié)核肉芽腫性肺組織，在患者肉芽腫水平上研究MTB發(fā)病機制的進展緩慢。目前，對MTB的免疫反應(yīng)主要在原代宿主免疫細胞中進行評估，這些細胞作為傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)物在體外培養(yǎng)，主要在平坦、堅硬的塑料上進行二維培養(yǎng)，被均勻暴露于病原體/免疫介質(zhì)的傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)物已成為研究宿主免疫細胞與分枝桿菌相互作用的重要工具［3］。然而，這些非生理條件不能涵蓋復雜組織微環(huán)境中細胞的關(guān)鍵要素，包括細胞濃度、細胞類型、細胞運動性、多細胞相互作用、細胞擴張、時空動力學和幾何結(jié)構(gòu)［14,15］。這些差異對疫苗開發(fā)、藥物療效和預防感染研究結(jié)果的解釋和翻譯構(gòu)成障礙，限制了結(jié)核病研究對人類健康的影響［3］。

與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)有助于彌補體外細胞培養(yǎng)和體內(nèi)反應(yīng)之間的差距，通過更緊密地模擬自然體內(nèi)環(huán)境、形狀、組織硬度、應(yīng)力和細胞反應(yīng)，同時克服動物模型的費用和倫理憂慮等缺點［16-18］，近年來該領(lǐng)域已成為許多學者研究的重點，如使用3D細胞培養(yǎng)物模擬腸道細菌感染［19］；建立3D乳腺腫瘤球模型研究藥物滲透［20］。最新有研究報道了在3D細胞平板中建立3D結(jié)核球模型［10］，但關(guān)于其形成后的系列特征如微環(huán)境變化、藥物滲透能力等仍未有任何報道。本文成功建立了結(jié)核球模型并探究了結(jié)核球形成后的系列特性。

本研究驗證了通過將BCG和單核-巨噬細胞納入3D細胞平板中能形成穩(wěn)定的結(jié)核球，觀察到了細胞從緩慢聚集到發(fā)育成球的過程。通過SYTO 9、Calcein-AM/PI、IBA-1染色后通過CLSM觀察到了BCG對于結(jié)核球的感染、球內(nèi)細胞壞死和單核細胞向巨噬細胞的分化，形成了以巨噬細胞為主的細胞聚集體，并通過透射電鏡觀察了球內(nèi)細胞微觀結(jié)構(gòu)的變化和BCG被吞噬于細胞內(nèi)部。已有研究報道了結(jié)核性肉芽腫主要是以巨噬細胞為中心的細胞聚集體［4］，MTB主要感染巨噬細胞被吞噬于巨噬細胞內(nèi)部［21］。

肉芽腫微環(huán)境異常和有效抗結(jié)核藥物能否滲透到達肉芽腫中心是抗結(jié)核治療失敗的關(guān)鍵。本研究驗證了相比于單純細胞球，被BCG感染的結(jié)核球缺氧進一步加重并以中心缺氧為主，其內(nèi)含更多的H2O2，PH有一定程度下降，藥物難以滲透到達結(jié)核球內(nèi)部。以往的研究表明分枝桿菌疾病和缺氧密切相關(guān)，結(jié)核性肉芽腫伴有缺氧［22］，在豚鼠、兔和非人靈長類動物中形成的結(jié)核性肉芽腫中均發(fā)現(xiàn)了缺氧現(xiàn)象［23］。肉芽腫內(nèi)酸化與肉芽腫內(nèi)高細菌負荷相關(guān)。已有研究報道抗結(jié)核藥物在肉芽腫每個微環(huán)境隔間中的滲透程度不同，且滲透性差，從而降低了藥物的可獲得性［24-26］，本研究中建立的結(jié)核球復制了結(jié)核性肉芽腫內(nèi)酸化和藥物難以滲透等特性。

為研究結(jié)核球能否評估藥物抗菌能力，本研究通過選用不同級別抗結(jié)核藥物與結(jié)核球反應(yīng)。研究結(jié)果表明相較于二線抗結(jié)核藥物左氧氟沙星一線抗結(jié)核藥物利福平能更好抑制結(jié)核球內(nèi)分枝桿菌，結(jié)核球有評估抗結(jié)核藥物強弱作用。近年來研究報道了各種球體形成技術(shù)用于中高通量藥物測試應(yīng)用［27,28］。我國最新發(fā)布的《基因修飾細胞治療產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導原則（試行）》已明確將3D 細胞模型納入評估藥物有效性和安全性的候選模型［29］。

綜上所述，本研究在成功建立結(jié)核球的基礎(chǔ)上研究了結(jié)核球形成后的一系列特征，驗證了體外3D結(jié)核球在一些特性上與肉芽腫有較高一致性，為3D模型的開發(fā)和TB的研究提供新思路。本研究未能考察抗結(jié)核藥物對結(jié)核球內(nèi)分枝桿菌抑菌機制作用，計劃在下一階段實驗深入研究。