DYRK1A調(diào)控NLRP3激活在帕金森病模型中的研究

蔡 倩, 夏 歡, 羅 琴, 楊新玲

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院, 烏魯木齊 830011; 2新疆神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830063; 3新疆醫(yī)科大學(xué), 烏魯木齊 830017)

帕金森病(Parkinson′s Disease,PD)是老年人中第二大常見的神經(jīng)退行性疾病。據(jù)估計(jì),PD占65歲以上人口的2%～3%,這給家庭和社會(huì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)[1]。盡管尚未闡明PD的確切機(jī)制,但越來越多的證據(jù)表明,小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是大腦老化和包括PD在內(nèi)的大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病的共同特征[2-3]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)的先天免疫細(xì)胞,在維持大腦穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[4]。然而,小膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)過度激活會(huì)誘發(fā)慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng),在帕金森病(PD)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性中起著至關(guān)重要的作用,其中小膠質(zhì)細(xì)胞富含的NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎癥小體可能作為PD治療的潛在靶點(diǎn)[5]。NLRP3是其中核心蛋白之一,它的激活啟動(dòng)炎癥小體的形成。

雙特異性酪氨酸調(diào)控激酶1A(Dual specificity tyrosine-regulated kinase1a,DYRK1A)是一種蛋白激酶,在中腦黑質(zhì)、紋狀體及海馬中表達(dá)豐富,對(duì)中腦多巴胺(Dopamine,DA)神經(jīng)元發(fā)育及其生理功能至關(guān)重要。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)的薈萃分析顯示DYRK1A是PD的一個(gè)危險(xiǎn)因素[6]。本研究擬分析DYRK1A在帕金森病神經(jīng)炎癥中的作用,在MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium,1-甲基-4-苯基吡啶離子)/MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶)誘導(dǎo)的PD細(xì)胞及動(dòng)物模型上分析DYRK1A與NLRP3蛋白的關(guān)系,探討可能的機(jī)制,為帕金森病的發(fā)病機(jī)制提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用BV2細(xì)胞(小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞)購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠采購(gòu)于廣東藥康生物科技有限公司,體重(20±1.24)g,共40只。所有的實(shí)驗(yàn)操作流程均符合中國(guó)動(dòng)物研究協(xié)會(huì)規(guī)定,遵從倫理委員會(huì)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.1.2 試劑 MPP+(美國(guó)Sigma公司)、MPTP(美國(guó)Sigma公司)、Harmine(美國(guó)Abcam公司)、兔抗NLRP3(ABclonal)、小鼠抗Dyrk1a(美國(guó)Santa cruz公司)、小鼠抗β-actin(美國(guó)Santa cruz公司)、Alexa Fluor 555山羊抗小鼠二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)、Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)、HRP標(biāo)記的抗兔二抗(美國(guó)Thermo Scientific公司)、HRP標(biāo)記的抗小鼠二抗(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)、化學(xué)發(fā)光成像儀(英國(guó)Syngene公司)、正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、臺(tái)式低速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 DYRK1A抑制劑Harmine處理PD細(xì)胞模型 培養(yǎng)BV2細(xì)胞,培養(yǎng)條件如下:37℃、5%CO2、高糖DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和5%胎牛血清(FBS,Invitrogen)。提前24 h將BV2細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,約1×106個(gè)/皿,密度達(dá)80%～90%后,將配好的MPP+母液(10 mmol/L)解凍后,用完全培養(yǎng)基稀釋為不同濃度(MPP+為0、50、75、100和125 μmol/L)處理BV2細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。選不同濃度的Harmine(0、5、10和15 μmol/L)處理BV2細(xì)胞(同時(shí)加入MPP+或者不加入MPP+)。

1.2.2 DYRK1A抑制劑Harmine處理PD慢性動(dòng)物模型 40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組[7],分別為對(duì)照組(DMSO組)、模型組(DMSO+MPTP組)、模型低濃度抑制劑(10 mg/kg)組(DMSO+H1+MPTP組)、模型中濃度抑制劑(20 mg/kg)組(DMSO+H2+MPTP 組)、模型高濃度抑制劑(30 mg/kg)組(DMSO+H3+MPTP 組),每組8只。除對(duì)照組外,剩余4組小鼠給予腹腔注射MPTP,25 mg/kg,每周2次,連續(xù)注射5周構(gòu)建PD慢性動(dòng)物模型[8]。3組抑制劑組還需間隔給予腹腔注射低、中、高濃度的Harmine,共5周。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性 細(xì)胞計(jì)數(shù)后,計(jì)算所鋪細(xì)胞的孔的數(shù)量,在96孔板中每孔加入100 μL含有4 000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;分別加入不同濃度MPP+,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h;每孔加入10 μL CCK8溶液,避光,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h;在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度,波長(zhǎng)為450 nm。吸光度值減去培養(yǎng)基的陰性對(duì)照即為相應(yīng)的OD值,統(tǒng)計(jì)分析各個(gè)濃度的OD值。

1.2.4 免疫印跡 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在裂解液中裂解,12 000 r/min離心15 min。參考BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液定量上清液中的蛋白質(zhì)濃度。將10 μg蛋白質(zhì)上樣到10% SDS凝膠上進(jìn)行電泳分離,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,然后在4℃下與一抗(鼠抗Dyrk1a,1∶500;兔抗NLRP3,1∶500)搖床過夜。最后,將膜與二抗(抗小鼠二抗1∶5 000;抗兔二抗1∶5 000)孵育2 h,加用ECL發(fā)光液,在化學(xué)發(fā)光成像儀下檢測(cè),獲取和分析圖像。

1.2.5 免疫組織熒光染色 取出冰凍切片,置于室溫復(fù)溫,將所需腦片貼在載玻片上,做好標(biāo)記,晾干;置于37℃恒溫箱內(nèi)烘干;PBS水化,倒出PBS,將腦片浸泡在枸櫞酸修復(fù)液中,微波爐修復(fù);梯度冷卻,PBS洗3次,0.3%Triton X-100破膜,PBS洗3次;腦片上滴加即用型山羊血清封閉液,室溫封閉1 h;棄去封閉液,加一抗(小鼠抗GFAP,1∶1 000;兔抗IBA1,1∶1 000),4℃過夜;第二日,室溫復(fù)溫,PBS清洗3次;加熒光二抗(Alexa Fluor 555山羊抗小鼠二抗,Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗,均為1∶1 000),室溫避光孵育1 h;PBS洗3次;在腦片上滴加含DAPI的封片劑,將蓋玻片蓋在腦片上,正置熒光顯微鏡下避光觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MPP+處理BV2細(xì)胞后DYRK1A及NLRP3蛋白的表達(dá)當(dāng)MPP+濃度分別為50、75和100 μmol/L時(shí),NLRP3蛋白表達(dá)水平較MPP+濃度為0時(shí)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);當(dāng)MPP+濃度分別為50、75和125 μmol/L時(shí),DYRK1A蛋白表達(dá)水平較MPP+濃度為0時(shí)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

注: (A-C)不同濃度的MPP+處理BV2細(xì)胞24 h后, WB檢測(cè)DYRK1A及NLRP3蛋白表達(dá); 與0 μmol/L MPP+相比, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。圖1 不同濃度MPP+處理BV2細(xì)胞后DYRK1A及NLRP3蛋白的表達(dá)

2.2 抑制DYRK1A后可減輕MPP+對(duì)BV2的損傷及NLRP3的激活

2.2.1 DYRK1A抑制劑改善MPP+損傷的BV2細(xì)胞活性 選用MPP+50 μmol/L的濃度干預(yù)BV2細(xì)胞24 h,產(chǎn)生毒性作用,細(xì)胞的活性下降;同時(shí)分別以0、5、10、15 μmol/L不同濃度的DYRK1A抑制劑(Harmine)處理24 h后,相比MPP+組,Harmine+MPP+組BV2細(xì)胞的活性增加,其中濃度為10、15 μmol/L時(shí),分別為74%、78%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖2A)。相比MPP+組,Harmine+MPP+組細(xì)胞培養(yǎng)基隨著Harmine濃度的升高,由黃色逐漸變?yōu)榧t色(圖2B)。

注:(A)不同濃度的Harmine處理MPP+干預(yù)的BV2細(xì)胞24 h后,隨著Harmine濃度的升高,BV2細(xì)胞活性呈濃度依賴性升高;(B)不同濃度Harmine處理MPP+干預(yù)的BV2細(xì)胞24 h,培養(yǎng)基顏色的變化情況,與MPP+組比較, ***P<0.001。圖2 不同濃度Harmine對(duì)MPP+損傷的BV2細(xì)胞活性的影響

2.2.2 抑制DYRK1A后可減輕MPP+誘發(fā)的NLRP3激活 與0 μmol/L MPP+比較,50 μmol/L MPP+處理小膠質(zhì)細(xì)胞后,NLRP3蛋白表達(dá)水平增加;選用10 μmol/L濃度的DYRK1A抑制劑(Harmine)及50 μmol/L的MPP+同時(shí)處理小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí),NLRP3蛋白的表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示DYRK1A抑制劑可減輕MPP+誘發(fā)的NLRP3蛋白激活(圖3)。

注:(A-B)使用DYRK1A抑制劑處理MPP+誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞,分為對(duì)照MPP+(0 μmol/L)組(0)、MPP+(50 μmol/L)組(M)、Harmine(10 μmol/L)組(H)、Harmine(10 μmol/L)+MPP+(50 μmol/L)組(H+M),WB檢測(cè)NLRP3蛋白的表達(dá);與MPP+(50 μmol/L)組(M)比較, **P<0.01。圖3 DYRK1A抑制劑處理MPP+誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3蛋白的表達(dá)

2.3 DYRK1A抑制劑可減少M(fèi)PTP慢性PD小鼠模型中腦黑質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量免疫組織熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組(DMSO組)相比,模型組(DMSO+MPTP組)小鼠中腦黑質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多;與模型組(DMSO+MPTP組)相比,模型中濃度抑制劑(20 mg/kg)組(DMSO+H2+MPTP組)小鼠中腦黑質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少(圖4)。

注:從左到右,標(biāo)尺依次為500 μm、 100 μm、 50 μm, n=3。圖4 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較

2.4 抑制DYRK1A后可減輕MPTP小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)NLRP3的激活與對(duì)照組(DMSO組)比較,模型組(DMSO+MPTP組)小鼠中腦黑質(zhì)中的NLRP3蛋白表達(dá)明顯升高;與模型組(DMSO+MPTP組)比較,不同濃度抑制劑組小鼠中腦黑質(zhì)中NLRP3蛋白表達(dá)均有下降。其中,模型中濃度及高濃度抑制劑組(DMSO+H2+MPTP、DMSO+H3+MPTP)下降明顯(P<0.05)(圖5)。與MPP+誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中DYRK1A蛋白升高結(jié)果一致。

注:(A-B)使用不同濃度DYRK1A抑制劑處理MPTP小鼠模型,WB檢測(cè)NLRP3蛋白的表達(dá);與DMSO+MPTP組比較, *P<0.05, n=5。圖5 DYRK1A抑制劑處理MPTP小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)NLRP3蛋白的表達(dá)

3 討論

神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致PD發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[9],研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在帕金森病的致病過程中起著關(guān)鍵作用[10-11]。作為大腦的主要免疫細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥過程中的主要細(xì)胞介質(zhì),它的激活在神經(jīng)退行性過程中至關(guān)重要[12-13]。其中小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎性小體的激活和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子可促進(jìn)PD進(jìn)展,受損的DA神經(jīng)元可直接導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活,產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-18)[14],而持續(xù)存在的小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥又可導(dǎo)致帕金森病(PD)中多巴胺能(DA)神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失。

小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3可能是神經(jīng)炎癥的持續(xù)來源,可以推動(dòng)DA神經(jīng)元病理學(xué)進(jìn)行性改變,成為PD疾病緩解治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[15]。本研究在使用MPP+處理小膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)NLRP3蛋白升高,其中在50 μmol/L濃度時(shí)升高最明顯,提示神經(jīng)毒素MPP+在啟動(dòng)NLRP3激活中可能有作用。與本研究一致的觀點(diǎn),Lee等[11]的研究顯示,在原代小膠質(zhì)細(xì)胞和混合神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中,MPTP/ATP處理通過產(chǎn)生線粒體活性氧促進(jìn)NLRP3炎性體的穩(wěn)健組裝和激活。MPP+在小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞中,在ATP或尼日利亞菌素處理存在的情況下誘導(dǎo)NLRP3炎性體激活。Qiao等[16]的研究顯示,下調(diào)NLRP3蛋白表達(dá)并抑制小鼠肝臟中NLRP3炎性體的激活,減輕了MPTP觸發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活和中腦DA神經(jīng)元丟失[16]。目前已有不少使用該靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)藥物研究的報(bào)道[17-19]。

DYRK1A是一種參與神經(jīng)細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的多效性激酶,在調(diào)節(jié)大腦生理功能和病理過程中起著關(guān)鍵作用。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)不同認(rèn)知功能障礙的帕金森病患者血漿DYRK1A水平有差異,提示血漿DYRK1A水平可能與帕金森病患者的認(rèn)知功能有關(guān)[20]。本研究在細(xì)胞模型上發(fā)現(xiàn)DYRK1A與NLRP3炎癥小體有關(guān)。在MPP+處理小膠質(zhì)細(xì)胞后,DYRK1A與NLRP3蛋白表達(dá)水平均有所升高;使用DYRK1A抑制劑Harmine后,NLRP3蛋白下調(diào)。考慮抑制DYRK1A可減輕MPP+誘導(dǎo)的帕金森病模型中NLRP3炎癥小體激活,從而減少神經(jīng)元丟失,起到神經(jīng)保護(hù)作用。相似的研究,Ju等[21]的研究結(jié)果顯示,脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的永生化小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系中,DYRK1A激酶的表達(dá)和活性均因炎癥而增加;使用 Harmine或siRNA沉默抑制DYRK1A可顯著減少LPS刺激的BV2細(xì)胞中促炎因子的產(chǎn)生。Araldi等[22]的研究顯示,一種DYRK1A/B酶抑制劑,新型含氟多酚衍生物(1c)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥模型和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶 (MPTP)帕金森病動(dòng)物模型這兩種體內(nèi)模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的活性。

綜上,NLRP3炎性小體激活在PD的神經(jīng)炎癥中起關(guān)鍵作用,本研究結(jié)果表明抑制DYRK1A可能抑制NLRP3的激活,為帕金森病的治療提供靶點(diǎn)。然而,盡管抑制NLRP3炎癥小體激活已被證明在PD模型中具有治療作用,但這些潛在藥物的安全性和有效性仍需要在PD患者的臨床試驗(yàn)中得到證實(shí),應(yīng)該加快基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化進(jìn)程,以實(shí)現(xiàn)PD的新治療策略。