簇毛麥染色體特異分子標記的篩選及應用

張 偉

（銅陵市農業(yè)技術管理服務中心，安徽 銅陵 244000）

簇毛麥（Haynaldia villosa），又名屬小麥族簇毛麥屬，是小麥的一個野生近緣種，不但抗小麥白粉病、銹病、全蝕病和眼斑病等多種病害[1-3]，而且具有分蘗力強、抗寒耐旱、密穗多花和籽粒蛋白質含量高等特點[4-5]，是小麥遺傳改良的重要基因源。為了進一步轉移和利用簇毛麥其他優(yōu)異基因，以硬粒小麥-簇毛麥雙倍體[6-7]為基礎材料，利用花粉輻射與有性雜交相結合，創(chuàng)制出大量的小麥-簇毛麥屬間染色體易位，用中國春對這些材料連續(xù)回交，已得到普通小麥背景中只包含單條簇毛麥染色體結構變異的一些單株。早期準確鑒定這批單株中簇毛麥的身份，對于簇毛麥有益基因的定位及利用，都具有重要的現(xiàn)實意義和應用價值[8-10]。

據統(tǒng)計，目前報道的簇毛麥各類標記僅有43個[11-13]，且分布不均勻，利用這些標記來鑒定大量的簇毛麥染色體結構變異體是遠遠不夠的。隨著測序技術的發(fā)展，大量涌現(xiàn)的表達序列標簽（Expressed Sequence Tag，EST）序列為引物設計提供了便利[14-15]。EST 是對cDNA 文庫隨機挑取的克隆進行大規(guī)模測序獲得的一段cDNA 的5′或3′端序列，長度一般為300～500 bp[16-18]。比較基因組研究結果表明，EST 的序列組成和染色體上的排列順序在禾本科物種間具有高度的共線性[19]。小麥及其近緣物種的EST 在理論上具有更高的共線性，定位于小麥染色體某一部分同源群的EST 也應存在于近緣物種同一部分同源群染色體的對應部位。由于EST 來自轉錄區(qū)，其保守性較高，在族和屬間的通用性比來源于非表達序列區(qū)的標記更好，特別適用于遠緣物種間的比較基因組研究，另外，利用EST序列開發(fā)的各種標記具有多態(tài)性高、操作簡單、經濟并且高效的特點。本研究為了鑒定花粉輻射得到的結構變異染色體中的簇毛麥身份，基于作物的共線性關系，利用小麥的EST 序列合成STS 引物，以及小麥、大麥和黑麥的SSR 引物，篩選能準確鑒定簇毛麥各條染色體的特異標記，為簇毛麥的進一步研究和利用提供更便捷有效的工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

普通小麥中國春（Triticum aestivumvar.Chinese Spring，CS）、簇毛麥（由南京植物園從英國劍橋植物園引進）、硬粒小麥（T.durum）由中國農業(yè)科學院引種組從國際玉米小麥改良中心引進，編號“中引1286”）、硬粒小麥-簇毛麥雙倍體（T.durum-H.villosa amphiploid，由南京農業(yè)大學細胞遺傳研究所選育）、小麥-簇毛麥整套二體異附加系DA1V至DA7V和硬粒小麥-簇毛麥雙倍體花粉輻射回交后代均由南京農業(yè)大學細胞遺傳研究所保存。

1.2 引物

為篩選簇毛麥1V 至7V 各條染色體的特異標記，根據小麥EST 序列合成了1 125 對STS 引物；另選用小麥SSR 引物227 對，大麥SSR 引物61 對和黑麥SSR 引物163 對（表1）。以上引物均由上海英駿生物公司合成。

表1 本研究用于篩選簇毛麥染色體特異標記的引物類型

1.3 基因組DNA提取

參照Sharp 等[20]的方法，用1×TE 溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR反應

PCR體積為10 μL，包含約20～30 ng模板DNA，1×buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 mmol/L dNTP，引物終濃度各為0.2 mol/L，0.5 UTaqDNA 聚合酶（以上試劑均來自Promega 公司）。PCR 程序為94 ℃變性3 min；94℃30 s、55～60 ℃（依引物而定）50 s、72 ℃1 min，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 產物檢測

參照Tixier 等[21]的方法檢測產物，其中所用Marker 為DL2000（Promega）。PCR 擴增產物或酶切產物中加入聚丙烯酰胺凝膠電泳專用的Loading buffer 2 μL 混勻，取3 μL 樣液用8%聚丙烯酰胺凝膠（39∶1）電泳檢測結果。電泳時總電壓為180 V，電泳1.5 h 左右，銀染后將膠放在凝膠成像儀上觀察照相[22]。

2 結果與分析

2.1 篩選簇毛麥各條染色體特異分子標記

在檢測的1 125對小麥EST引物中，有597對引物可以在中國春與簇毛麥間擴增出多態(tài)性條帶，占小麥EST引物的53.1%；在檢測的227對小麥SSR引物中，有93對引物可以在中國春與簇毛麥間擴增出多態(tài)性條帶，占小麥SSR 引物的41.0%；在檢測的61 對大麥和163 對黑麥的SSR 引物中，分別有13 對和52 對引物可以在中國春和簇毛麥間擴增出多態(tài)性條帶，分別占大麥SSR 引物的21.3%和黑麥SSR引物的31.9%?？梢钥闯觯眯←淓ST 序列設計的引物和小麥的SSR 引物在親本間有較高的多態(tài)性，而大麥和黑麥的SSR 引物在親本間的多態(tài)性較低。用這些多態(tài)性引物對親本及普通小麥-簇毛麥1V-7V 二體附加系進行擴增分析，篩選到簇毛麥特異條帶只出現(xiàn)在1個異附加系中并且?guī)Ъy穩(wěn)定清晰的引物共89對，其中，1V標記2個、2V標記14個、3V標記8個、4V標記8個、5V標記41個、6V標記2個和7V標記14個，如表2所示。

表2 所篩選的簇毛麥染色體特異分子標記

位于小麥第一群的SSR引物Xbarc210在簇毛麥、硬粒小麥-簇毛麥雙倍體以及1V附加系中均擴增出相同的220 bp，而中國春及其他附加系則無此帶（圖1a），表明Xbarc210-220可作為簇毛麥1V染色體的特異標記。同樣，引物CINAU186、CINAU200、CINAU206、CINAU211、CINAU250和CINAU255在分別涉及簇毛麥2V、3V、4V、5V、6V和7V染色體異附加系中均可擴增出與簇毛麥、硬粒小麥-簇毛麥雙倍體相同的特異帶，因此可分別作為簇毛麥2V、3V、4V、5V、6V和7V染色體的特異標記（圖1b-g）。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，定位于第五和第七群的EST序列所涉及的引物可以特異追蹤簇毛麥的7V和4V染色體，這一結果符合小麥在進化過程中第四、第五和第七群之間發(fā)生了復雜的易位和倒位。如根據第五群EST序列設計的引物CINAU259（5AL 0.59-0.78）可以追蹤簇毛麥的7V 染色體，而根據第七群EST 序列設計的引物CINAU206 （7AS 0.89-1.00，7DS 0.61-1.00） 、CINAU207 （7AS 0.89-1.00，7DS 0.61-1.00） 、CINAU208 （7AS 0.89-1.00，7BS 0.27-1.00） 和CINAU209（7DS 0.61-1.00）可以特異追蹤簇毛麥的4V染色體。

圖1 引物對親本及小麥-簇毛麥異附加系DNA的擴增

2.2 簇毛麥染色體結構變異體鑒定

從中國春/硬粒小麥-簇毛麥（60Co-γ 射線照射花粉）//中國春BC3～BC4代中，選用經GISH 鑒定在普通小麥背景中只含單條簇毛麥染色體結構變異的110 份材料，用本研究得到的和已有的146 個簇毛麥特異引物擴增親本和110 份材料的DNA，鑒定所涉及的簇毛麥染色體身份。圖2 是利用定位于簇毛麥1V 染色體短臂標記Xcinau27-620和長臂標記Xcinau32-300在親本和部分簇毛麥染色體結構變異體單株中的擴增結果。CINAU27 在簇毛麥、硬粒小麥-簇毛麥雙倍體、1V 附加系、1VS·W、TV54-4-1（泳道14）、TV288-4（泳道15）、TV277-7（泳道16）和TV281-6（泳道18）中擴增出約620 bp的特異帶，而中國春和其他結構變異體均未擴增出此帶（圖2a）；CINAU32 分別在TV322-22（泳道17）、TV281-6（泳道18）和TV279-2（泳道19）中擴增出與簇毛麥相同的300 bp 的特異帶，而中國春和其他變異體均未擴增出此帶（圖2b），表明這些材料中涉及的外源染色體片段均為1V 染色體片段。

圖2 特異引物CINAU27（a）和CINAU32（b）對簇毛麥結構變異染色體系DNA的擴增

3 結論與討論

對導入小麥背景中簇毛麥染色體的準確鑒定是利用其優(yōu)異基因的前提，鑒定方法有多種，如形態(tài)學標記、C-分帶和生化標記等，但這些方法都有各自的局限性。建立在DNA 水平上的分子標記所揭示的多態(tài)性直接反映基因組DNA 間的差異，不受發(fā)育階段和環(huán)境的影響[12]，因此是鑒定小麥背景中簇毛麥染色體“身份”、易位染色體斷點位置和片段長度的有效工具。課題組一直致力于簇毛麥各條染色體特異分子標記的開發(fā)，據統(tǒng)計，現(xiàn)開發(fā)的基于PCR 的簇毛麥各條染色體特異分子標記共有43 個（表3），分布不均勻，其中3V、5V 和7V 染色體標記較少，只有2～3 個。可見，要想鑒定花粉輻射得到的一大批簇毛麥染色體結構變異體，各類標記的密度遠未達到令人滿意的程度。本研究針對這一現(xiàn)狀，利用EST-STS 通用性好、穩(wěn)定性高的特點，篩選到84 對分布于1V—7V 染色體的STS 標記，另外還篩選到5 對SSR 標記，對已開發(fā)或篩選的簇毛麥分子標記起到有益補充。因已得到的4V和6V染色體標記較多，本研究未對其作針對性篩選。

表3 開發(fā)的簇毛麥各條染色體基于PCR的特異分子標記

續(xù)表3 開發(fā)的簇毛麥各條染色體基于PCR的特異分子標記

續(xù)表3 開發(fā)的簇毛麥各條染色體基于PCR的特異分子標記