微孔草孢囊線蟲孵化和侵染特性

魏雪娟，李文豪，劉永剛，倪春輝，喬萬強，安麗婷，李惠霞

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070）

微孔草(Microula sikkimensis)屬于紫草科微孔草屬兩年生草本植物，為我國特有的耐高寒優(yōu)質(zhì)珍稀野生油料植物[1]，主要生長在青藏高原及毗鄰的高寒地區(qū)[2]。微孔草具有獨特的藥用、保健和營養(yǎng)等價值，其莖葉可飼用，其種子富含γ-亞麻酸、α-亞麻酸等天然不飽和脂肪酸，可用于治療心腦血管疾病，具有防止血脂沉積、預(yù)防高脂血癥等功能[2-3]。目前，微孔草的研究主要集中在種子營養(yǎng)成分分析、人工種植、資源調(diào)查及利用等[4]方面，鮮有關(guān)于微孔草病害及抗逆性方面的報道。

孢囊線蟲(cyst nematodes)是植物寄生線蟲(plantparasitic nematodes，PPN) 的重要類群之一，屬于固著型內(nèi)寄生線蟲[5]。其中禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)、大豆孢囊線蟲(H.glycines)和甜菜孢囊線蟲(H.schachtii)引起的孢囊線蟲病分別是嚴重威脅麥類、大豆(Glycine max)和甜菜(Beta vulgaris)的重要病害，造成不同程度的經(jīng)濟損失[6]。在我國，僅大豆孢囊線蟲每年造成6 億元以上的經(jīng)濟損失[7]。微孔草孢囊線蟲(H.microulae)為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病原線蟲實驗室2020 年在甘肅省天祝高寒草甸發(fā)現(xiàn)寄生微孔草的孢囊線蟲屬新種，是我國發(fā)現(xiàn)的首個豌豆孢囊線蟲的線蟲[8]。目前，對于微孔草孢囊線蟲生物學(xué)特性及其引起的病害均缺乏了解。

孢囊線蟲典型的生活史是由孢囊內(nèi)的卵孵化，破殼孵出線形的二齡幼蟲(second-stage juvenile，J2)，J2 從根尖侵入根系，在中柱鞘附近建立取食位點，之后再經(jīng)2 次蛻皮，依次發(fā)育成豆莢形的三齡幼蟲(J3)和四齡幼蟲(J4)。第4 次蛻皮后，檸檬形的白色雌蟲尾部突破根表，線形的雄蟲離開根系，進入土壤尋找雌蟲受精，受精后的雌蟲開始產(chǎn)卵[5]。線蟲卵的孵化特性因種類不同而異，也受溫度和土壤理化環(huán)境的影響。了解其卵的孵化、J2 活性及其生活史，對于掌握微孔草孢囊線蟲生物學(xué)特性及其侵染規(guī)律具有重要意義。因此，本研究以微孔草孢囊線蟲為材料，觀測不同溫度和孵化液對卵孵化及J2 存活能力的影響，并觀察其生活史，以期為該線蟲生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，也為該病害及時有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 線蟲的采集及孢囊的分離

供試微孔草孢囊線蟲，采自甘肅省天祝高寒草甸牧草微孔草根及根際10 cm范圍內(nèi)的土壤，帶回實驗室風(fēng)干后，參照段玉璽[6]的簡易漂浮法分離孢囊線蟲。將得到的分離物移至0.15 mm 尼龍紗，在體式顯微鏡(奧林巴斯，東京，日本)下挑選新鮮飽滿的孢囊，于4 ℃冷藏備用。

1.2 孵化保濕液制備

1.2.1 微孔草分泌物的制備

參考徐志鵬等[9]的方法并稍有改動。將微孔草種子用5.25%次氯酸鈉溶液消毒10 min，用無菌水清洗干凈后，放置在墊有濾紙的15 cm 培養(yǎng)皿中保濕催芽。待種子發(fā)芽后加入無菌水，10 d 后收集其根系培養(yǎng)液，用漏斗經(jīng)無菌濾紙過濾后備用。

1.2.2 根系土壤浸液的制備

參考王明祖和顏家坤[10]的方法并稍有改動。將30 g 風(fēng)干的微孔草根際土壤放置在燒杯內(nèi)，加無菌水約200 mL，隨后攪拌4 min 使土壤充分溶解，靜置約30 min，取上清液，用漏斗經(jīng)無菌濾紙過濾后備用，即為根系土壤浸液。

1.2.3 根汁的收集

參考賀沛成等[11]的方法并稍有改動。將新鮮的微孔草根組織用無菌水洗凈，用無菌濾紙吸除多余水分。取約20 g 干凈根系置于研缽內(nèi)小心研碎并榨取汁液，用漏斗經(jīng)無菌濾紙過濾后得到根汁，再用無菌水稀釋5 倍、10 倍和20 倍后備用。

1.3 溫度對孢囊內(nèi)卵孵化的影響

將選取的孢囊消毒后，置于盛有微孔草根系分泌物的6 孔細胞培養(yǎng)板中孵化。設(shè)置10、15、18、20、25 和30 ℃ 6 個溫度梯度，每個溫度處理選10 個孢囊，每處理重復(fù)3 次。每隔2 d 查看卵的孵化數(shù)量，每4 d 更換1 次孵化液，統(tǒng)計30 d 內(nèi)的卵孵化總量，并計算孵化率。

1.4 不同孵化液對孢囊內(nèi)卵孵化的影響

分別選取土壤浸液，微孔草5 倍根汁、10 倍根汁、20 倍根汁，4 mmol·L-1ZnCl2溶液和無菌水6 種孵化液，并在最適溫度15 ℃下進行孵化，其他操作同1.3。

1.5 溫度對J2 存活能力的影響

1.5.1 初孵J2 存活能力觀察

參考賀沛成等[11]的方法，在1.3 試驗的第20 天起， 每2 d 統(tǒng)計1 次， 連續(xù)統(tǒng)計5 次，分析初孵J2的存活情況。死亡的J2 呈僵直狀，體內(nèi)含有大量的氣泡。若無法辨別，則將其挑入2%氯化鈉溶液觀察，活蟲會卷曲，若蟲體無生命體征，則按死蟲統(tǒng)計。

1.5.2 J2 離體存活能力觀察

參考鄭經(jīng)武等[12]的方法，將50 條初孵J2 移入6 孔細胞培養(yǎng)板， 加蓋后分別置于4、10、15、20 和25 ℃的培養(yǎng)箱中， 每溫度重復(fù)3 次， 每2 d 觀察一次并剔除死蟲。線蟲死活鑒定同1.5.1。

1.6 室內(nèi)生活史觀察

先將微孔草種子經(jīng)5.25%次氯酸鈉溶液消毒處理，用無菌水沖洗3 遍[13]，再將種子置于墊濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，放入25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中黑暗條件催芽2 d。將經(jīng)180 ℃處理4 h 的滅菌土裝入直徑9 cm、高12 cm 的塑料花盆，而后選取催芽后長勢基本一致的種子，將其種植在花盆內(nèi)，每盆定植1 株，共播種30 盆。待微孔草長出2～3 片真葉時，參照甄浩洋等[14]方法，接微孔草孢囊線蟲新鮮卵每盆2 000 粒。接種時，用玻璃棒在微孔草根部周圍1～2 cm 均勻地打3 個洞，用移液槍將微孔草孢囊線蟲新鮮卵懸浮液打進洞中，并用少量的滅菌土壤覆蓋。接種后于15 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中以14 h/10 h 光暗培養(yǎng)。接種后每3 d 隨機取2 株觀察，并采用次氯酸鈉-酸性品紅染色法進行染色[6]，用體式顯微鏡(奧林巴斯，日本東京)和生物顯微鏡(蔡司，德國)觀察各齡期線蟲在根系中的發(fā)育情況。同時，記錄各齡幼蟲、白雌蟲及孢囊首次出現(xiàn)的時間。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 軟件分別對數(shù)據(jù)進行整理和初步分析，采用單因素方差分析和鄧肯法多重比較分析不同溫度、不同孵化液、不同時間處理之間的差異，統(tǒng)計水平為0.05，使用SPSS 19.0 進行顯著性檢驗；圖表繪制采用Excel 2016。

2 結(jié)果

2.1 溫度對微孔草孢囊線蟲孢囊內(nèi)卵孵化的影響

15 ℃處理30 d，微孔草孢囊線蟲卵的孵化率最高，為32.0%，顯著高于其他溫度下的孵化率(P＜ 0.05)(圖1A)。18 ℃下次之，孵化率為21.7%。而20 和25 ℃下孵化率均低于15%，10 和30 ℃下孵化率均低于5%。因此，15 ℃為該線蟲最適宜的孵化溫度。

圖1 溫度、孵化液對微孔草孢囊線蟲孵化的影響Figure 1 Effects of temperature and hatching solutions on the hatching of Heterodera microulae

2.2 孵化液對孢囊內(nèi)卵孵化的影響

在15 ℃下，微孔草孢囊線蟲的卵在土壤浸液、20 倍、10 倍微孔草根汁有利于線蟲孵化，卵孵化率分別為28.1%、20.0%、15.3%，均顯著高于無菌水處理組(P＜ 0.05)，分別為無菌水的2.96 倍、2.11 倍和1.61 倍 (圖1B)。4 mmol·L-1ZnCl2溶液中的孵化率與無菌水處理無顯著差異(P＞ 0.05)，而5 倍微孔草根汁的孵化率顯著低于無菌水。

2.3 溫度對初孵J2 存活能力的影響

在15 ℃下30 d 2 齡幼蟲的存活率最高，為72.7%，顯著高于大于15 ℃處理的存活率(P＜ 0.05)(圖2)。10 ℃下次之，存活率為67.2%。當(dāng)溫度為30 ℃時，20 d 時J2 全部死亡。可見，10～15 ℃為初孵J2 適宜的存活溫度。

2.4 溫度對微孔草孢囊線蟲J2 離體存活能力的影響

微孔草孢囊線蟲J2 在不同溫度下處理18 d 時，除4 ℃外，其他溫度下超過半數(shù)的線蟲死亡(圖2)。當(dāng)處理30 d 時，4 ℃下線蟲死亡率最低，為34.7%；15 ℃次之，雖然線蟲活動能力較強，但死亡率為95.3%，其他溫度下死亡率為100%。由此可見，4 ℃適合較長時間保存該線蟲，而15 ℃只適合短期保存。

2.5 室內(nèi)生活史觀察

15 ℃下接種新鮮的卵后，微孔草根系內(nèi)線蟲發(fā)育情況如圖3 所示。接種后3 d，可在微孔草根系檢測到蠕蟲形的J2 (圖3A)。接種后9～15 d，觀察到大量J2 侵入根系，但尚未見J3 (圖3B)。接種18 d 后，在根系觀察到豆莢形的J3 (圖3C，D)。接種24 d后，首次在根系觀察到膨大成檸檬形的J4 和雌蟲(圖3E，F(xiàn)，G，H)。接種27 d 后，根部觀察到少量淡褐色孢囊(圖3I)。綜上所述，在15 ℃下，該孢囊線蟲在微孔草根系內(nèi)良好發(fā)育，完成一代最短為27 d。

圖3 15 ℃下微孔草孢囊線蟲在微孔草中的生活史Figure 3 Life cycle of Heterodera microulae in roots of Microula sikkimensis at 15 ℃

3 討論與結(jié)論

作為一種變溫生物，線蟲的孵化、生長發(fā)育、種群動態(tài)與溫度密切相關(guān)[15]，由于生態(tài)型的差異，線蟲不同地理群體間的最適孵化溫度隨之不同[12]，大多數(shù)孢囊屬線蟲卵孵化的適宜溫度為15～29 ℃[16]。本研究結(jié)果表明微孔草孢囊線蟲卵孵化的最適溫度為15 ℃，與禾谷孢囊線蟲的最佳孵化溫度接近[12]，屬于低溫孵化型線蟲。而玉米孢囊線蟲(Heterodera zeae)最適孵化為33 ℃[17]、旱稻孢囊線蟲(Heterodera elachista)甘肅群體為28 ℃[9]、甜菜孢囊線蟲(H.schachtii)為25 ℃、大豆孢囊線蟲為24 ℃[17]及Vandenbossche 等[18]報道甜菜孢囊線蟲在20～30 ℃累積的孵化率最高，這幾種線蟲屬于高溫孵化型線蟲。

作為微孔草孢囊線蟲主要寄主的微孔草，生長在氣候寒冷潮濕、晝夜溫差較大的環(huán)境。目前，微孔草孢囊線蟲在天祝高寒草甸微孔草上發(fā)現(xiàn)。天祝縣位于河西走廊祁連山東端，海拔2 040～4 874 m。當(dāng)?shù)貧夂蚝涑睗?、空氣稀薄、晝夜溫差大，年均溫?0.1 ℃，僅分冷、熱兩季[19]。生存在這樣的環(huán)境下，微孔草孢囊線蟲形成了低溫孵化的習(xí)性。本研究發(fā)現(xiàn)，該線蟲新鮮孢囊中的卵不需要低溫刺激即可孵化，這一點與禾谷孢囊線蟲[20]不同。

一般來說，寄主根系分泌物可刺激卵的孵化[21]。本研究結(jié)果顯示，土壤浸液和20 倍微孔草根汁對微孔草孢囊線蟲卵的孵化有促進作用，而5 倍微孔草根汁對孵化有明顯的抑制作用，這與根汁對旱稻孢囊線蟲孵化(H.elachista)的作用結(jié)果一致[9,11]。說明土壤和微孔草分泌物中可能存在誘導(dǎo)孢囊孵化的化學(xué)物質(zhì)，土壤浸液更接近田間土壤生化環(huán)境，20 倍微孔草根汁更接近寄主根系分泌物濃度，但對于微孔草根系分泌物種類及其作用機理有待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)4 mmol·L-1ZnCl2溶液對微孔草孢囊線蟲孵化無顯著促進作用，這與Zn2+對小麥孢囊線蟲效果一致[22]。但也有研究表明，Zn2+刺激會促進禾谷孢囊線蟲的孵化[23]，說明Zn2+對不同種類孢囊線蟲卵孵化的影響不同。

本研究表明，在10～18 ℃時，初孵J2存活率在60%以上，30 ℃下J2 全部死亡，而高溫型的旱稻孢囊線蟲在30 ℃時存活率為69.3%[11]。這表明低溫環(huán)境更適宜微孔草孢囊線蟲。微孔草孢囊線蟲在15 ℃時，離體J2 死亡率低、幼蟲較活躍，適宜侵染。而旱稻孢囊線蟲甘肅群體、旱稻孢囊線蟲湖南群體分別在25 ℃[9]、30 ℃[11]時活動能力較強，有利于侵染作物。

孢囊線蟲生活史的長短取決于線蟲種類、寄主和環(huán)境條的影響，典型的孢囊線蟲完成一個生活史約30 d[5]。本研究中，15 ℃下微孔草孢囊線蟲完成生活史需27 d。與大豆孢囊線蟲20 ℃下需31 d[5]、甜菜孢囊線蟲環(huán)境適宜時需30 d[24]相比，微孔草孢囊線蟲生活史較短，但比旱稻孢囊線蟲30 ℃下需22 d[25]、玉米孢囊線蟲36 ℃下只需15～18 d[26]生活史略長。研究表明，許多作物孢囊線蟲可寄生于多種田間雜草，使其種群密度增大，從而對作物造成更大危害[27]，如禾谷孢囊線蟲雜草寄主有禾本科節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii)、鬼蠟燭(Phleum paniculatum)[28]、野燕麥(Avena fatura)、黑麥草(Lolium perenne)、鵝觀草(Roegneria kanoji)、葦狀羊茅(Festuca elatiorvar.arundinucea)、球莖草蘆(Phalaris tuberosa)、鴨茅(Dactylis glomerata)[29]和 醉 馬 草(Achnatherum inebrians)[30]，及嵩草(Kobresia humilis)等莎草科植物[31]。大豆孢囊線蟲雜草寄主有小野芝麻(Galeobdolon chinense)、寶蓋草(Lamium amplexicauie)、敗醬草(Thlaspi arvense)、薺菜(Capsella bursa-pastoris)[27]、繁縷(Stellaria media)、虎尾草(Chloris virgata)和毛茛(Ranunculus japonicus)等冬季闊葉性雜草[32]。在甘肅天祝地區(qū)，微孔草在農(nóng)作物大田中生長較普遍，因此，在田間微孔草孢囊線蟲是否危害栽培的農(nóng)作物，還有待進一步調(diào)查。