抗菌肽對異育銀鯽生長、免疫和抗氧化性能的影響

■ 郭益紅 趙宇凡 范 勇 朱文婷 趙永志 宣雄智 李文嘉

（1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008；2.張家港市大新鎮(zhèn)農(nóng)技推廣服務(wù)中心，江蘇張家港 215636；3.廣東海納川生物科技有限公司，廣東佛山 528515；4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，河南鄭州 450002）

異育銀鯽具有食性廣、生長速度快、抗病力強等眾多優(yōu)點，且肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，經(jīng)濟效益好，在我國淡水養(yǎng)殖中占據(jù)著十分重要的位置[1]。尤其是新品種“中科5 號”，飼料轉(zhuǎn)化率高、耐低氧、成活率高等特點更加明顯。但是隨著高密度、集約化養(yǎng)殖模式的推廣導(dǎo)致異育銀鯽病害問題嚴(yán)重，在各種細(xì)菌性疾病方面尤為突出，養(yǎng)殖戶為減少經(jīng)濟損失，擅自盲目過度使用抗生素致使魚體藥物殘留超標(biāo)，大量未被魚體吸收的抗生素（約80%）隨著魚體排泄物將進(jìn)入水體或沉降聚集于底泥，導(dǎo)致抗生素耐藥性在環(huán)境中傳播擴散[2]。魚藥和飼料添加劑等投入品的不規(guī)范使用已成為異育銀鯽質(zhì)量安全風(fēng)險的主要來源之一，開發(fā)安全有效、無污染的抗生素替代產(chǎn)品受到業(yè)內(nèi)學(xué)者和主產(chǎn)區(qū)漁業(yè)行政主管部門的高度關(guān)注。

抗菌肽是由20～60 個氨基酸殘基組成的堿性多肽，廣泛存在于大自然中，具有無殘留、廣譜抗菌、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，天然抗菌肽或人工合成抗菌肽具有替代抗生素的可行性[3]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，抗菌肽的研究主要集中于肉食性魚類，如石斑魚[4-5]、紅姑魚[6]等，在植食性魚類異育銀鯽中的應(yīng)用效果和適宜用量尚不明確。試驗以異育銀鯽為研究對象，從生長性能、消化吸收能力、免疫和抗氧化性能等多個方面評估抗菌肽對異育銀鯽生長、生理的影響，為抗菌肽在異育銀鯽養(yǎng)殖生產(chǎn)中的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗材料

試驗用異育銀鯽購自湖州菱湖水產(chǎn)苗種場，抗菌肽（柞蠶代謝物抗菌肽，活性單位20 000 U/g，分子量約為4 kD，商品名“富利泰”）購自廣東海納川生物科技股份有限公司，飼料原料購自淮安正昌飼料有限公司。

1.2 飼料配方設(shè)計

以魚粉、豆粕、菜粕等為主要飼料原料，以抗菌肽作為飼料添加劑，所有原料經(jīng)粉碎后過60 目篩，微量組分采用逐級擴大混勻法加入，與水混勻后用制粒機（HKj200 章丘市華祥顆粒機械有限公司）制成直徑為1.5 mm 的顆粒飼料，室溫風(fēng)干，用包裝袋密封后放入-20 ℃冰箱備用，基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平如表1所示。試驗設(shè)計共分5 組，分別為不含抗菌肽的對照組（CK 組）、添加50 mg/kg（D1 組）、75 mg/kg（D2 組）、100 mg/kg（D3 組）和125 mg/kg（D4 組）抗菌肽的試驗組。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗于2021年5月—7月在興化宏偉特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場完成，試驗共56 d。選取健康且規(guī)格一致的異育銀鯽幼魚375 尾[平均初始體重（9.40±0.2） g]用對照組飼料在池塘網(wǎng)箱內(nèi)暫養(yǎng)馴化14 d。試驗開始前，幼魚禁食24 h，用40 mg/L 的丁香酚麻醉后稱重，并放入長方形養(yǎng)殖水箱（400 L），每個試驗組3 個平行，每個平行1 個水箱，25 尾。適量連續(xù)充氣，使水體溶解氧≥4 mg/L，試驗用水為經(jīng)充分曝氣48 h 的自來水，試驗期間每天監(jiān)測，水溫為21～25 ℃，pH 7.1～7.5，氨氮≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽≤0.2 mg/L，每天采用連續(xù)性飽食投喂2 次（08：30、16：30），以試驗魚不再搶食為準(zhǔn)，投喂結(jié)束后1.5 h 用虹吸法清除水箱底部殘餌與糞便，監(jiān)測水質(zhì)，保持養(yǎng)殖水深和水質(zhì)穩(wěn)定，記錄投飼量，飼養(yǎng)周期為56 d。

1.4 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，試驗魚禁食24 h，用40 mg/L丁香酚麻醉后將試驗魚全部撈出，計數(shù)并逐尾稱重。每個養(yǎng)殖水箱隨機挑取6 尾，其中3 尾稱重后搗碎并混合、烘干（105 ℃），然后放入-20 ℃冰箱中用于分析全魚成分。其余的魚用注射器從尾靜脈采血，低溫離心（2 000 r/min，10 min，4 ℃）分離取上層血清。收集到的血清按平行混合后分裝于0.5 ml 離心管，置于超低溫冰箱（-80 ℃）保存?zhèn)溆?。將上述抽完血的試驗魚分離肝臟、前腸，分別稱內(nèi)臟團和肝臟重量，用于分析形態(tài)學(xué)指標(biāo)，去魚皮分離背部側(cè)線以上肌肉，所取各組織樣品裝袋后經(jīng)液氮速凍保存于-80 ℃中用于試驗后期測定各種相關(guān)酶活。

1.5 指標(biāo)測定

飼料和全魚樣品的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、水分含量，背肌的粗蛋白、粗脂肪、水分含量，肝臟的粗脂肪和水分含量均按國標(biāo)方法測定。全魚和飼料蛋白質(zhì)成分通過凱氏定氮儀（SKD-1000，上海沛歐分析儀器有限公司）測定，粗脂肪用索氏抽提法；灰分使用馬弗爐（80-10TP，上?；厶﹥x器制造有限公司）在550 ℃下烘6 h 測定；水分使用烘箱（GZX-9030MBE，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）105 ℃過夜測定；肝臟總抗氧化力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA），前腸胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，血清溶菌酶（LZM）、總蛋白（TP）的測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。

計算試驗魚的增重率、飼料轉(zhuǎn)化率、攝食率、成活率指標(biāo)。

式中：Wt——試驗結(jié)束時魚體重（g）；

W0——試驗初始魚體重（g）；

t——試驗時間（d）；

Wd——死亡魚體重（g）；

I——飼料總投喂量（g）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22 和Excel 2016 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析法（one-way ANOVA，LSD），用Duncan’s 多重比較法檢驗差異顯著性，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”來表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽添加量對異育銀鯽生長和飼料利用的影響

由表2 可知，抗菌肽添加量對異育銀鯽增重率、攝食率和飼料利用率均無顯著影響（P＞0.05）。

表2 異育銀鯽的生長、飼料利用率及存活狀況（n=3）

2.2 抗菌肽添加量對異育銀鯽體組成的影響

由表3 可知，抗菌肽添加量對異育銀鯽全魚各成分含量無顯著影響（P＞0.05），隨著抗菌肽添加量的增加，背肌粗脂肪含量呈下降趨勢，與CK 組相比，D4組異育銀鯽背肌和肝臟粗脂肪含量均顯著下降（P＜0.05）。

表3 異育銀鯽的全魚、背肌和肝臟成分（濕重，n=3，%）

2.3 抗菌肽添加量對異育銀鯽消化吸收酶活性的影響

由表4 可知，抗菌肽添加量均可使異育銀鯽前腸胰蛋白酶活性有所提高，與CK 組相比，D2 組異育銀鯽該酶活性顯著升高（P＜0.05）。

表4 異育銀鯽前腸消化酶活性（n=3）

2.4 抗菌肽添加量對異育銀鯽抗氧化相關(guān)酶活性的影響

由表5 可知，與CK 組相比，D2、D3 組異育銀鯽肝臟SOD 活性和T-AOC 顯著升高（P＜0.05），D4 組異育銀鯽肝臟CAT 活性顯著下降（P＜0.05）；不同添加量的抗菌肽均可降低肝臟MDA 含量，但差異并不顯著（P＞0.05）。

表5 異育銀鯽肝臟抗氧化酶活性及丙二醛含量（n=3）

2.5 抗菌肽添加量對異育銀鯽血清免疫指標(biāo)的影響

由表6 可知，與CK 組相比，不同添加量的抗菌肽均可降低異育銀鯽血清TP 含量，但差異不顯著（P＞0.05）；與CK 組相比，D2、D3 組異育銀鯽血清LZM 活性顯著升高（P＜0.05）。

表6 異育銀鯽的血清指標(biāo)（n=3）

3 討論

3.1 抗菌肽添加量對異育銀鯽生長和飼料利用的影響

多數(shù)研究表明，在飼料中添加適當(dāng)濃度的抗菌肽可提高養(yǎng)殖動物的生長性能和飼料利用率[4-10]。本試驗條件下，不同的抗菌肽添加量對異育銀鯽增重率和飼料利用率均無顯著影響，可能是由于飼料中抗菌肽添加量占比較低，所以對異育銀鯽生長影響細(xì)微，同時也表明抗菌肽作為飼料添加劑對水產(chǎn)動物生長性能的影響可能與水產(chǎn)動物的種類、生長發(fā)育狀況、抗菌肽的使用劑量、養(yǎng)殖環(huán)境等多種因素有關(guān)。

3.2 抗菌肽添加量對異育銀鯽體組成的影響

魚的肌肉成分組成受品種、飼料、養(yǎng)殖環(huán)境等多種因素的影響，其中飼料和生長環(huán)境是重要的影響因素。飼喂高蛋白飼料會使魚肌肉脂肪含量升高，而過多的脂肪沉積將使得魚肉產(chǎn)生“油膩感”，降低了魚肉的口感[8]。張莉等[6]研究表明加州鱸全魚粗脂肪含量會隨抗菌肽添加量的升高而下降，另有研究表明在飼料中添加Surfactin 抗菌肽能夠降低斜帶石斑魚全魚和肝臟的脂肪含量[12-13]。本試驗條件下，隨著抗菌肽添加量的升高，異育銀鯽背肌粗脂肪含量呈下降趨勢，當(dāng)添加量為125 mg/kg（D4組）時，異育銀鯽背肌和肝臟粗脂肪含量均顯著下降，可能是由于抗菌肽可以加強肌肉脂肪代謝，降低脂肪酸合成速度，減少養(yǎng)殖動物體脂沉積[11]，也有研究認(rèn)為抗菌肽降低肝臟粗脂肪的作用與其乳化作用有關(guān)[5]，值得注意的是，肌肉粗脂肪含量的下降有助于提高魚肉口感[12]。

3.3 抗菌肽添加量對異育銀鯽消化酶活性的影響

消化酶活性可以反映魚類的基本消化生理特征，常用于衡量魚類對飼料營養(yǎng)成分的消化吸收情況，消化酶活性升高有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用[13-15]。有研究表明，在飼料中添加抗菌肽可以提高吉富羅非魚[16]、斜帶石斑魚[5]腸道蛋白酶和脂肪酶的活性。本試驗條件下，不同的抗菌肽添加量均可使異育銀鯽前腸胰蛋白酶活性有所提高，且當(dāng)添加量為75 mg/kg 時，該酶活性顯著升高，這可能是由于抗菌肽能促進(jìn)異育銀鯽腸道發(fā)育，也有研究表明抗菌肽可能通過降低腸道條件致病菌的數(shù)量，增加了腸道益生菌群的營養(yǎng)物質(zhì)和生長空間來改善腸道微環(huán)境[17-18]，從而提升消化酶活性。

3.4 抗菌肽添加量對異育銀鯽抗氧化相關(guān)酶活性的影響

總抗氧化力是用于衡量機體抗氧化能力的綜合性指標(biāo)，組成魚體抗氧化系統(tǒng)的酶主要有超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶。超氧化物歧化酶能清除體內(nèi)超氧陰離子自由基，過氧化氫酶可以將超氧化物歧化酶催化活性氧自由基所產(chǎn)生的H2O2轉(zhuǎn)化為水和氧氣[19]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物的指標(biāo)，間接反映細(xì)胞受氧化損傷的程度[9]，有研究表明飼料中添加0.015%抗菌肽可以提高錦鯉血清溶菌酶和過氧化氫酶的活性[20]，增強鯉魚補體旁路途徑活性［21］，添加0.015%和0.02%的天蠶素抗菌肽可以提高湘云鯽血清過氧化氫酶活性，降低丙二醛的含量[7]。還有研究表明同一蛋白水平下增加抗菌肽可以降低赤點石斑魚肝臟丙二醛含量，增加肝臟過氧化物酶和過氧化氫酶的活性[4]。本試驗條件下，與CK組相比，在飼料中添加75 mg/kg 和100 mg/kg 的抗菌肽可以顯著提高異育銀鯽肝臟超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力，降低肝臟丙二醛含量，表明抗菌肽可以誘導(dǎo)異育銀鯽抗氧化系統(tǒng)的激活，提高機體抗氧化能力，降低腸道內(nèi)的自由基水平，從而減輕腸道的氧化損傷?？咕奶岣唪~體抗氧化能力的機制可能是由于其具有抗菌作用，能抑制腸道病原菌的繁殖，減少內(nèi)毒素積累誘發(fā)的氧衍生為自由基，引起脂質(zhì)過氧化損傷[10]。

另有研究表明在吉富羅非魚飼料中添加50 mg/kg抗菌肽或在黃顙魚飼料中添加100 mg/kg 抗菌肽對肝臟或血清超氧化物歧化酶和血清溶菌酶活性有顯著的負(fù)面影響[22-23]，本試驗條件下，當(dāng)抗菌肽添加量為125 mg/kg 時，異育銀鯽肝臟超氧化物歧化酶活性有所下降，過氧化氫酶的活性則顯著下降，有研究表明在飼料中添加10 mg/kg 與30 mg/kg 抗菌肽能使黃顙魚血清過氧化氫酶活性提高約50%[23]，說明與超氧化物歧化酶相比，肝臟過氧化氫酶活性可能更易受抗菌肽劑量的影響，同時也說明高劑量的抗菌肽可能對魚抗氧化性能存在不利影響，具體機制有待進(jìn)一步研究。

3.5 抗菌肽添加量對異育銀鯽血清免疫指標(biāo)的影響

抗菌肽在體內(nèi)除了能直接殺死病原菌，更多的是作為免疫效應(yīng)因子來激活宿主的免疫防御系統(tǒng)，從而提升免疫功能來消除感染，保護(hù)宿主免受病原微生物的侵害[24]。魚類血清生化指標(biāo)能夠反映魚體的生理代謝和免疫狀況[15]。血清總蛋白主要包括白蛋白和球蛋白，是衡量體液免疫水平的重要指標(biāo)[25]。本試驗條件下，不同的抗菌肽添加量均降低了異育銀鯽血清總蛋白含量，具體機制有待進(jìn)一步研究。

溶菌酶常用來評估魚類非特異性免疫性能。溶菌酶是水產(chǎn)動物體內(nèi)的一種重要非特異性防御因子，可以催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁而導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡[25]。有研究表明抗菌肽可以被養(yǎng)殖動物血淋巴吸收，從而誘導(dǎo)溶菌酶和酸性磷酸酶活性的增加，進(jìn)而提高養(yǎng)殖動物的免疫力[26]。本試驗條件下，與對照組相比，當(dāng)抗菌肽的添加量為75 mg/kg和100 mg/kg時，異育銀鯽血清溶菌酶活性均顯著升高，表明抗菌肽能一定程度提高異育銀鯽的非特異性免疫能力，這與Surfactin 抗菌肽在斜帶石斑魚[9]、吉富羅非魚[27]的研究結(jié)果類似。

4 結(jié)論

本試驗條件下，在異育銀鯽飼料中添加抗菌肽可以降低魚體肌肉脂肪含量并提升魚體免疫和抗氧化性能，抗菌肽添加量為75 mg/kg 和100 mg/kg 時效果較佳。