屎腸球菌發(fā)酵玉米粉條件參數(shù)優(yōu)化

■ 楊 成 朱振宇 王明根 白天天 俄廣旭 盧 冬，2 郭雪峰，2*

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

玉米是畜牧業(yè)中廣泛使用的能量飼料之一，其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素E、維生素B1等物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機體神經(jīng)系統(tǒng)[1]、促進腸道的蠕動等功能[2]，可作為發(fā)酵飼料制作的碳源物質(zhì)[3]。微生物發(fā)酵可以改善飼料品質(zhì)[4-5]，能夠通過自身產(chǎn)生的酶將飼料中的大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，進而提高飼料利用率[6]。微生物發(fā)酵的關(guān)鍵在于菌種，菌種的特性決定了發(fā)酵飼料的效果[7]。乳酸菌是發(fā)酵飼料的主要菌種，通過發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，降低飼料pH，抑制腐敗微生物的生長，減少發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)水解和干物質(zhì)損失[8]。屎腸球菌是一種兼性厭氧革蘭氏陽性菌乳酸菌，屬于腸球菌屬，具有抑制病原菌、穩(wěn)定胃腸道正常菌群、維持微生態(tài)平衡、改善胃腸道功能、提高機體免疫力、提高食物消化率和生物效價，提高飼料中粗蛋白含量、降低飼料中中性洗滌纖維含量等功能[9-12]。乳酸菌發(fā)酵玉米粉是將玉米淀粉作為主要的碳源物質(zhì)，將玉米中的含氮物質(zhì)作為氮源[13]。目前，關(guān)于屎腸球菌在發(fā)酵飼料中的應(yīng)用鮮有報道，本研究以屎腸球菌F11.1G 為菌種，添加到玉米粉中進行發(fā)酵基礎(chǔ)液制備和發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化，旨在為益生菌發(fā)酵玉米產(chǎn)酸工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌F11.1G 為郭雪峰團隊自主分離鑒定，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(保藏號：M 2020793)。屎腸球菌培養(yǎng)使用Man，Rogasa and Sharpe(MRS)培養(yǎng)基，pH 為6.8，使用方法參考國標。玉米購買自新疆天康飼料有限公司。

1.2 試驗方法與設(shè)計

1.2.1 發(fā)酵母液的制備

錐形瓶中加入100 mL 純化水，后加入0.5 g 乳糖充分溶解，待乳糖溶解后在溶液中加入0.001 g 檸檬酸，用于調(diào)節(jié)溶液pH。將混勻后的溶液121 ℃高壓15 min，待溫度冷卻后將高壓完的溶液移入超凈工作臺，加入0.5 g屎腸球菌凍干粉，在恒溫培養(yǎng)箱37 ℃下發(fā)酵72 h，測得屎腸球菌活菌數(shù)為1×108CFU/mL，用于制作發(fā)酵玉米粉的屎腸球菌凍干粉菌活性達標[14]。

1.2.2 種子發(fā)酵液的制備

將上述制備好的發(fā)酵母液取50 mL 與950 mL 純化水制備成1 L 濃度為5%的發(fā)酵液，按此原理分別制備濃度為10%、15%、20%和25%的發(fā)酵液各1 L。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗設(shè)計

取15 個1 L 發(fā)酵罐分別裝300 g 玉米粉，料液比1∶1，調(diào)節(jié)種子發(fā)酵液的pH 為7.0，將接種量為5%、10%、15%、20%和25%的種子發(fā)酵液與玉米粉混合，攪拌均勻，密封后在恒溫培養(yǎng)箱30 ℃條件下發(fā)酵48 h，每個處理3 個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束測定發(fā)酵玉米粉中屎腸球菌菌活和pH。探究接種量對發(fā)酵玉米粉中屎腸球菌菌活和pH的影響。

取15 個1 L 發(fā)酵罐分別裝300 g 玉米粉，接種量為5%，調(diào)節(jié)種子發(fā)酵液的pH 為7.0，料水比分別為1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4，將發(fā)酵液與玉米粉混勻、密封后在恒溫培養(yǎng)箱30 ℃條件下發(fā)酵48 h，每個處理3 個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束測定發(fā)酵玉米粉中屎腸球菌活性和pH。探究料水比對發(fā)酵玉米粉中屎腸球菌活性和pH的影響。

取18 個1 L 發(fā)酵罐分別裝入300 g 玉米粉，接種量5%，料液比為1∶1，調(diào)節(jié)種子發(fā)酵液的pH 為7.0，將發(fā)酵液與玉米粉混勻、密封后在恒溫培養(yǎng)箱30 ℃條件下發(fā)酵，發(fā)酵時間分別為12、24、36、48、60、72 h，每個處理3 個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束測定發(fā)酵玉米粉中屎腸球菌活性和pH。探究發(fā)酵時間對發(fā)酵玉米粉中屎腸球菌活性和pH的影響。

取15 個1 L 發(fā)酵罐分別裝300 g 玉米粉，料液比1∶1，調(diào)節(jié)種子發(fā)酵液的pH為7.0，接種量為5%，將發(fā)酵液與玉米粉混勻、密封后在恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度分別為25、30、35、37、40 ℃，每個處理3個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后測定玉米粉的菌活和pH。探究溫度對屎腸球菌發(fā)酵玉米粉菌活和pH的影響。

1.3.2 屎腸球菌發(fā)酵玉米粉最佳條件參數(shù)試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇適宜接種量、料水比、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度4 個條件參數(shù)進行優(yōu)化，每個條件設(shè)計3 個水平，采用L9(34)正交表進行正交試驗。

1.3.3 測定指標和方法

發(fā)酵玉米粉中屎腸球菌活性的測定：平板涂布法[15]。

可溶性糖（WSC）的測定：采用硫酸-蒽酮比色法[16]。

pH 的測定：采用四分法稱取各處理組樣品25 g，加入225 mL 無菌超純水，4 ℃過夜浸泡，四層紗布過濾后用pH計測定樣品pH。

測定揮發(fā)性脂肪酸的測定：采用U1-timate 3000型高效液相色譜儀測定（賽默飛世爾上海儀器有限公司）；參考郁萬瑞等[17]方法測定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)3 次重復(fù)，結(jié)果以“平均值±標準差”來表示，試驗數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel、SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 屎腸球菌發(fā)酵玉米粉單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 接種量對屎腸球菌發(fā)酵玉米粉pH 和屎腸球菌活性的影響

如表1 所示，隨著發(fā)酵母液接種比例的增加，發(fā)酵玉米的pH 呈先上升后下降的趨勢。當接種量為5%時，pH 低（pH=4.03），接種量20%時pH 達到最高（pH=4.17）。菌活隨著接種量的比例增大呈上升趨勢。當接種量為25%時，菌活最高為9.93×109CFU/mL；接種量為10%時，菌活最低為5.80×109CFU/mL。本試驗中接種量5%與15%、20%，各組之間pH 差異顯著（P＜0.05）；接種量為20%與25%兩組之間差異顯著（P＜0.05）。各組接種比例的菌活呈上升趨勢，但差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 發(fā)酵母液接種量對屎腸球菌發(fā)酵玉米粉pH和屎腸球菌活性的影響

2.1.2 料水比對屎腸球菌發(fā)酵玉米粉pH和屎腸球菌活性的影響

如表2 所示，隨著接種料水比例的增加，發(fā)酵玉米的pH 呈先下降后上升的趨勢。當料水比為1∶1時，pH 最低（pH=3.60）；當料水比為1∶0.6 時，pH 最高（pH=4.04），顯著高于其余4 組。屎腸球菌活性隨著料水比的增加呈上升趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。當料水比為1：1.4 時菌活達到最高，為2.32×109CFU/mL，當料水比為1∶0.6 時菌活最低為1.08×109CFU/mL。

表2 料水比對屎腸球菌發(fā)酵玉米粉pH和屎腸球菌活性的影響

2.1.3 發(fā)酵時間對屎腸球菌發(fā)酵玉米粉pH 和屎腸球菌活性的影響

如表3 所示，隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵玉米粉的pH 呈下降的趨勢。當發(fā)酵時間為12 h 時發(fā)酵飼料pH 最高（pH=6.04），顯著高于其余各組（P＜0.05），發(fā)酵時間為72 h 時，pH 最低（pH=3.39）。屎腸球菌活性隨著發(fā)酵時間的延長呈先上升后下降的趨勢，但各組屎腸球菌菌活差異均不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵時間為48 h 時，菌活最高為4.00×109CFU/mL；發(fā)酵時間為12 h時，菌活最低為0.31×109CFU/mL。

表3 發(fā)酵時間對屎腸球菌發(fā)酵玉米粉pH和屎腸球菌活性的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度對屎腸球菌發(fā)酵玉米粉pH 和屎腸球菌活性的影響

如表4 所示，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵玉米粉的pH 呈緩慢下降再上升的趨勢；發(fā)酵溫度為37 ℃時，發(fā)酵玉米粉的pH 最低（pH=3.33），發(fā)酵溫度為35 ℃時，發(fā)酵玉米粉pH 最高（pH=3.51）。發(fā)酵溫度為37 ℃時，pH 顯著低于25 ℃和35 ℃（P＜0.05），和其余組差異不顯著。屎腸球菌活性隨著發(fā)酵溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵溫度為30 ℃時，菌活最高為6.84×109CFU/mL，發(fā)酵溫度為25 ℃時，菌活最低為3.96×109CFU/mL。

2.2 屎腸球菌發(fā)酵玉米粉產(chǎn)酸的正交試驗結(jié)果及分析

通過單因素確定的各因素發(fā)酵條件，發(fā)酵過程中各因素之間可能存在交互作用。為進一步研究各因素對屎腸球菌發(fā)酵玉米產(chǎn)酸的影響，采用L9(34)正交試驗設(shè)計對發(fā)酵參數(shù)進行優(yōu)化，正交試驗設(shè)計見表5。

表5 屎腸球菌發(fā)酵玉米粉正交試驗因素水平

2.2.1 不同發(fā)酵因子對發(fā)酵玉米粉菌活的影響

L9(34)正交試驗分析結(jié)果見表6～表12，R值越大，該因素對試驗結(jié)果影響越大。表6 中屎腸球菌發(fā)酵玉米粉中各因素影響菌活順序為：發(fā)酵時間（C）＞接種量（A）＞料水比（B）＞發(fā)酵溫度（D）。發(fā)酵時間是主要影響因素，其次是接種量和料水比，發(fā)酵溫度對玉米發(fā)酵過程中菌活性的影響最小?；谝陨戏治龃_定在發(fā)酵玉米粉的過程中影響菌活性的發(fā)酵條件參數(shù)為：A2（15%）B1（1：0.8）C1（24 h）D1（30 ℃）/A2（15%）B3（1：1.4）C1（24 h）D1（30 ℃），即接種量：15%，料水比：1：0.8，發(fā)酵時間：24 h，發(fā)酵溫度：30 ℃；或接種量：15%，料水比：1∶1.4，發(fā)酵時間：24 h，發(fā)酵溫度：30 ℃。該條件下適合屎腸球菌生長。

表6 不同發(fā)酵因子對菌活性的影響

2.2.2 不同發(fā)酵因子對發(fā)酵玉米粉可溶性糖的影響

表7 中屎腸球菌發(fā)酵玉米粉中各因素影響可溶性糖含量的順序為：接種量（A）＞發(fā)酵時間（C）＞發(fā)酵溫度（D）＞料水比（B）。發(fā)酵過程中影響可溶性糖的主要影響因素是接種量，料水比的影響最小?；谏鲜鼋Y(jié)果確定發(fā)酵玉米粉過程中影響可溶性糖含量的發(fā)酵條件參數(shù)為：A1（5%）B2（1∶1.2）C1（24 h）D3（40 ℃），即接種量：5%，料水比：1∶1.2，發(fā)酵時間：24 h，發(fā)酵溫度：40 ℃。在此條件下可溶性糖的含量較低。

表7 不同發(fā)酵因子對可溶性糖的影響

2.2.3 不同發(fā)酵因子對發(fā)酵玉米粉pH的影響

表8 中屎腸球菌發(fā)酵玉米粉中各因素影響pH 的順序為：發(fā)酵時間（C）＞料水比（B）＞發(fā)酵溫度（D）＞接種量（A）。發(fā)酵過程中影響pH 的主要影響因素是發(fā)酵時間，其次是料水比和發(fā)酵溫度，接種量對玉米發(fā)酵過程中對pH 的影響最小?；谝陨辖Y(jié)果確定發(fā)酵玉米粉的過程中影響pH 的發(fā)酵條件參數(shù)為：A3（25%）B3（1∶1.4）C3（72 h）D2（37 ℃），即接種量：25%，料水比：1∶1.4，發(fā)酵時間：72 h，發(fā)酵溫度：37 ℃。在此條件下pH較低。

表8 不同發(fā)酵因子對pH的影響

2.2.4 不同發(fā)酵因子對發(fā)酵玉米粉乳酸的影響

表9 中屎腸球菌發(fā)酵玉米粉中各因素影響乳酸含量的順序為：發(fā)酵時間（C）＞接種量（A）＞料水比（B）＞發(fā)酵溫度（D）。發(fā)酵過程中影響乙酸含量的主要影響因素是發(fā)酵時間，其次是發(fā)接種量和料水比，溫度對玉米發(fā)酵過程中乳酸影響最小。基于以上結(jié)果確定在發(fā)酵玉米粉過程中影響乳酸的發(fā)酵條件參數(shù)為：A3（25%）B3（1∶1.4）C2（48 h）D2（37 ℃），即接種量：25%，料水比：1∶1.4，發(fā)酵時間：48 h，發(fā)酵溫度：37 ℃。在此條件下乳酸含量較高。

表9 不同發(fā)酵因子對乳酸的影響

2.2.5 不同發(fā)酵因子對發(fā)酵玉米粉乙酸的影響

表10 中屎腸球菌發(fā)酵玉米中各因素影響乙酸含量順序為：發(fā)酵時間（C）＞接種量（A）＞發(fā)酵溫度（D）＞料水比（B）。發(fā)酵過程中影響乙酸含量主要影響因素是發(fā)酵時間，其次是接種量和溫度，料水比對發(fā)酵過程中乙酸含量影響最小?；谝陨辖Y(jié)果確定在發(fā)酵玉米粉的過程中影響乙酸的發(fā)酵條件參數(shù)為：A3（25%）B1（1∶0.8）C1（24 h）D1（30 ℃），即接種量：25%，料水比：1∶0.8，發(fā)酵時間：24 h，發(fā)酵溫度：30 ℃。在此條件下乙酸含量較高。

表10 不同發(fā)酵因子對乙酸的影響

2.2.6 不同發(fā)酵因子對發(fā)酵玉米粉丙酸的影響

表11 中屎腸球菌發(fā)酵玉米粉中各因素影響丙酸含量的順序為：發(fā)酵時間（C）＞料水比（B）＞接種量（A）＞發(fā)酵溫度（D）。發(fā)酵過程中影響丙酸含量的主要影響因素是發(fā)酵時間，其次是料水比和接種量，發(fā)酵溫度對玉米發(fā)酵過程中丙酸的影響最小。基于以上結(jié)果確定在發(fā)酵玉米粉過程中影響丙酸的發(fā)酵條件參數(shù)為：A3（25%）B3（1∶1.4）C2（48 h）D2（37 ℃），即接種量：25%，料水比：1∶1.4，發(fā)酵時間：48 h，發(fā)酵溫度：37 ℃。在此條件下丙酸含量較低。

表11 不同發(fā)酵因子對丙酸的影響

2.2.7 不同發(fā)酵因子對發(fā)酵玉米粉丁酸的影響

表12 中屎腸球菌發(fā)酵玉米中各因素影響丁酸含量順序為：發(fā)酵時間（C）＞發(fā)酵溫度（D）＞料水比（B）＞接種量（A）。發(fā)酵過程中影響丁酸含量的主要影響因素是發(fā)酵時間，其次是發(fā)酵溫度和料水比，接種量對玉米發(fā)酵過程中丁酸的影響最小?；谝陨辖Y(jié)果確定在發(fā)酵玉米粉的過程中影響丁酸的發(fā)酵條件參數(shù)為：A3（25%）B1（1∶0.8）C1（24 h）D1（30 ℃），即接種量：25%，料水比：1∶0.8，發(fā)酵時間：24 h，發(fā)酵溫度：30 ℃。在此條件下丁酸的含量較低。

表12 不同發(fā)酵因子對丁酸的影響

2.2.8 各因素主次順序

表13 中篩選本試驗最優(yōu)參數(shù)時，根據(jù)正交試驗設(shè)計原則需對各因素進行分析。因素A：從主次順序表中和初選最優(yōu)水平中可知，A對可溶性糖的影響排在第一位，屎腸球菌活性、乳酸和乙酸的影響排在第二位，屬主要因素；丙酸的影響排在第三位，屬次要因素。所以所選水平應(yīng)以主要因素的指標來考慮?？扇苄蕴窃贏1水平時效果最好，菌活在A2水平時最好，乳酸、乙酸、丙酸和丁酸在A3水平時效果最好，但在A1水平時其余指標與A3水平時相差不大，故A應(yīng)取A3。因素B：從主次順序表中可見，菌活性、乳酸和丁酸均排在第三位，乙酸排在第四位，屬次要因素。pH的影響排在第二位，可溶性糖的影響排在第四位，所以，應(yīng)以pH 這一指標來考慮。從初選最優(yōu)水平組合中可知，對pH 選B3為好，故B應(yīng)取B3。因素C：從主次順序表中和初選最優(yōu)水平中可知，C對7 個指標影響排在第一位，屬主要因素，菌活性、可溶性糖、乳酸、乙酸和丁酸等指標在C1時最好，乙酸和丙酸在C2時效果最好，但在C2水平時其余指標與C1水平時相差不大，同理菌活和pH 應(yīng)選擇C1，故C 應(yīng)取C1。因素D：對丁酸的影響排在第二位，pH 和可溶性糖的影響排在第三位次要因素，乙酸排在第三位，其余指標排在第四位屬。對丁酸而言，選D1較好，故D應(yīng)選D1。

表13 屎腸球菌發(fā)酵玉米產(chǎn)酸各因素主次順序表

2.2.9 驗證試驗

通過屎腸球菌發(fā)酵玉米粉的條件參數(shù)優(yōu)化，得出結(jié)論屎腸球菌為發(fā)酵玉米粉最佳條件為A3B3C1D1：接種量為25%、料水比為1∶1.4、發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度30 ℃。將試驗所得到的最佳條件參數(shù)進行驗證。試驗結(jié)果表14 所示：發(fā)酵之后屎腸球菌活性為2.61×109CFU/mL，發(fā)酵飼料可溶性糖含量12.37 mg/g，pH 為3.39，乳酸的含量為201.41 μg/mL，乙酸的含量為82.59 μg/mL，發(fā)酵飼料中未檢測到丙酸和丁酸。符合最優(yōu)發(fā)酵條件，既在此條件下發(fā)酵效果較好。

3 討論

3.1 不同發(fā)酵因子對發(fā)酵玉米粉菌活性和pH的影響

研究表明在發(fā)酵過程中，接種量會影響發(fā)酵進程的快慢。陳智遠等[18]報道發(fā)酵醋渣過程中加大接種量(秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣3 個月以上的活性污泥)能夠快速啟動厭氧發(fā)酵、減短發(fā)酵周期。本試驗中菌種接種量增加，使發(fā)酵玉米中的屎腸球菌活性增加，進而縮短發(fā)酵所需時間。發(fā)酵過程中屎腸球菌菌株利用玉米中可溶性碳水化合物充分繁殖，迅速成為優(yōu)勢菌群，菌群數(shù)量擴大，雜菌繁殖受到抑制。隨著發(fā)酵進行，發(fā)酵底物中的乳糖被屎腸球菌轉(zhuǎn)化成葡萄糖和半乳糖，進而轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岬刃》肿踊衔颷19]，發(fā)酵玉米粉的pH 降低，發(fā)酵過程中相關(guān)酶產(chǎn)生受到抑制[20]，隨著發(fā)酵底物的消耗，發(fā)酵過程中相關(guān)反應(yīng)逐漸減慢直至停止。在本試驗中，菌活性隨著接種量的增大而增大，發(fā)酵玉米的pH 呈先上升后下降的趨勢，pH 為4.03～4.17；發(fā)酵玉米粉中屎腸球菌活性呈逐漸上升的趨勢。屎腸球菌F11.1G 在pH 4.0～7.0 時均可以正常增殖，雖然接種量對pH 有影響，但不影響屎腸球菌的正常增殖，雖然屎腸球菌活性呈逐漸上升的趨勢，但差異均不顯著，考慮發(fā)酵成本因素，選取5%、15%、25%三個接種量進行比較。

發(fā)酵過程中微生物以及其產(chǎn)生的酶對于發(fā)酵環(huán)境的氧氣濃度非常敏感。發(fā)酵過程中料水比決定的是發(fā)酵過程中氧氣濃度。在本試驗中菌活性隨著料水比的增加而增加，料水比≤1∶1 的3 組試驗中菌活性呈上升趨勢。屎腸球菌為兼性厭氧菌，氧濃度氣過高會影響到菌體的繁殖；氧氣濃度過低會導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境pH 降低[21]，影 響 其 活 性。在pH 為4.04 和pH 為3.60 時菌活均未達到最高，表明屎腸球菌的增殖已受到發(fā)酵環(huán)境pH 的影響。相關(guān)研究表明屎腸球菌在pH在4.0～7.5的環(huán)境中均可正常增殖，在過酸的條件下雖然有活性[22]，但活性受到影響，如徐樹琴[23]研究發(fā)現(xiàn)藏羊源屎腸球菌在pH 為2.0 的培養(yǎng)16 h 后，菌活性為3.4×102CFU/mL，在pH 為3.0 培養(yǎng)4 h，菌活性為9.5×106CFU/mL。王曉蕊[24]試驗結(jié)果表明，屎腸球菌在pH 為2.5 和3.0 的模擬胃液環(huán)境中存活率分別達44.10%和86.35%，在模擬腸液中的存活率達87.72%。袁鈺等[25]研究發(fā)現(xiàn)豆汁源屎腸球菌DZ 在人工胃液（pH=3.0）中至少耐受3 h。綜上屎腸球菌具有較強的耐酸性，在pH為4.0～7.5的環(huán)境中均可正常增殖。

發(fā)酵過程中屎腸球菌隨著發(fā)酵時間的延長大量繁殖，會消耗玉米中的糖原物質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)化成乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵過程中飼料的pH逐漸降低，當發(fā)酵12 h時，菌活性為最低（0.31×109CFU/mL），發(fā)酵飼料pH 接近中性，推測玉米粉處于發(fā)酵初期。發(fā)酵時間在60～72 h時，發(fā)酵飼料的pH最低，菌活性下降，表明在60～72 h時發(fā)酵已接近尾聲，此時屎腸球菌活性為3.28×109CFU/mL。說明發(fā)酵過程隨著益生菌所需的養(yǎng)分逐漸枯竭，菌體有害代謝產(chǎn)物的累積，其毒性對菌體生長代謝產(chǎn)生反抑制作用[21]。

溫度是發(fā)酵過程中影響菌活的因素之一，溫度直接決定了益生菌的活性。在本試驗中溫度為25～40 ℃時菌活性均較高，說明此溫度范圍適宜屎腸球菌繁殖，溫度在30～37 ℃時最適屎腸球菌的繁殖。Junfeng[26]從西藏牦牛（Bos grunniens）瘤胃中分離出的兩株具有纖維素分解潛能的細菌，菌株被鑒定為屎腸球菌腸球（JF85）和屎腸球菌(Y83)分離物，分別在15～55 ℃時生長良好。綜上，不同菌種最適繁殖溫度不同，在制作發(fā)酵的過程中需要適宜發(fā)酵溫度來促進發(fā)酵反應(yīng)的進行。

3.2 不同發(fā)酵因子對正交試驗結(jié)果的影響

3.2.1 不同發(fā)酵因子對可溶性糖的影響

隨著發(fā)酵進行，屎腸球菌會大量繁殖，在此過程中會消耗玉米中的糖類物質(zhì)（包括絕大部分單糖和寡糖轉(zhuǎn)化成的葡萄糖和半乳糖）。任海偉等[27]試驗結(jié)果表明，甜高粱青貯中WSC 含量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸降低，本試驗結(jié)果與其一致。朱敏[28]試驗結(jié)果表明，硫磺菌菌絲固態(tài)發(fā)酵燕麥，隨發(fā)酵時間的延長總糖含量逐漸降低。在本試驗中影響可溶性糖含量的因素中應(yīng)選取相對較低水平。

3.2.2 不同發(fā)酵因子對pH的影響

pH 是衡量發(fā)酵飼料品質(zhì)的重要指標。在本試驗中發(fā)酵飼料的pH 為3.07～3.61。曹晶晶[29]研究表明乳酸菌甘薯淀粉漿液pH 從6.62 下降到3.67～3.88，其結(jié)果與本試驗相符。韓翠萍等[30]報道植物乳桿菌發(fā)酵發(fā)酵玉米粉0～72 h，pH 從5.34 降至3.36，與本試驗結(jié)果相似。發(fā)酵是一個產(chǎn)酸的過程，隨著時間延長，飼料pH 呈逐漸下降的趨勢。本試驗中發(fā)酵玉米粉pH降低說明飼料中的屎腸球菌可利用玉米粉中的營養(yǎng)物質(zhì)，并且產(chǎn)生酸性物質(zhì)。較低的pH 能抑制飼料中有害微生物的活動從而更利于飼料的保存。在本試驗中隨著發(fā)酵的進行飼料pH 呈下降趨勢，與上述試驗結(jié)果相符合。

3.2.3 不同發(fā)酵因子對揮發(fā)性脂肪酸的影響

玉米粉發(fā)酵過程中玉米中的部分脂肪可被其發(fā)酵降解，增加揮發(fā)性脂肪酸含量。張偉彬[31]報道以復(fù)合酒曲（采用力克甜米酒曲、安琪甜酒曲、通風曲）發(fā)酵燕麥制作甜醅，隨著發(fā)酵的甜醅中總酸含量增加。本試驗中乳酸的含量最高，推測屎腸球菌屬乳酸菌，會將玉米中的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成葡萄糖和半乳糖，然后轉(zhuǎn)變成乳酸，隨著發(fā)酵的進行乳酸含量呈現(xiàn)富集的現(xiàn)象。在本試驗中隨著發(fā)酵的進行飼料中有機酸的含量主要是乳酸和乙酸。史曉萌等[32]報道甜酒曲發(fā)酵燕麥產(chǎn)生的有機酸主要是乳酸和乙酸，與本試驗結(jié)果相似。李斌等[33]報道在小麥、青稞和油菜黃貯時添加纖維素分解菌可以提高乙酸含量。飼料中丙酸、丁酸含量過高會影響飼料的適口性，從而影響動物的采食量。丁酸是經(jīng)腐敗菌等有害微生物分解蛋白質(zhì)、葡萄糖和乳酸后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其含量越低發(fā)酵飼料品質(zhì)越好。丁亞偉等[34]報道復(fù)合益生菌（乳酸桿菌RSG-1、枯草芽孢桿菌B-1和地衣芽孢桿菌）發(fā)酵玉米-豆粕型飼料可降低丁酸含量。品質(zhì)較好的發(fā)酵飼料中乳酸和乙酸含量應(yīng)較高，丙酸和丁酸含量較低。本試驗中丁酸雖有檢出，但含量最低，符合發(fā)酵飼料品質(zhì)要求。

4 結(jié)論

本試驗獲得屎腸球菌發(fā)酵玉米粉的最佳條件參數(shù)：接種量25%、料水比1∶1.4、發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度30 ℃，在此下發(fā)酵條件下屎腸球菌發(fā)酵玉米粉的產(chǎn)酸效果較好。