補肺清肝化瘀方對急性放射性肺炎大鼠巨噬細(xì)胞自噬活化的影響*

王 佩 許文婧 馬理海 張 浩 孟令占

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

目前，放射治療是治療胸部腫瘤的主要方法之一，但放療后急性放射性肺炎（ARP）的發(fā)病率高達(dá)5%～20%［1］。ARP 患者會出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難、咳嗽等癥狀，甚至死亡［2］。強大的電離輻射穿過肺組織時，可直接導(dǎo)致DNA 雙鏈斷裂，細(xì)胞死亡，最終引發(fā)患者的免疫反應(yīng)［3］。巨噬細(xì)胞通過M1和M2極化參與宿主的免疫應(yīng)答，其中M1 極化放大炎癥免疫應(yīng)答，而M2 極化減輕炎癥免疫應(yīng)答［4］。氧化應(yīng)激也在ARP的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［5］。因此，平衡M1/M2 極化和氧化應(yīng)激來控制ARP的發(fā)展是非常有必要的。

ARP治療常用的預(yù)防性藥物是兩性霉素等細(xì)胞保護(hù)劑，可減弱放療對正常肺組織的細(xì)胞毒害作用［6］；常用的治療藥物是皮質(zhì)類固醇，輔以抗生素預(yù)防繼發(fā)感染［7］。然而，皮質(zhì)類固醇藥物治療可能產(chǎn)生一些副作用，如高血壓、脂肪重排和骨質(zhì)疏松癥。補肺清肝化瘀方是重慶市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由16 種中藥組成，具有抗炎、抗氧化作用。補肺清肝化瘀方在臨床上用于ARP治療已取得顯著療效［8］，但其分子機制尚不清楚。本研究擬通過X 射線照射誘導(dǎo)建立ARP 大鼠模型，觀察補肺清肝化瘀方對ARP 大鼠氧化應(yīng)激和自噬的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18 只SPF 級健康成熟7～8 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自四川成都達(dá)碩生物有限公司，動物使用許可證號：SYXK（川）2019-189，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2019-031。所有實驗程序均經(jīng)重慶市中醫(yī)院倫理委員會（倫理審查編號：2020-DWSY-WP）批準(zhǔn)，并參照《實驗動物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行。

1.2 藥物

補肺清肝化瘀方，組方：太子參30 g，麥冬15 g，百合15 g，地龍10 g，桃仁10 g，紅花10 g，赤芍12 g，川芎12 g，青黛3 g，杏仁12 g，莪術(shù)12 g，當(dāng)歸15 g，夏枯草15 g，浙貝母15 g，地骨皮15 g，桑白皮15 g。藥材購自河北嘉恒冷背藥業(yè)有限公司，經(jīng)重慶市中醫(yī)院王懷碧教授鑒定為正品。水煎取汁200 mL，真空分裝。根據(jù)人-動物體表面積換算公式確定給藥劑量。

1.3 試劑與儀器

蘇木素伊紅染色試劑盒（貨號C0105S）、RIPA 裂解液（貨號P0013B）、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0006）、BeyoECL Plus 試劑盒（貨號P0018S）、Rat IL-1β ELISA Kit（貨號PI303）、Rat IL-6 ELISA Kit（貨號PI328）、Rat IL-10 ELISA Kit（貨號PI525）、Rat TNFα ELISA Kit（貨號PT516）、Rat IL-4 ELISA Kit（貨號PI615）、Rat TGF-β ELISA Kit（貨號PT878）、MDA 檢測試劑盒（貨號S0131S）、Reactive Oxygen Assay Kit（貨號S0033S）均購自碧云天公司；Masson 三色染色試劑盒（BC-DL-002，Biochannel 公司）；8-OHdG-ELISA 酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號E02H0007，上海藍(lán)基生物科技有限公司）；anti-p62-antibody（ab109012）、anti-LC3-antibody（ab192890）購自abcam 公司；FITC Anti-rat CD68（貨號MA5-28262，Thermo Scientific 公司）；PE anti-rat CD86（200307）、PE anti-rat CD206（貨號141705）均購自美國Biolegend 公司。SYNERGY HI 型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國伯騰儀器有限公司），F(xiàn)ACSCalibur 型流式細(xì)胞儀（美國BD 公司），WD-9423B 型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 模型制備

采用直線加速器6MV-X 線行全胸單次照射，在相對較短時間建立ARP 模型。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（36 mg/kg）麻醉，仰臥位固定在與肺臟在同一水平面上，用膠帶將四肢固定在自制的照射板上，下墊10 cm 厚等效物，上覆2 cm 厚等效膜，充分暴露胸部，鉛板遮擋保護(hù)頭部和腰部，放于照射臺上，模擬機下定位；調(diào)整照射野，上至大鼠前肢兩腋窩中點連線，下至劍突水平，照射野2 cm×3 cm，進(jìn)行全肺單照射（照距SSD 為100 cm，200 cGy/min），總照射劑量為18 Gy。照射前用紫外線消毒。

1.5 分組與給藥

將大鼠分為對照組、模型組、中藥組，每組6 只。于造模7 d 前，中藥組灌胃1 mL/100 g 補肺清肝化瘀方濃縮液，對照組和模型組灌胃等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)21 d。每3 天記錄1 次大鼠體質(zhì)量，最后1 天計算肺系數(shù)（肺系數(shù)=肺濕重÷末次體質(zhì)量）。照射14 d后處死大鼠，取肺組織保存-80 ℃冰箱用于后續(xù)實驗。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 肺組織病理學(xué)檢測 取肺組織樣本，在10%甲醛液中充分浸泡，室溫下固定48 h，常規(guī)脫水和石蠟包埋后，進(jìn)行組織病理學(xué)切片（4 μm），然后根據(jù)說明書進(jìn)行HE 染色和Masson 染色，于顯微鏡下觀察肺組織病理損傷。

1.6.2 ELISA 法 收集支氣管肺泡灌洗液，3 000×g，4 ℃下離心4 min，根據(jù)說明書檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）水平。取肺組織樣本，將其轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中，加入10 mL 預(yù)冷PBS，低溫快速研磨成勻漿，3 000×g，4 ℃下離心4 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法分析丙二醛（MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）含量。

1.6.3 流式細(xì)胞術(shù) 將肺組織研磨并收集沉積物，用PBS 溶解并沖洗。250×g離心5 min，收集細(xì)胞，用PBS重懸。加入FITC 抗大鼠CD68，室溫孵育20 min。再次離心重懸細(xì)胞懸液，加入PE 抗大鼠CD86和CD206，4 ℃孵育20 min。流式細(xì)胞儀檢測CD68+、CD86+和CD206+的表面水平，并使用CytExpert 軟件進(jìn)行分析。利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧（ROS）檢測，流式細(xì)胞儀分析熒光信號強度即ROS水平。

1.6.4 Western blotting 檢測 取肺組織樣本，低溫快速研磨成勻漿，RIPA 裂解緩沖液提取蛋白，收集組織裂解液于離心管中，12 000×g4 ℃離心15 min，收集上清，并通過Bradford 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行定量檢測。提取的蛋白通過SDS-PAGE 電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，再用Tris-buffer 稀釋的5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后，滴加50 μL 的一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 洗膜，滴加二抗［山羊抗兔IgG（HRP）抗體］，室溫下與膜孵育1 h。最后，采用BeyoECL Plus 試劑盒顯影目的條帶，β-actin被用作內(nèi)參。采用Image J軟件計算目的蛋白的灰度值。

1.6.5 免疫熒光雙染色法 收集肺組織，冷凍切片，8 μm，在冷甲醇/丙酮（1∶1）中固定10 min。PBS 洗滌3次，切片用3%牛血清白蛋白在25 ℃下封閉60 min。PBS 洗滌3 次，避光滴加抗體（抗LC3B 抗體作為第一抗體，抗CD68 抗體作為第二抗體），PBS 再次洗滌，滴加Alexa Fluor 488 偶聯(lián)二抗在25 ℃避光孵育2 h。DAPI染色細(xì)胞核，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時期體質(zhì)量比較

見表1、表2。與對照組相比，模型組體質(zhì)量第9天開始下降（P＜0.05）；補肺清肝化瘀方治療可逆轉(zhuǎn)大鼠體重下降（P＜0.05），第12 天是體質(zhì)量上調(diào)的轉(zhuǎn)折點。與對照組相比，模型組大鼠肺系數(shù)升高（P＜0.001），補肺清肝化瘀方治療后肺系數(shù)降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時期體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組大鼠不同時期體質(zhì)量比較（g，±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001。下同。

組 別對照組模型組中藥組n666 0 d 190.26±5.70 191.78±2.55 192.30±3.01 3 d 200.60±2.51 199.80±2.83 198.18±1.53 6 d 228.56±3.46 228.30±4.88 226.22±2.46 9 d 240.48±5.80 216.38±5.23*211.04±2.81 12 d 257.32±5.53 203.88±6.86*197.34±3.69 15 d 270.14±5.53 197.42±4.20*212.70±6.24△18 d 281.94±4.48 187.86±3.35*229.00±5.27△21 d 295.16±2.81 176.80±3.24*239.76±5.05△

表2 各組大鼠肺系數(shù)、膠原容積分?jǐn)?shù)、巨噬細(xì)胞M2/M1比值比較（±s）

表2 各組大鼠肺系數(shù)、膠原容積分?jǐn)?shù)、巨噬細(xì)胞M2/M1比值比較（±s）

組 別對照組模型組中藥組n666肺系數(shù)（mg/g）2.82±0.13 3.33±0.22***3.06±0.11△膠原容積分?jǐn)?shù)（%）0.26±0.03 7.89±1.36***3.62±0.50△△△M2/M1比值3.80±0.42 0.27±0.07***1.18±0.71△

2.2 各組大鼠肺組織病理變化

見圖1、表2。HE 染色結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡數(shù)量減少，肺泡間隔增厚，血管充血，淋巴細(xì)胞浸潤；補肺清肝化瘀方治療顯著改善病理損傷。Masson 染色結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組大鼠膠原沉積增加（P＜0.001），補肺清肝化瘀方治療可降低膠原沉積（P＜0.001）。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化

2.3 各組大鼠炎癥因子水平的比較

見表3。與對照組相比，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β 水平增加（P＜0.01），TGF-β、IL-10、IL-4 水平降低（P＜0.01）。補肺清肝化瘀方治療后，TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05 或P＜0.01），TGF-β、IL-10、IL-4水平增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

組別對照組模型組中藥組n666 TNF-α 19.88±2.33 37.96±4.58**28.12±3.16△IL-6 12.14±1.19 19.16±1.13**13.88±1.94△△IL-1β 5.33±0.44 8.33±0.62**6.59±0.71△IL-4 10.74±0.74 6.78±0.89**9.12±1.14△IL-10 17.33±2.79 8.90±1.30**14.74±1.61△TGF-β 16.77±1.62 6.95±2.33**12.37±2.03△

2.4 各組大鼠巨噬細(xì)胞極化水平比較

見圖2、表2。流式細(xì)胞術(shù)量化M2/M1 比值，CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞，CD86 標(biāo)記M1 巨噬細(xì)胞，CD206 標(biāo)記M2 巨噬細(xì)胞。結(jié)果所示，與對照組相比，模型組M2/M1 比值降低（P＜0.001），補肺清肝化瘀方治療后，M2/M1比值升高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠巨噬細(xì)胞極化

2.5 各組大鼠線粒體氧化應(yīng)激水平比較

見圖3、表4。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組ROS、MDA 和8-OHdG 水平增加（P＜0.001）；補肺清肝化瘀方治療后，ROS、MDA、8-OHdG 水平降低（P＜0.05或P＜0.001）。

圖3 各組大鼠肺組織ROS水平

表4 各組大鼠線粒體氧化應(yīng)激水平比較（±s）

表4 各組大鼠線粒體氧化應(yīng)激水平比較（±s）

組 別對照組模型組中藥組n666 ROS 18 240.43±2 643.17 62 607.03±3 209.22***49 487.58±3 692.30△△△MDA（nmol/mL）0.48±0.03 0.66±0.03***0.61±0.03△8-OHdG（ng/mL）5.70±0.40 7.67±0.27***6.84±0.57△

2.6 各組大鼠巨噬細(xì)胞自噬激活情況比較

見圖4、圖5、表5。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組CD68/LC3B 共表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，p62表達(dá)增加（P＜0.001）。補肺清肝化瘀方治療后，LC3B/CD68 共表達(dá)（P＜0.01）和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（P＜0.05）增加，p62表達(dá)降低（P＜0.001）。

圖4 各組大鼠巨噬細(xì)胞自噬免疫熒光雙染色檢測

圖5 各組大鼠肺組織LC3和p62蛋白表達(dá)

表5 各組大鼠巨噬細(xì)胞自噬激活情況比較（±s）

表5 各組大鼠巨噬細(xì)胞自噬激活情況比較（±s）

組 別對照組模型組中藥組n666 LC3B/CD68 27.83±1.84 15.06±1.70***21.54±2.18△△p62 1.00±0.06 3.08±0.23***2.24±0.31△△△LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.02±0.22 0.12±0.01***0.43±0.16△

3 討 論

補肺清肝化瘀法臨床治療ARP 的中醫(yī)證候療效顯著，然而其作用機制還不清楚，還沒有相關(guān)研究。巨噬細(xì)胞極化是炎癥調(diào)節(jié)的先決條件，其結(jié)果是促炎和抗炎的雙重作用。因此，本研究擬探討補肺清肝化瘀方對ARP大鼠巨噬細(xì)胞極化的影響。

巨噬細(xì)胞主要分化為M1 表型和M2 表型。其中，M1表型通常分泌促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-23［9］。M2 表型通常由抗炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)，如IL-4、IL-10、IL-13 和TGF-β［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，新風(fēng)膠囊可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥［11］。本研究結(jié)果顯示，補肺清肝化瘀方治療明顯逆轉(zhuǎn)了ARP 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤，促進(jìn)了M2 極化，細(xì)胞因子的分泌也與之一致。這表明抑制M1極化可能是ARP 的治療靶點。已有研究證實，巨噬細(xì)胞極化通過促進(jìn)ROS的產(chǎn)生有助于氧化應(yīng)激的發(fā)生［12］。羅哌卡因通過抑制M1 型巨噬細(xì)胞極化緩解腦缺血再灌注損傷大鼠引起的免疫紊亂和組織氧化應(yīng)激損傷［13］。TNF-α、TGF-β 和IL-6 等細(xì)胞因子誘導(dǎo)ROS/NO 的過表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)生成酶COX-2、iNOS和NADPH p67phox的生成，進(jìn)一步導(dǎo)致ROS 生成和氧化應(yīng)激［14］。此外，MDA 和8-OHdG 也是氧化應(yīng)激的經(jīng)典生物標(biāo)志物。本研究表明ARP 模型誘導(dǎo)高水平的氧化損傷，表現(xiàn)為ROS、MDA 和8-OHdG 水平顯著增加。近期研究表明M2 極化可緩解氧化應(yīng)激損傷。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)，補肺清肝化瘀方治療可以緩解炎性M1 巨噬細(xì)胞向抗炎M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化時的氧化應(yīng)激。

在本研究中，ARP模型大鼠巨噬細(xì)胞自噬被抑制。一方面，正如之前的報道所描述的，自噬激活可以保護(hù)組織免受氧化應(yīng)激引起的持續(xù)損傷［15］。另一方面，自噬激活有助于減輕肺纖維化，使患者恢復(fù)正常的肺功能。柴胡皂苷d 可改善TGF-β1 誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞纖維化改變，其機制可能是通過抑制mTOR 通路激活誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)揮作用［16］。因此，激活自噬對治療ARP 至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，補肺清肝化瘀方治療可以激活肺組織的自噬，尤其是巨噬細(xì)胞的自噬。

綜上所述，巨噬細(xì)胞極化和氧化應(yīng)激在調(diào)節(jié)自噬激活過程中起重要作用。補肺清肝化瘀方通過抑制M1極化，緩解氧化應(yīng)激，激活A(yù)RP大鼠自噬。然而，本研究沒有探討補肺清肝化瘀方調(diào)控ARP 大鼠巨噬細(xì)胞自噬活化的機制；AMPK 能抑制mTOR 的活化而促進(jìn)ULK1 活化從誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，是調(diào)節(jié)自噬的一個重要信號。在后續(xù)的研究中，探討補肺清肝化瘀方對ARP 大鼠AMPK 介導(dǎo)的自噬信號活化的影響，分析抑制AMPK介導(dǎo)的自噬促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的極化，從而抑制炎癥和氧化應(yīng)激損傷。