肝郁氣滯、肝膽濕熱型膽囊膽固醇沉著癥動物模型建立與評價

王 彤,張 平,顏鑫園,蔡青原,陳建波,王雅蕾,劉文杰, 朱豆豆,王 旭,譚 琰,李建軍,姚成禮

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

膽囊膽固醇沉著癥是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病[1]。病理學(xué)上分為彌漫性膽囊膽固醇沉著癥(又名草莓膽囊)和膽固醇性息肉[2]。膽囊黏膜中膽固醇酯含量增高是其主要病變特點,且膽固醇酯含量增高程度與膽汁膽固醇過飽和度呈正相關(guān)[3]。中醫(yī)學(xué)關(guān)于此類疾病的命名、診療多是從癥狀角度出發(fā),被稱為“脅痛”“膽脹”“膽癉”等。隨著我國物質(zhì)生活水平的日益提高和超聲診斷學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步[4],膽囊膽固醇沉著癥的發(fā)病率逐年升高[5]。但其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,更缺乏療效明確治療藥物[6]。無論是機(jī)制研究還是有效藥物評價都需要可靠的動物模型[7]。目前國內(nèi)外針對該病的動物模型研究較少,且尚無統(tǒng)一的建立標(biāo)準(zhǔn)與評價體系[8]。因此,本研究擬經(jīng)高脂高膽固醇飼料+正常飲用水法構(gòu)建膽囊膽固醇沉著癥小鼠模型,并對模型進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：8周齡雄性C57BL/6J小鼠48只,體重(20±2)g。采用隨機(jī)數(shù)表法將小鼠分為空白對照組(WT)和造模3周組(LD-3)、造模6周組(LD-6)、造模9周組(LD-9)。WT組予普通飼料+正常飲用水喂養(yǎng),模型組分別給予3、6、9周高脂高膽固醇飼料+正常飲用水。高脂高膽固醇飼料組成：15%牛油、2%膽固醇、0.5%膽酸、82.5%普通飼料。以上組別的小鼠均自由飲食、水,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±1)℃。小鼠購買于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,單位許可證號：SCXK(京)2019-0010。所有實驗操作均符合中華人民共和國實驗動物管理條例,本動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理審查委員會批準(zhǔn),批準(zhǔn)批號：BUCM-4-2020031501-1025。

1.1.2 實驗試劑：1.25%阿弗丁(三溴乙醇0.625 g、阿拉丁1.25 ml、0.9%氯化鈉溶液50 ml,搖晃至溶解);三溴乙醇(北京翰隆達(dá)公司,T161626);叔戊醇(北京翰隆達(dá)公司,A103417);膽固醇(CHOL)測定試劑盒(IDEXX,011995);甘油三酯(TRIG)測定試劑盒(IDEXX,012308);無水乙醇(天津永大化學(xué)試劑有限公司,20201220);尼羅紅染色試劑(Sigma,72485);一抗鼠抗ABCA1(Abcam,ab66217);小鼠二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,PV-9002);濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,ZLI-9017)。

1.1.3 實驗儀器：Catalyst One動物干式生化分析儀,廠家：美國愛德士(IDEXX)生物科技公司;傅里葉變換紅外光譜儀,廠家：美國Bruker公司;超速冷凍離心機(jī),廠家：德國Eppendorf公司;微量移液槍(無RNA酶),廠家：德國Eppendorf公司;全波長多功能酶標(biāo)儀,廠家：奧地利Tecan公司;共聚焦顯微鏡,廠家：奧林巴斯;超分辨顯微鏡,廠家：德國徠卡公司;數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱,廠家：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;高精度電子天平秤,廠家：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本收集：腹腔注射1.25%阿弗丁,深度麻醉小鼠。眼眶取血,全血靜置1 h后,室溫4000 r/min離心15 min,取血清于-80 ℃冰箱冷凍,3 d內(nèi)檢測完畢。心臟灌流麻醉小鼠,0.9%氯化鈉溶液灌流,取新鮮膽囊組織,于-80 ℃冰箱凍存,用于膽汁成分分析。心臟灌流麻醉小鼠,0.9%氯化鈉溶液灌流,4%多聚甲醛灌流,取肝臟組織,用多聚甲醛固定,再于30%蔗糖溶液沉糖脫水,于4 ℃冰箱存放,用于制備石蠟切片。

1.2.2 血脂測定：將樣本血清從-80 ℃中取出后,在冰上融化,使用不含任何抗凝劑的移液槍吸取100 μl血清樣本,轉(zhuǎn)移到專用樣本杯,打開全自動生物化學(xué)分析儀,輸入樣本信息,將總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)專用試劑片以及樣本杯放置于指定位置,啟動分析儀,記錄數(shù)據(jù),回收剩余血清樣本。

1.2.3 尼羅紅染色：將膽囊組織放置于1 × PBS溶液中,用鑷子小心清除膽囊表面的脂肪組織,并用顯微眼科剪縱向剪開,室溫下用4%多聚甲醛PBS溶液固定30 min,孔板中加入0.05%尼羅紅的PBS溶液(1∶1000)與膽囊組織室溫共孵育30 min,注射器抽取ddH2O沖洗2次后75%甘油封片鏡檢,共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.4 紅外光譜分析膽汁成分：觀察膽囊的形態(tài)大小、膽汁的色澤情況并做好記錄。用持針器結(jié)扎膽囊管,眼科剪小心剝離膽囊。待膽囊完全剝離后,用1 ml的注射器從膽囊底部抽取膽汁,存放于EP管中,靜置6 h后,在4 ℃、1500 r/5 min的條件下迅速離心,用移液器吸取其上清液,于200 μl EP管分裝并做好標(biāo)記,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

紅外光譜的采集用無水乙醇清潔ATR附件的內(nèi)反射晶體表面后,滴加適量膽汁,吹干,測試樣品光譜。光譜范圍4000～400 cm-1,光譜分辨率4 cm-1,單張光譜累計掃描32次,以空氣作為光譜背景。數(shù)據(jù)處理,光譜縱坐標(biāo)由透過率轉(zhuǎn)變?yōu)槲舛?對光譜進(jìn)行ATR校正,接觸因子設(shè)為0,光譜基線自動校正,光譜縱坐標(biāo)歸一化,使2000～800 cm-1區(qū)域內(nèi)最高吸光度為1、最低吸光度為0。

1.2.5 免疫組化染色：取樣本肝同一位置制作石蠟切片,厚度為5 μm,將石蠟切片脫蠟至水,0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶,加一抗鼠抗ABCA1(1∶200),4 ℃過夜。次日,PBS沖洗2次,每次3 min,小鼠二步法：檢測試劑盒孵育,加DAB顯色,經(jīng)復(fù)染,脫水,透明,封片,在超分辨顯微鏡下觀察,進(jìn)行圖像采集與分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間均值比較采用獨立樣本t檢驗;多組間均值比較采用單因素ANOVA中的Dunnet-t檢驗;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 WT組小鼠一般情況較好,自主活動性強(qiáng),背部毛發(fā)柔順光澤致密,緊貼皮膚;與WT小鼠相比,LD-3小鼠均出現(xiàn)常拱背、好聚堆、活動度降低,毛發(fā)晦暗干枯,背部毛發(fā)及胡須出現(xiàn)不同程度的脫落,小便色黃、大便質(zhì)軟;LD-6、LD-9小鼠精神萎靡不振、嗜睡懶動、好聚堆、常躲在籠子角落,皮毛稀疏油亮,小便顏色深黃,大便黏軟。此外,在LD-9小鼠的腹部皮下還發(fā)現(xiàn)了皮脂腺囊腫。

2.2 各組小鼠體重變化 利用高脂飼料,連續(xù)喂養(yǎng),分別觀察各組小鼠體重變化趨勢,見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著高脂飼料的喂養(yǎng),造模小鼠逐漸出現(xiàn)體重增加,與WT相比,LD-3就出現(xiàn)了體重的增加,LD-6、LD-9體重均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001,P<0.0001)。

2.3 各組小鼠血清中TC、TG含量 利用高脂飼料,連續(xù)喂養(yǎng),收集各組小鼠血清,觀察血清中TC、TG含量變化,見圖2。與WT相比,LD-3、LD-6、LD-9,血清TC水平均出現(xiàn)了顯著增高(P<0.05)(圖2A),血清TG水平均出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)(圖2B)。

注：△P<0.001,#P<0.01,*P<0.05

2.4 各組小鼠膽汁混濁度和膽囊脂質(zhì)沉積 動物取材后,觀察膽囊內(nèi)容物的清亮程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),高脂飼料連續(xù)喂食后,LD-3時已經(jīng)出現(xiàn)膽汁混濁現(xiàn)象,隨著時間的增加,膽汁混濁程度上升,其中LD-9尤為顯著,同時,可以發(fā)現(xiàn)LD-9膽囊壁外附著大量脂肪(圖3A)。我們利用尼羅紅染色方法,在共聚焦顯微鏡下對膽囊壁進(jìn)行了觀察,結(jié)果顯示,與WT相比,造模組小鼠膽囊切片在LD-3、LD-6、LD-9可見大量脂質(zhì)沉積,且LD-9的脂質(zhì)沉積最為顯著(圖3B)。

A：肉眼觀察到的LD-3、LD-6、LD-9膽汁混濁現(xiàn)象;B：膽囊組織尼羅紅染色脂質(zhì)沉積

2.5 小鼠膽汁成分 進(jìn)一步,利用紅外光譜,對膽汁成分進(jìn)行了分析,紅外光譜分析結(jié)果顯示,WT中,2868 cm-1為膽固醇等甾類化合物的C-H對稱伸縮振動峰(圖4黑色曲線)。利用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)9周,膽汁的紅外光譜發(fā)生明顯變化,相對于WT,LD-9中C-H對稱伸縮振動峰從2868 cm-1位移到2855 cm-1且強(qiáng)度增加,C-H彎曲振動峰從1450 cm-1位移到1455 cm-1,同時在3074 cm-1處出現(xiàn)=C-H伸縮振動峰(圖4紅色曲線),這些說明LD-9的膽汁中CHOL含量明顯增加。另外,LD-9中蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶吸收峰分別從1638 cm-1和1544 cm-1位移至1629 cm-1和1551 cm-1,兩個譜帶的分離度也明顯降低,說明LD-9膽汁中的蛋白質(zhì)與WT可能有所差別,而且LD-9膽汁中可能含有較多的脂肪酸類成分。膽汁(吹干后)紅外光譜分析圖中,2868 cm-1為膽固醇等甾類化合物C-H對稱伸縮振動峰,1638 cm-1和1544 cm-1為蛋白質(zhì)酰胺I帶與酰胺Ⅱ帶吸收峰。

圖4 WT和LD-9兩組小鼠膽汁成分

2.6 小鼠肝臟ABCA1蛋白表達(dá) 造模9周后,觀察WT和LD-9肝臟ABCA1蛋白表達(dá)。與WT相比,LD-9小鼠肝臟ABCA1蛋白表達(dá)水平明顯升高,見圖5。

圖5 WT和LD-9兩組小鼠肝臟ABCA1免疫組化結(jié)果(×200)

3 討 論

本實驗判斷小鼠膽囊膽固醇沉著癥模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為：①膽囊黏膜膽固醇逆向轉(zhuǎn)運或排除障礙,造成膽囊黏膜膽固醇結(jié)晶沉積[9];②膽固醇的局部代謝紊亂,使膽汁膽固醇過飽和[10]。

本研究結(jié)果顯示,與WT組相比,在喂養(yǎng)期間,模型組小鼠體重顯著高于空白組,這表明在喂養(yǎng)了特殊飼料后,模型組小鼠較空白組小鼠體重增長明顯,代謝水平在逐步下降,究其原因為高脂飼料滋膩礙脾,中焦積聚導(dǎo)致氣機(jī)郁滯,影響脾胃的升清降濁功能,體內(nèi)“痰濕”“瘀血”等病理產(chǎn)物阻滯。模型組小鼠出現(xiàn)皮毛脫落,考慮為濕熱蘊結(jié),脂溢皮膚所致,類似于脂溢性脫發(fā)的癥狀表現(xiàn)[11]。此外,在LD-9小鼠的腹部皮下還發(fā)現(xiàn)了皮脂腺囊腫,考慮是由于小鼠體內(nèi)氣滯痰凝,濕熱蘊結(jié)所致[12]。諸多表現(xiàn)均符合中醫(yī)角度的肝膽濕熱狀態(tài)。與WT組相比,LD-3時膽汁出現(xiàn)混濁現(xiàn)象,隨時間增加,膽汁混濁程度上升,其中LD-9尤為顯著;進(jìn)一步利用紅外光譜,對膽汁成分進(jìn)行分析,結(jié)果LD-9的膽汁中TC含量增加。利用尼羅紅染色對膽囊組織進(jìn)行觀察結(jié)果顯示,造模組均可見脂質(zhì)沉積,且LD-9的最為顯著。結(jié)果表明高脂高膽固醇飲食和正常飲水9周的情況下可以導(dǎo)致膽囊膽固醇沉積。

膽汁膽固醇從外周組織經(jīng)過HDL-C途徑進(jìn)入肝臟被循環(huán)、代謝的過程稱為膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(RCT)[13]。該過程有效避免了外周組織膽固醇的蓄積。ATP 結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白,主要是ABCA1被認(rèn)為是介導(dǎo)肝臟膽固醇輸出的關(guān)鍵蛋白[14],參與介導(dǎo)磷脂和膽固醇向低脂或無脂A1(apo-A1)的轉(zhuǎn)移,以生成新生HDL顆粒[15]。特異性地在肝臟中上調(diào)ABCA1的表達(dá)能夠提高血漿內(nèi)HDL的含量。ABCA1表達(dá)不足會阻斷膽固醇和磷脂在肝細(xì)胞基底外側(cè)膜的轉(zhuǎn)運,致使因缺乏足夠的膽固醇和磷脂而影響 ApoA1蛋白脂化[16]。空載的ApoA1則被腎迅速清除出循環(huán)系統(tǒng),進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的HDL缺乏綜合征[17]。本研究中,造模組肝臟ABCA1表達(dá)增高,且LD-9顯示出有統(tǒng)計學(xué)差異,表明高脂高膽固醇飲食和正常飲水可增高肝臟ABCA1表達(dá),促進(jìn)膽囊膽固醇沉積。膽為中清之腑,隨著肝氣的疏泄而規(guī)律排泄。小鼠食用高膽固醇飼料(肥甘厚味)會導(dǎo)致濕熱之邪蘊結(jié)腸胃,熏蒸肝膽,使少陽升發(fā)之氣內(nèi)乏。氣郁而水濕、痰飲聚集,最終形成膽囊腔內(nèi)和膽囊壁的“積聚”癥狀。

脂質(zhì)代謝異常主要是指血清TC和TG水平過高和HDL-C水平過低[18]。目前脂質(zhì)代謝異常與膽囊膽固醇沉積的形成相關(guān)性仍存在爭議[19]。KHAIRY等[20]認(rèn)為膽固醇息肉患者血清TC水平升高,而BRAGHETTO等[21]和MENDEZ-SANCHEZ等[22]研究結(jié)果顯示,膽固醇息肉與血清TC水平無相關(guān)性。本研究中,造模組血清TC水平增高,TG水平降低,說明動物實驗中血清TC、TG水平可作為造模的評價指標(biāo)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,肝臟具有疏泄作用,調(diào)節(jié)一身氣機(jī),當(dāng)肝氣郁結(jié)時會影響氣血暢通,導(dǎo)致血液瘀堵。高脂血癥與體內(nèi)病理產(chǎn)物堆積致血液黏稠狀態(tài)有關(guān),病理產(chǎn)物包括瘀血、痰濁、濕邪和食積等。肝氣郁結(jié)、血液、膽汁運行不暢,故血脂增高、膽囊壁出現(xiàn)病理產(chǎn)物堆積。

肝和膽生理相關(guān),病理相連。肝屬足厥陰經(jīng),膽屬足少陽經(jīng),二者互為表里,膽附著于肝。肝為厥陰乙木,屬將軍之官,喜條達(dá)而惡抑郁,喜升散而惡降斂;膽為少陽甲木,屬奇恒之腑,以降為順,流暢為安,宜疏不宜滯,宜清不宜濁。肝膽相照,共主疏泄,肝司膽汁之分泌與排泄。《諸病源候論》中總述了膽石癥的發(fā)病原因：“氣水飲停滯結(jié)聚成癖”[23]。氣、痰飲、水濕積聚不散,聚于脅下,脅下滿痛,癥見黃疸。由此可見,膽石癥主要由肝失疏泄,膽汁淤滯所致。將膽石癥分為五種證型：肝郁氣滯證、肝膽濕熱證、肝陰不足證、瘀血阻滯證和熱毒內(nèi)蘊證[24]。章小燕等[25]對CNKI數(shù)據(jù)庫中收集到的中醫(yī)藥治療膽固醇結(jié)石文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣滯型的頻數(shù)分布為35.81%,濕熱型為40.41%,陰虛型為3.07%,瘀血型為3.32%,熱結(jié)型為1.92%。可見肝郁氣滯證、肝膽濕熱證為膽石癥的主要證型。而本文建立的膽囊膽固醇沉著癥小鼠模型的臨床表現(xiàn),均符合肝郁氣滯、肝膽濕熱的證候特征。

綜上所述,本研究通過高脂高膽固醇飲食和正常飲水建立膽囊膽固醇沉著癥小鼠模型,并從疾病評價指標(biāo)和膽固醇代謝指標(biāo)兩個方面進(jìn)行評估,所構(gòu)建模型特征符合臨床上膽囊膽固醇沉著癥的病理特征及常見中醫(yī)證候特征。