解毒活血湯對(duì)慢性腎臟病大鼠腎臟FGF23、Klotho表達(dá)的影響

周 鵬,孫妲男,李 勇,徐 麗,喬 偉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科,黑龍江 哈爾濱 150001)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)發(fā)病率近年來(lái)逐年升高,有研究結(jié)果證明,其在全球一般人群中的患病率已經(jīng)高達(dá)14.3%[1]。鈣磷代謝紊亂是CKD患者常見(jiàn)的臨床表現(xiàn),它會(huì)導(dǎo)致礦物質(zhì)和骨代謝的異常,引發(fā)腎性骨病、多系統(tǒng)功能損傷、心血管意外事件高發(fā)等[2]。目前臨床治療CKD鈣磷代謝紊亂采用的主要治療方法為調(diào)節(jié)血磷與血鈣,治療繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥[3]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(Fibroblast growth factor,FGF23)是由來(lái)自于長(zhǎng)骨中的成骨細(xì)胞與骨細(xì)胞合成和分泌的,其可作用于腎臟,參與調(diào)節(jié)機(jī)體血磷,使其維持動(dòng)態(tài)平衡[4]。Klotho具有預(yù)防血管鈣化(Vascular calcification,VC)的作用,能夠抑制磷的吸收,加速尿磷的排泄進(jìn)而減輕機(jī)體磷負(fù)荷[5]。本研究基于《內(nèi)經(jīng)》“去菀陳莝”理論及慢性腎衰“脾腎虧虛、濕濁瘀血阻脈”病機(jī),有其理論依據(jù);臨床實(shí)踐也證實(shí)解毒活血湯對(duì)CKD患者臨床療效較好,可顯著改善腎功能和鈣磷平衡[6],但關(guān)于解毒活血湯是如何影響CKD所致鈣磷代謝紊亂的研究仍較少。綜上,本次實(shí)驗(yàn)探討解毒活血湯對(duì)慢性腎臟病大鼠腎功與腎臟FGF23、Klotho蛋白表達(dá)的影響以及其對(duì)Ca、P的影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 NW10LVF型超純水系統(tǒng)購(gòu)于香港Heal Force公司;DW HL-668型-70 ℃超低溫冰箱購(gòu)于安徽中科美菱公司;UV752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于上海佑科公司;Synergy H1型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó) BioTek公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)于金壇榮華儀器公司;DYY-7C型電泳儀、DYCZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀購(gòu)于北京六一公司;DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于天津泰斯特公司;H-2050R型超速冷凍離心機(jī)購(gòu)于湖南湘儀公司;ELX-800型酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó) BIOTEK公司;磷測(cè)試盒(C006)、肌酐(Cr)測(cè)定試劑盒(C011)、鈣測(cè)試盒(C004)購(gòu)于南京建成公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(WLA004)、尿素氮(BUN)測(cè)試盒(WLA120)、全蛋白提取試劑盒(WLA019)、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒(WLA013)、Western洗滌液(WLA025)SDS-PAGE電泳液(干粉)(WLA026)、ECL發(fā)光液(WLA003)購(gòu)于萬(wàn)類(lèi)生物公司;FGF-23 antibody(DF3596)、Klotho antibody(DF10309)購(gòu)于中國(guó) affinity公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制作 無(wú)特定病原體級(jí)(SPF)級(jí)健康雄性SD大鼠60只,6～8周齡,體重(210±10)g,購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2018-003],飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心[許可證號(hào)：SYXK(黑)2016004]。所有大鼠均飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)的動(dòng)物房,光亮12 h光,12 h暗交替,溫度(23±3)℃,濕度45%～55%,自由飲食,飲水。隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組,每組各12只。實(shí)驗(yàn)均按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和關(guān)懷指南對(duì)大鼠的進(jìn)行處置。

造模方法：空白組不予處理,其余各組第1周至第4周,腺嘌呤250 mg/kg劑量每日灌胃1次,持續(xù)4周;第5周至第8周,同樣劑量的腺嘌呤隔日灌胃1次;第1周至第8周,模型鼠全部采用高磷飲食,含磷量為1.2%。第5周至第8周,中藥組用解毒活血湯灌胃治療,大鼠中藥給藥劑量按照人-大鼠體表面積換算(1∶6.25),并以臨床成人用藥劑量的1、2、4倍給藥,分為中藥低[1.4 g/(kg·d)]、中[2.8 g/(kg·d)]、高[5.6 g/(kg·d)]劑量組?？瞻捉M灌胃等量0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)給藥8周。每7 d記錄1次大鼠體重,服藥量按體重的變化調(diào)整,每天上午定時(shí)灌胃給藥。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 解毒活血湯：丹參、葛根各20 g,紅花、連翹、當(dāng)歸、桃仁、枳殼、生地、柴胡、赤芍、甘草各15 g。中藥飲片均購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院飲片藥局,草藥用10倍蒸餾水浸泡0.5 h后,加蒸餾水煎煮2次,合并2次濾液,過(guò)濾濃縮至生藥含量2.8 g/ml,濃縮置于4 ℃冰箱備用。

1.4 標(biāo)本采集方法 血液指標(biāo)測(cè)定各組動(dòng)物眼眶取血分離血清,大鼠處死前一天測(cè)體重并禁食,眼眶取血1 ml,離心留取血清,-20 ℃凍存(測(cè)定血清肌酐、尿素氮、鈣、磷)。

1.5 理化指標(biāo)測(cè)定 各組大鼠分別于4、6、8周末取血,采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血鈣、磷、尿素氮、肌酐血液標(biāo)本,按試劑盒說(shuō)明操作。

1.6 Western blot檢測(cè)大鼠腎臟FGF23、Klotho蛋白表達(dá) 取大鼠腎臟加入裂解液,制成組織勻漿,4 ℃低溫條件下進(jìn)行12000 r/min離心10 min,取上清定量蛋白。每組取40 μg蛋白,與上樣緩沖液混勻并沸水浴5 min,進(jìn)行SDS凝膠電泳。結(jié)束后取凝膠,進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜,4 ℃條件下浸于5%脫脂奶粉搖床緩慢搖動(dòng)1 h,4 ℃條件下一抗溶液(FGF23,Klotho)孵育過(guò)夜,洗膜,室溫下二抗溶液(羊抗兔IgG)孵育45 min,洗膜,曝光,以β-actin為內(nèi)參,將膠片進(jìn)行掃描,用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮、鈣、磷水平比較 研究結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組血清肌酐、尿素氮、磷均顯著增高(P<0.05),血鈣降低(P>0.05);中藥高劑量組血清肌酐、尿素氮、血鈣顯著增高(P<0.05),血磷升高(P>0.05);中藥中劑量組、中藥低劑量組血清肌酐、尿素氮、磷顯著升高(P<0.05或P<0.01),血鈣升高(P>0.05)。與模型組比較,中藥高劑量組血清肌酐、尿素氮、鈣、磷均顯著改善(P<0.05);中藥中劑量組血清肌酐、尿素氮、磷下降(P>0.05),血鈣增加(P<0.05);中藥低劑量組血清肌酐、尿素氮、鈣、磷下降(P>0.05)。與中藥低劑量組比較,中藥高劑量組血清肌酐、尿素氮顯著下降(P<0.05),血鈣上升(P>0.05),血磷下降(P>0.05);中藥中劑量組均有改善(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮、鈣、磷水平比較

2.2 各組大鼠腎臟FGF23、Klotho蛋白表達(dá)的比較 研究結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組FGF23、Klotho蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下降;與模型組相比,中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組FGF23、Klotho蛋白均有顯著改善。見(jiàn)表2、3、圖1、2。

A：空白組;B：模型組;C：中藥高劑量組;D：中藥中劑量組;E：中藥低劑量組

A：空白組;B：模型組;C：中藥高劑量組;D：中藥中劑量組;E：中藥低劑量組

表2 各組大鼠FGF23表達(dá)量

表3 各組大鼠Klotho蛋白表達(dá)量

3 討 論

中醫(yī)學(xué)古代文獻(xiàn)中沒(méi)有“慢性腎衰竭”的專(zhuān)屬病名,但與其相近的描述散見(jiàn)于“水腫”“癃閉”“腎風(fēng)”“關(guān)格”“溺毒”“虛勞”等病癥中。如《證治匯補(bǔ)》中提出：“既關(guān)且格,必小便不通。”慢性腎衰竭具有較為復(fù)雜的病因病機(jī),大多都由多病邪、多個(gè)臟腑同時(shí)致病,且以虛邪為主,夾以實(shí)邪,虛實(shí)夾雜,使病情遷延難愈,反復(fù)發(fā)作[7],臨床常見(jiàn)證型有肝腎陰虛、脾腎陽(yáng)虛、濕毒內(nèi)停等,但病因病機(jī)主要以腎虛、血瘀和濕毒為主。腎陰虧虛日久,陰損及陽(yáng)而致陽(yáng)虛,陽(yáng)不化陰,使分泌清濁功能減退,導(dǎo)致濕濁潴留;肝陰虛使肝失于陰精濡養(yǎng)而致肝氣疏泄失常,氣機(jī)不利,更使?jié)駶嶂半y以疏泄;腎陽(yáng)虧虛無(wú)力溫煦脾土,則脾陽(yáng)亦傷,脾陽(yáng)虛運(yùn)化失健,則瘀血內(nèi)生,濕濁內(nèi)停。肝、脾、腎三臟俱虛,氣機(jī)疏泄失常而致水濕、濁毒、瘀血停滯體內(nèi),三者又互相為病日久終致關(guān)格不通[8]。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》提出水腫的治療原則 “平治于權(quán)衡,去菀陳莝,……開(kāi)鬼門(mén),潔凈府”,即以活血化瘀之法祛除瘀滯的痰濁瘀血,再加以補(bǔ)氣固本類(lèi)藥物的推動(dòng),使邪氣從汗孔及膀胱排出。后世張仲景繼承發(fā)揚(yáng)此理論,于《傷寒雜病論》中創(chuàng)造性地提出具體療法和方藥,近現(xiàn)代的醫(yī)家以此為理論基礎(chǔ),結(jié)合各自臨床經(jīng)驗(yàn),提出了活血通絡(luò)、清利濕熱、補(bǔ)氣養(yǎng)陰等方法,臨床應(yīng)用皆取得了不錯(cuò)的療效[9-10]?！督饏T要略》中提出：“趺陽(yáng)脈伏,水谷不化,脾氣衰則鶩溏,胃氣衰則身腫……經(jīng)為血,血不利則為水,名曰血分?！薄堆C論》也提出：“血與水本不相離。”[11]由此可知,脾胃陽(yáng)氣虧虛,運(yùn)化水谷無(wú)力,氣血生化乏源,導(dǎo)致氣虛推動(dòng)血行無(wú)力,產(chǎn)生瘀血,瘀血阻滯水道,水道不通,水失其道,同時(shí)脾胃五行屬土,土虛水侮,泛溢肌膚,導(dǎo)致水腫,離道之水阻滯經(jīng)絡(luò),經(jīng)絡(luò)不通,又會(huì)導(dǎo)致瘀血的形成,加重水腫,故曰血瘀可導(dǎo)致水氣停聚化為濕濁,濕濁亦可導(dǎo)致血瘀,瘀血與濕濁相互影響,互為病理產(chǎn)物[12]。“去菀陳莝”是中醫(yī)活血化瘀治水法的來(lái)源,當(dāng)取“活血化瘀,利濕化濁”之義?！熬貌”刂谓j(luò)[13]”,注重并活用活血化瘀之法,在CKD患者的治療當(dāng)中,尤其是久病患者,往往可以提高臨床療效,減輕患者痛苦。

解毒活血湯在古籍中記載為用于熱毒血瘀之證的治療[14]。連翹清熱解毒,柴胡、葛根可升提陽(yáng)氣以助正氣,也可助連翹發(fā)揮其效,當(dāng)歸、生地活血滋陰,赤芍、桃仁、紅花可活血化瘀,枳殼理氣行氣,甘草可調(diào)和諸藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,連翹可以抗氧化、緩解疲勞、降脂、抗炎、抗菌[15],柴胡具有抗癌、鎮(zhèn)痛、抗炎以及保護(hù)腎臟和降脂的作用[16],葛根能夠抗炎、抗氧化、減輕細(xì)胞的損傷[17],當(dāng)歸、生地具有抗炎、保護(hù)肝臟與腎臟功能的作用[18],赤芍防止血栓、減少炎癥因子產(chǎn)生[19],桃仁抗炎、促進(jìn)血液循環(huán)、改善血管壁的彈性、保護(hù)肝腎[20],枳殼降低血脂、抗腫瘤、抗炎、保肝[21],甘草可以保護(hù)肝腎、抗炎和抗過(guò)敏[22],紅花藥理作用具有多樣性,可以調(diào)節(jié)免疫功能[23]。該方以“去菀陳莝”理論為指導(dǎo),全方起到清熱解毒、涼血活血化瘀的作用,對(duì)CKD患者療效甚好。

FGF23-Klotho軸通路與CKD患者鈣磷平衡關(guān)系密切,與CKD后期導(dǎo)致的眾多并發(fā)癥有著緊密的聯(lián)系,這也使得Klotho-FGF23軸有成為CKD防治的新靶點(diǎn)的可能性[24]。FGF23是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子系列中的一種,可參與血磷的調(diào)節(jié),CKD早期即開(kāi)始升高,相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明敲除小鼠FGF23基因會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生鈣磷代謝紊亂。另有研究表明,FGF23的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制磷在腎小管的重吸收和鈣、磷在腸道的重吸收過(guò)程,導(dǎo)致尿磷增加與甲狀旁腺功能亢進(jìn),導(dǎo)致低磷血癥、骨軟化等病癥的發(fā)生[25]。臨床研究發(fā)現(xiàn),Klotho蛋白具有調(diào)節(jié)高表達(dá)磷水平的能力,這種能力是通過(guò)降低腸道細(xì)胞與近端小管中相關(guān)蛋白的合成量發(fā)揮作用的,增加尿磷的排泄,使機(jī)體血磷濃度下降[26]。但隨著病情的不斷發(fā)展,殘余的腎單位不斷減少,使磷排泄障礙,最終導(dǎo)致高磷血癥發(fā)生。 Klotho蛋白也可通過(guò)抑制相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)控血磷的濃度,如NaPi2a;但其在機(jī)體中的高表達(dá)以及分泌的減少都會(huì)降低FGF23對(duì)血磷的調(diào)控能力。膜型α-Klotho蛋白可以和成纖維生長(zhǎng)因子受體結(jié)合,形成FGF23的跨膜協(xié)同受體,增強(qiáng)FGF23-Klotho軸的功能,從而調(diào)節(jié)鈣磷,但隨著CKD的進(jìn)展,FGF23表達(dá)持續(xù)升高,Klotho蛋白表達(dá)持續(xù)下降,使跨膜協(xié)同受體減少無(wú)法滿(mǎn)足FGF23的結(jié)合需要,產(chǎn)生FGF23抵抗,所以可通過(guò)調(diào)節(jié)失衡的FGF23-Klotho軸以達(dá)到改善機(jī)體高磷低鈣的狀態(tài)。

在本次實(shí)驗(yàn)中我們可以發(fā)現(xiàn),和模型組相比,CKD大鼠腎功水平的改善與解毒活血湯濃度呈正相關(guān),解毒活血湯的濃度越高,對(duì)降低CKD大鼠血清肌酐和尿素氮的效果越好;解毒活血湯的濃度越高,FGF23與Klotho蛋白在腎臟組織的表達(dá)量越高,進(jìn)而使失衡的FGF23-Klotho軸趨向平衡,調(diào)節(jié)CKD大鼠的鈣磷代謝,使血鈣上升,血磷下降。

解毒活血湯可以改善CKD 大鼠腎臟功能,其可以通過(guò)提高CKD大鼠腎臟組織中FGF23、Klotho蛋白的表達(dá)影響失衡的FGF23-Klotho軸,進(jìn)而調(diào)節(jié)CKD大鼠血中鈣、磷濃度,且對(duì)其作用效果與解毒活血湯劑量相關(guān),但解毒活血湯如何影響Klotho、FGF23蛋白表達(dá)的機(jī)制的研究仍然不清,所以還需要大量的臨床研究與實(shí)驗(yàn)研究來(lái)明確Klotho、FGF23蛋白對(duì)腎臟功能的調(diào)節(jié)機(jī)制,證實(shí)FGF23-Klotho軸作為CKD治療靶點(diǎn)的效果及安全性。