通腑理肺湯對膿毒癥腸屏障損傷大鼠腸黏膜組織閉鎖小帶蛋白-1、閉合蛋白 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

柳 蔓,呂 波,李 蘭,陳 立

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科,貴州 貴陽 550001;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 貴陽 550001;3.廣東省中醫(yī)院急診科,廣東 廣州 510120)

膿毒癥主要由各種病原微生物等侵入機(jī)體后引發(fā)的感染反應(yīng)失調(diào),最終導(dǎo)致的一系列器官功能衰竭的一種綜合征,其致死率呈逐年上升趨勢。隨著病情進(jìn)展,會造成膿毒癥休克,引起多器官功能綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1]而危及生命。腸道屏障指腸道上皮具有分隔腸腔內(nèi)物質(zhì),防止致病性抗原,如細(xì)菌和內(nèi)毒素向腸腔外組織、器官和血循環(huán)移位的結(jié)構(gòu)和功能的總和。膿毒癥腸屏障損傷的病理基礎(chǔ)在于,膿毒癥可引起腸屏障功能紊亂甚至腸衰竭,腸屏障功能損害還可促使腸道內(nèi)菌群移位[2-3],使膿毒癥反應(yīng)再次加重,因此,膿毒癥腸屏障損傷的互為影響,對于如何保護(hù)腸道功能、減少菌群移位引起的腸損傷,成為當(dāng)今膿毒癥腸屏障損傷的重要內(nèi)容。研究顯示,腸道黏膜的主要細(xì)胞質(zhì)跨膜蛋白和調(diào)節(jié)蛋白閉合蛋白(Occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)表達(dá)的高低與腸黏膜通透性成反比關(guān)系,當(dāng)Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)降低時(shí),腸道黏膜通透性明顯增強(qiáng),進(jìn)而造成腸屏障的破壞。中醫(yī)藥干預(yù)膿毒癥腸黏膜屏障損傷近幾年受到關(guān)注,但治療多偏向在單純應(yīng)用通腑法改善腸屏障功能,效果不確切[4]?，F(xiàn)代研究已經(jīng)證實(shí),膿毒癥腸屏障損傷同時(shí)伴有肺功能損傷[5],基于“肺與大腸相表里”理論為指導(dǎo),應(yīng)用“肺腸合治”治療原則,創(chuàng)立的通腑理肺湯(TFL),臨床上廣泛用于膿毒癥胃腸功能衰竭危重患者的救治,收到了確切的臨床效果[6],但對膿毒癥腸黏膜屏障干預(yù)的具體機(jī)制不清。本研究通過采用育腸結(jié)扎穿孔(CLP)法建立實(shí)驗(yàn)動物模型的基礎(chǔ)上,應(yīng)用TFL干預(yù),檢測大鼠腸黏膜組織緊密連接蛋白ZO-1、Occludin mRNA基因及蛋白表達(dá),同時(shí)在光鏡及透射電鏡下行腸黏膜組織病理觀察,進(jìn)一步探討TFL在膿毒癥發(fā)生時(shí),對腸黏膜屏障造成損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SD大鼠購自于SLAC ANIMAL公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0015],由貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、TFL低劑量組、TFL高劑量組,每組各10只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：Occludin抗體(貨號：ab216327,美國Abcam公司);ZO-1抗體(貨號：#2847,美國CST公司);SYBR GreenqPCR試劑盒(貨號：RR820A,日本Takara Biotechnology公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：A3500,日本Takara Biotechnology公司);BCA蛋白定量試劑(貨號：pc0020,北京索萊寶科技);蛋白酶抑制劑(貨號：60237,江蘇康為世紀(jì));Western Blotting Luminol Reagent(貨號：sc-2048,Santa Cruz Biotechnolog公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號：Light CyclerH 480,羅氏公司);VE186轉(zhuǎn)膜儀(型號：VE186,天能公司);CMax Plus酶標(biāo)儀(型號：CMax Plus,MD);病理切片機(jī)(型號：RM2016,上海Leika生物系統(tǒng));脫水機(jī)(型號：JJ-12J,武漢俊杰);包埋機(jī)(型號：JB-P5,武漢俊杰電子有限公司);透射電子顯微鏡(型號：JEM-1230,日本HITACH公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 應(yīng)用CLP[7]法制作膿毒癥腸屏障損傷大鼠模型;假手術(shù)組只暴露盲腸,不做穿孔處理。TFL低劑量組造模成功后給予3.6 g/kg體重TFL灌胃;TFL高劑量組造模成功后,按7.2 g/kg體重TFL灌胃干預(yù);模型組、假手術(shù)組相同條件下,均按照蒸餾水10 ml/kg體重灌胃干預(yù),以上每組均每天干預(yù)1次,實(shí)驗(yàn)周期為7 d。本實(shí)驗(yàn)中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測

1.3.1 腸黏膜組織ZO-1、Occludin mRNA的測定：采用RT-qPCR法檢測腸黏膜組織 ZO-1、Occludin mRNA：根據(jù)說明書,使用RNA提取試劑盒從SD大鼠腸黏膜組織中收集總RNA。用NanoDrop分光光度計(jì)對提取的RNA進(jìn)行定量。使用特定的引物在50 ℃下逆轉(zhuǎn)錄45 min。SYBR Premix Ex Taq與Applied Bio-Rad CFX96序列檢測系用于PCR程序。根據(jù)以下條件進(jìn)行PCR：95 ℃ 5 min,然后在95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s和72 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán),最后在72 ℃進(jìn)行延伸步驟5 min。ZO-1、Occludin的表達(dá)水平通過閾值循環(huán)Ct確定,相對表達(dá)水平通過2-Cq方法計(jì)算。RT-qPCR所用引物序列信息見表1。

表1 引物序列

1.3.2 腸黏膜組織ZO-1、Occludin 蛋白的測定：通過蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測腸黏膜組織 ZO-1和Occludin蛋白的水平。應(yīng)用蛋白提取試劑盒從腸組織中分離總蛋白,BCA試劑盒進(jìn)行定量。在12%的SDS-Polycramide凝膠上分離出約40 μg蛋白質(zhì),將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%TBST脫脂奶粉封閉薄膜60 min,參考試劑盒說明書,按照適當(dāng)比例封閉液稀釋一抗,再次將膜轉(zhuǎn)移至一抗中,4 ℃搖床緩慢搖動孵育過夜?；厥找豢?再次加入TBST洗滌液,洗滌5～10 min,共3次。稀釋抗兔IgG辣根過氧化酶偶聯(lián)抗體二抗,常溫下,搖動孵育120 min,再次回收二抗,加入TBST洗滌液,洗滌10 min,共3次。最后將X線膠片暗示中感光、顯影、定影,將印跡與ECL試劑一起孵育并暴露于Tanon5200-multi以檢測ZO-1和Occludin蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.3.3 腸黏膜組織光鏡下病理觀察：7 d后,用苯巴比妥鈉200 mg/kg腹腔注射將SD大鼠安樂死后觀察。收集每只動物的腸黏膜組織并用無菌水沖洗。用70%、80%、90%的乙醇溶液依次將組織脫水,并摻入等量的乙醇、二甲苯。在室溫下孵育15 min后,將組織與等量的二甲苯在室溫下混合15 min。重復(fù)該步驟直至黏膜組織看起來透明。然后用石蠟包埋黏膜組織,切片(4 μm),在光學(xué)顯微鏡下用HE在室溫下染色30 min,對腸黏膜組織病理變化進(jìn)行拍照、觀察。

1.3.4 腸黏膜組織透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察：7 d后對SD大鼠用上述相同方法處死,將腸黏膜組織收集起來,用2.5%的戊二醛固定2 h,用0.1 mol/L的磷酸溶液清洗3次。然后用1%的酸液將組織固定2～3 h,再用0.1 mol/L的磷酸液清洗3遍。依次用乙醇(50%、70%、90%、90%)和90%丙酮(V∶V=1∶1)、90%丙酮沖洗組織15～20 min。隨后,將腸黏膜組織與100%丙酮在室溫下孵育3次,每次15～20 min。用丙酮(100%)和包埋液與組織一起孵育3～4 h。最后,將腸黏膜組織和包埋液在37 ℃的烘箱內(nèi)依次孵化過夜,在45 ℃的烘箱內(nèi)孵化12 h,在60 ℃的烘箱內(nèi)孵化48 h。將腸黏膜組織切成冠狀切片(30 μm),載玻片用3%醋酸鈾和3%檸檬酸鉛染色15 min。在透射電子顯微鏡下觀察和拍攝腸黏膜組織的超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié) 果

2.1 腸組織中ZO-1、Occludin mRNA表達(dá)比較 模型組大鼠腸黏膜組織中ZO-1、Occludin mRNA基因表達(dá)對比假手術(shù)組均顯著降低(P<0.05)。TFL各劑量組大鼠腸黏膜組織中ZO-1、Occludin mRNA基因表達(dá)對比模型組均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 腸組織中ZO-1、Occludin mRNA表達(dá)水平

2.2 腸組織中ZO-1、Occludin 蛋白水平比較 模型組大鼠腸黏膜組織中ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)對比假手術(shù)組均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。TFL各劑量組大鼠腸黏膜組織中ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)對比模型組均顯著升高(P<0.05,P<0.01) (圖1)。

圖1 腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)水平

2.3 腸黏膜組織光學(xué)顯微鏡下觀察 見圖2。假手術(shù)組：腸組織結(jié)構(gòu)及黏膜絨毛無萎縮、無變形、無破壞,排列正常,未見淋巴及中性粒細(xì)胞聚集,黏膜組織見血管無損傷;模型組：腸組織結(jié)構(gòu)及黏膜絨毛嚴(yán)重受損,絨毛排列不規(guī)則,明顯變形,腸黏膜上皮明顯腫脹,同時(shí)可見固有層明顯分離,伴基底層破裂壞死,黏膜組織間可見大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤;TFL低劑量組及高劑量組：腸黏膜上皮組織及絨毛中度受損,黏膜上皮輕度水腫,輕微出血,固有層無分離,輕微腫脹,絨毛結(jié)構(gòu)基本完整,無明顯出血壞死,可見少許的淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞聚集。

圖2 各組腸黏膜組織病理形態(tài)(HE染色,×400)

2.4 腸黏膜組織透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察 見圖3。假手術(shù)組：微絨毛無變形,橋粒完整,絨毛細(xì)胞無水腫,線粒體清晰;模型組：微絨毛減少變形,橋粒不完整絨毛細(xì)胞水腫更明顯,線粒體水腫和空泡改變,腸上皮細(xì)胞間隙明顯變寬,腸細(xì)胞間連接復(fù)合體變短變寬;TFL低劑量組及高劑量組：微絨毛密集且規(guī)則,腸細(xì)胞間呈鋸齒狀和互鎖模式,線粒體清晰。

圖3 各組腸黏膜組織透射電鏡超微結(jié)構(gòu)(醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,×16000)

3 討 論

腸黏膜屏障是指分隔腸腔內(nèi)物質(zhì),防止致病性抗原,如細(xì)菌和內(nèi)毒素向腸腔外組織、重要臟器和血循環(huán)移位的結(jié)構(gòu)和功能的總和[8],具有抵御外來有害物質(zhì)對機(jī)體的侵襲作用[9]。腸道黏膜屏障可分為四個(gè)部分：機(jī)械、化學(xué)、免疫和生物屏障[10-11],其中發(fā)揮最關(guān)鍵作用的是腸道上皮細(xì)胞構(gòu)成的機(jī)械屏障,腸道上皮細(xì)胞之間主要通過Occludin和ZO-1將蛋白質(zhì)緊密地連接在一起,形成一個(gè)完整的生物屏障。Occludin是緊密連接結(jié)構(gòu)中的一種重要結(jié)構(gòu)跨膜蛋白,對于維持細(xì)胞間緊密聯(lián)系以及腸道通透性發(fā)揮重要作用。ZO-1蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜表面,屬于胞質(zhì)蛋白,與骨架結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)的其他蛋白,主要是介導(dǎo)緊密連接的開合作用,起著細(xì)胞間緊密連接的樞紐作用。因此,Occludin和ZO-1緊密連接蛋白在腸屏障功能的調(diào)節(jié)方面有重要的作用。

膿毒癥是機(jī)體對炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的器官功能損傷為主要表現(xiàn)的一種臨床綜合征,以臟腑功能紊亂和臟器損害為主要表現(xiàn),病死率逐年升高[12-13]。隨著病情進(jìn)展,可出現(xiàn)肺、肝腎、循環(huán)、胃腸道等多個(gè)臟器引起MODS[14]。在膿毒癥的發(fā)生機(jī)制中,腸道作為人體最大的細(xì)菌和內(nèi)毒素的貯藏部位,是膿毒癥最早侵犯且影響最嚴(yán)重的器官之一,起著重要的作用[15]。研究證實(shí),膿毒癥腸道的通透性的增加和菌群移位與腸黏膜組織中ZO-1、Occludin蛋白降低密切相關(guān)[16-17]。在多種炎癥和病理狀態(tài)環(huán)境中,腸道黏膜緊密連接蛋白在受到炎癥介質(zhì)[18]的刺激下,會導(dǎo)致其黏膜完整性受到損壞,進(jìn)而出現(xiàn)通透性增強(qiáng),腸黏膜屏障功能受損[19-20],導(dǎo)致菌群移位,血漿內(nèi)毒素增加等,最終表現(xiàn)為腸道黏膜組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)異常。腸黏膜屏障的破壞,一方面可使經(jīng)細(xì)胞途徑的腸腔內(nèi)抗原和細(xì)菌通過增加;另一方面使流經(jīng)門脈系統(tǒng)和腸系膜淋巴系統(tǒng)的大量細(xì)菌、內(nèi)毒素、抗體等炎性介質(zhì)增加,最終引起活化炎癥級聯(lián)反應(yīng),激活獲得性免疫系統(tǒng),引起免疫反應(yīng)和組織損傷[21],加重腸屏障功能障礙。因此,腸黏膜屏障功能對膿毒癥的發(fā)展及預(yù)后起著關(guān)鍵作用[22]。本研究顯示通過CLP建立的膿毒癥腸屏障損傷動物模型,在膿毒癥發(fā)生時(shí),腸黏膜組織中Occludin、ZO-1 mRNA基因水平及蛋白表達(dá)均顯著下調(diào),提示腸黏膜緊密連接在炎性刺激下緊密連接蛋白被破壞,導(dǎo)致腸壁通透性增高,黏膜屏障受損,這與過去的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符合[23]。

通腑理肺湯是基于“肺與大腸相表里”理論基礎(chǔ),在國醫(yī)大師劉尚義學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下創(chuàng)立,全方由大黃、芒硝、連翹、黃芩、杏仁、厚樸、白及和三七組成,具有通腑泄?jié)?、清熱宣肺、化瘀解毒的功效。針對膿毒癥腸屏障損傷“邪毒壅盛、熱結(jié)腸腑”的病理特點(diǎn),采用“肺腸合治”[24]的治法,在前期及既往的臨床試驗(yàn)中顯示對膿毒癥胃腸功能障礙患者有良好的保護(hù)作用[6,25],但是通腑理肺湯對于腸屏障功能的改善作用尚不清楚。故本實(shí)驗(yàn)建立膿毒癥腸黏膜損傷大鼠模型,從基因、蛋白水平以及腸道黏膜病理組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)方面,對通腑理肺湯干預(yù)膿毒癥腸黏膜屏障進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥發(fā)生時(shí)Occludin、ZO-1 mRNA基因水平及蛋白表達(dá)量均降低,模型組尤為明顯,提示緊密連接蛋白受損,腸黏膜屏障破壞。給予通腑理肺湯治療后,治療組大鼠腸組織中ZO-1、Occludin mRNA基因水平及蛋白表達(dá)水平顯著上升,提示該組方對于ZO-1、Occludin兩種蛋白的修復(fù)具有很好的效果;同時(shí)腸黏膜光鏡下病理組織學(xué)顯示,治療組腸黏膜上皮細(xì)胞水腫、腸黏膜絨毛受損、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤明顯減輕;電鏡下超微結(jié)構(gòu)顯示腸細(xì)胞間呈鋸齒狀和互鎖模式,線粒體清晰,緊密連接輕微受損。因此,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),通腑理肺湯能夠減輕膿毒癥造成的腸屏障病理損害,改善腸屏障功能,可能是通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá),改善腸組織緊密連接作用實(shí)現(xiàn)。